A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتيح البروتوكول المقدم هنا تحديد وتحليل الأبعاد العالية للخلايا الجذعية والسلفية العضلية عن طريق قياس الكتلة الخلوية أحادية الخلية وتنقيتها بواسطة FACS لإجراء دراسات متعمقة لوظيفتها. يمكن تطبيق هذا النهج لدراسة ديناميكيات التجديد في نماذج المرض واختبار فعالية التدخلات الدوائية.

Abstract

تجديد العضلات الهيكلية هو عملية ديناميكية تقودها الخلايا الجذعية العضلية البالغة وذريتها. غالبا ما تكون الخلايا الجذعية العضلية البالغة هادئة في حالة مستقرة ، ويتم تنشيطها عند إصابة العضلات. بعد التنشيط ، تتكاثر ، وتتمايز معظم ذريتها لتوليد خلايا عضلية ذات كفاءة اندماجية بينما يتجدد الباقي ذاتيا لتجديد تجمع الخلايا الجذعية. في حين تم تحديد هوية الخلايا الجذعية العضلية منذ أكثر من عقد من الزمان ، بناء على التعبير المشترك لعلامات سطح الخلية ، لم يتم تحديد السلف العضلي إلا مؤخرا باستخدام مناهج أحادية الخلية عالية الأبعاد. هنا ، نقدم طريقة قياس الكتلة الخلوية أحادية الخلية (قياس الخلايا حسب وقت الرحلة [CyTOF]) لتحليل الخلايا الجذعية والخلايا السلفية في إصابة العضلات الحادة لحل الديناميات الخلوية والجزيئية التي تتكشف أثناء تجديد العضلات. يعتمد هذا النهج على الكشف المتزامن عن علامات سطح الخلية الجديدة وعوامل النسخ العضلية الرئيسية التي يتيح تعبيرها الديناميكي تحديد الخلايا الجذعية المنشطة ومجموعات الخلايا السلفية التي تمثل معالم تكوين العضلات. الأهم من ذلك ، تم وصف استراتيجية فرز تعتمد على اكتشاف علامات سطح الخلية CD9 و CD104 ، مما يتيح العزل المحتمل للخلايا الجذعية العضلية والخلايا السلفية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لإجراء دراسات متعمقة لوظيفتها. توفر الخلايا السلفية العضلية حلقة مفقودة مهمة لدراسة التحكم في مصير الخلايا الجذعية العضلية ، وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة لأمراض العضلات ، وتطوير تطبيقات العلاج الخلوي للطب التجديدي. يمكن تطبيق النهج المقدم هنا لدراسة الخلايا الجذعية العضلية والخلايا السلفية في الجسم الحي استجابة للاضطرابات ، مثل التدخلات الدوائية التي تستهدف مسارات إشارات محددة. يمكن استخدامه أيضا للتحقيق في ديناميكيات الخلايا الجذعية العضلية والخلايا السلفية في النماذج الحيوانية لأمراض العضلات ، مما يعزز فهمنا لأمراض الخلايا الجذعية ويسرع تطوير العلاجات.

Introduction

تشكل العضلات الهيكلية أكبر نسيج من حيث الكتلة في الجسم وتنظم وظائف متعددة ، من البصر إلى التنفس ، ومن الموقف إلى الحركة ، وكذلك التمثيل الغذائي1. لذلك ، فإن الحفاظ على سلامة العضلات الهيكلية ووظيفتها أمر بالغ الأهمية للصحة. الأنسجة العضلية الهيكلية ، التي تتكون من حزم معبأة بإحكام من الألياف العضلية متعددة النوى محاطة بشبكة معقدة من الأعصاب والأوعية الدموية ، تظهر إمكانات تجديد ملحوظة 1,2.

الدوافع الرئيسية لتجديد العضلات الهيكلية هي الخلايا الجذعية للعضلات البالغة (MuSCs). تعرف أيضا باسم الخلايا الساتلية ، نظرا لموقعها التشري....

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل مفتشية التجارب الحيوانية الدنماركية (البروتوكول # 2022-15-0201-01293) ، وتم إجراء التجارب وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة آرهوس. يتم توفير التسكين (البوبرينورفين) في مياه الشرب قبل 24 ساعة من الإصابة للفئران للتكيف مع الذوق. يستمر توفير البوبرينورفين في مياه الشرب لمدة 24 ساعة بعد الإصابة. جنبا إلى جنب مع حقن تحت الجلد (s.c.) من البوبرينورفين في وقت إصابة العضلات الحادة ، البوبرينورفين في مياه الشرب بعد حقن notexin سوف يخفف الألم المرتبط بالإصابة. في حين أنه يوصى بإعطاء حقن s.c. من البوبرينورفين في وقت إصابة العضلات الحادة ، تليها البوبرينورفين في مياه الشرب ، البوبرينورفين في مياه الشرب قبل ....

النتائج

نقدم هنا نظرة عامة على الإعداد التجريبي لاستخدام هذا النهج المشترك الذي يتضمن (i) تحليل CyTOF عالي الأبعاد لدورة وقت الإصابة الحادة عن طريق حقن notexin لدراسة الديناميات الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية والسلفية في العضلات الهيكلية (الشكل 1 ، المخطط العلوي) ؛ .......

Discussion

تجديد العضلات الهيكلية هو عملية ديناميكية تعتمد على وظيفة الخلايا الجذعية البالغة. بينما ركزت الدراسات السابقة على دور الخلايا الجذعية العضلية أثناء التجدد ، لم تتم دراسة ذريتها في الجسم الحي ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص الأدوات لتحديد وعزل مجموعات الخلايا?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونشكر أعضاء المرفق الأساسي لنظام مراقبة الأصول الميدانية في قسم الطب الحيوي في جامعة آرهوس على الدعم التقني. نشكر ألكسندر شميتز ، مدير وحدة قياس الكتلة الخلوية في قسم الطب الحيوي ، على المناقشة والدعم. تم إنشاء الرسوم التوضيحية العلمية باستخدام Biorender.com. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء جامعة آرهوس فورسكينغسفوند (AUFF) ومنحة حزمة البداية (0071113) من مؤسسة نوفو نورديسك إلى E.P.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; In-house conjugated
MyoD (Clone: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; In-house conjugated
MyoG (Clone: F5D)BD Biosciences556358Gd160; In-house conjugated
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C
Nutrient mixture F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Clone: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Clone: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; In-house conjugated
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
PES Filter Units 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES Syringe FilterFisher Scientific15206869
Petri dishSarstedt82.1472.001
PFA 16% EM gradeMP Biomedicals219998320
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific10375810
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (Clone: J112-906)Standard Biotools3166011AEr166
pS6 kinase (Clone: N7-548)Standard Biotools3172008AYb172
Sca-1 (Clone: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; In-house conjugated
Sodium AzideSigma AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific10553515
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterile saline solution 0.9%FreseniusB306414/02
α7 integrin (Clone: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; In-house conjugated

References

  1. Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
  2. Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CyTOF FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved