自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

要約

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。

要約

多光子顕微鏡と分子技術の進歩により、蛍光イメージングは急速に成長し、生きた脳組織の構造、機能、可塑性を研究するための強力なアプローチとなっています。従来の電気生理学と比較して、蛍光顕微鏡法は細胞の形態だけでなく神経活動も捉えることができ、同定されたニューロン集団を単一細胞または細胞内の分解能で長期間記録することができます。しかし、高解像度のイメージングには、通常、動物の動きを制限する安定した頭部固定セットアップが必要であり、透明なガラスの平らな表面を調製することで、1つ以上の水平面でニューロンを視覚化できますが、異なる深さを横断する垂直プロセスの研究には制限があります。ここでは、ヘッドプレート固定とマイクロプリズムを組み合わせて、多層およびマルチモーダルイメージングを行う手順について説明します。この外科的準備により、マウスの視覚野の柱全体にアクセスできるだけでなく、頭部固定位置での2光子イメージングと、自由に動くパラダイムでの1光子イメージングが可能になります。このアプローチを用いることで、異なる皮質層で同定された細胞集団をサンプリングし、頭を固定した状態で自由に動く状態での反応を記録し、数ヶ月にわたる長期的な変化を追跡することができます。したがって、この方法は、マイクロ回路の包括的なアッセイを提供し、適切に制御された刺激によって誘発された神経活動と自然な行動パラダイムの下での神経活動の直接比較を可能にします。

概要

光学系の新技術と遺伝子改変蛍光インジケーターを組み合わせたin vivo二光子蛍光イメージング^1,2の出現は、生きた脳の複雑な構造、機能、可塑性を研究するための神経科学における強力な技術として浮上しています^3,4。.特に、このイメージングモダリティは、ニューロンの形態と動的活動の両方を捉えることにより、従来の電気生理学に比べて比類のない利点を提供し、それによって特定されたニューロンの長期的な追跡を容易にします^5,6,7,8。

その注目すべき長所にもかかわらず、高解像度蛍光イメージングの適用は、動物の運動性を制限する静的な頭部固定セットアップを必要とすることがよくあります^9,10,11。さらに、ニューロンを可視化する....

プロトコル

すべての実験は、1986年英国動物(科学的手順)法(UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986)に基づき、適切な倫理審査を経て英国内務省が承認・発行した個人ライセンスおよびプロジェクトライセンスの下で実施されました。成人トランスジェニック株CaMKII-TTA;GCaMP6S-TRE²¹ を育種し、その子孫を実験に用いた。実験者の安全と無菌状態の維持のために、すべての手順は無菌条件下で、完全な個人用保護具を使用して行われました。

1.術前の準備

1. 浮腫を最小限に抑えるために、手術の12〜24時間前にデキサメタゾン(0.2 mg / kg)を皮下投与します。.
2. すべての手術器具をオートクレーブで滅菌し、手術前に蒸留水と70%エタノールで安定化次亜塩素酸で手術部位を滅菌します。すべての手術器具がオンになっていることを確認します。
3. 動物(24週齢、体重31 gの男性)にイソフルランを使用して麻酔をかけ、マウスを脳定位固定装置フレームに乗せると1%〜2%に減少し、O₂ は1〜2 L / minに保たれます。NSAIDs(カルプロフェン、2.5 mg / kg)を皮下に注射します。.
4. つま先つまみ反射がないことを確認して、麻酔の深さを評価します(反射が見られる場合....

ディスカッション

本研究では、同じ神経集団において、頭部固定状態と自由に動く状態の神経細胞を観察し、直接比較できることを示しました。視覚野での応用を実証しましたが、このプロトコルは、皮質領域と深部核24,25,26,27,28、およびその他のデータ収集および行動セットアップ

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment