Долгосрочная визуализация идентифицированных нейронных популяций с использованием микропризм у свободно движущихся животных и животных с фиксированной головой

Резюме

При интеграции с головной пластиной и оптической конструкцией, совместимой как с однофотонными, так и с двухфотонными микроскопами, микропризменная линза представляет собой значительное преимущество при измерении нейронных реакций в вертикальной колонке в различных условиях, включая хорошо контролируемые эксперименты в состояниях, зафиксированных головой, или естественные поведенческие задачи у свободно движущихся животных.

Аннотация

С развитием многофотонной микроскопии и молекулярных технологий флуоресцентная визуализация быстро развивается и становится мощным подходом к изучению структуры, функций и пластичности живых тканей мозга. По сравнению с традиционной электрофизиологией, флуоресцентная микроскопия может фиксировать нейронную активность, а также морфологию клеток, что позволяет проводить долгосрочные записи идентифицированных популяций нейронов с одноклеточным или субклеточным разрешением. Тем не менее, визуализация с высоким разрешением, как правило, требует стабильной установки с фиксированной головой, которая ограничивает движения животного, а подготовка плоской поверхности из прозрачного стекла позволяет визуализировать нейроны в одной или нескольких горизонтальных плоскостях, но ограничена в изучении вертикальных процессов, протекающих на разных глубинах. Здесь мы опишем процедуру, сочетающую фиксацию головной пластины и микропризму, которая дает многослойную и мультимодальную визуализацию. Этот хирургический препарат не только дает доступ ко всему столбу зрительной коры головного мозга мыши, но и позволяет получать двухфотонную визуализацию в фиксированном положении головы и однофотонную визуализацию в свободно движущейся парадигме. Используя этот подход, можно отбирать идентифицированные популяции клеток в различных слоях коры, регистрировать их реакцию в свободно движущихся состояниях и отслеживать долгосрочные изменения в течение нескольких месяцев. Таким образом, этот метод обеспечивает всесторонний анализ микросхем, позволяя напрямую сравнивать нейронную активность, вызванную хорошо контролируемыми стимулами, и в рамках естественной поведенческой парадигмы.

Введение

Появление in vivo двухфотонной флуоресцентной визуализации ^1,2, сочетающей в себе новые технологии оптических систем и генетически модифицированных индикаторов флуоресценции, стало мощным методом в нейробиологии для исследования сложной структуры, функций и пластичности живого мозга ^3,4. В частности, этот метод визуализации дает беспрецедентное преимущество перед традиционной электрофизиологией, фиксируя как морфологию, так и динамическую активность нейронов, тем самым облегчая долгосрочное отслеживание идентифицированных нейронов

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года на основании персональных и проектных лицензий, одобренных и выданных Министерством внутренних дел Великобритании после соответствующей этической экспертизы. Взрослые трансгенные линии CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE²¹ были выведены, а их потомство использовано в эксперименте. Для безопасности экспериментаторов и поддержания стерильных условий все процедуры проводились в асептических условиях и с использованием полных средств индивидуальной защиты.

1. Предоперационная подготовка

1. Для минимиз....

Результаты

Показан метод проведения хронической многослойной in vivo кальциевой визуализации одной и той же популяции нейронов в течение нескольких недель с использованием как одно-, так и двухфотонной модальностей визуализации в свободно движущихся и фиксированных на голове условиях. Здесь ?.......

Обсуждение

Здесь мы показали способность наблюдать и напрямую сравнивать нейроны в условиях фиксированной головы и свободно движущихся в одних и тех же нейронных популяциях. Несмотря на то, что мы продемонстрировали применение в зрительной коре, этот протокол может быть адаптирован к множеству ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment