A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يتيح البروتوكول المقدم هنا تحديد وتحليل الأبعاد العالية للخلايا الجذعية والسلفية العضلية عن طريق قياس الكتلة الخلوية أحادية الخلية وتنقيتها بواسطة FACS لإجراء دراسات متعمقة لوظيفتها. يمكن تطبيق هذا النهج لدراسة ديناميكيات التجديد في نماذج المرض واختبار فعالية التدخلات الدوائية.
تجديد العضلات الهيكلية هو عملية ديناميكية تقودها الخلايا الجذعية العضلية البالغة وذريتها. غالبا ما تكون الخلايا الجذعية العضلية البالغة هادئة في حالة مستقرة ، ويتم تنشيطها عند إصابة العضلات. بعد التنشيط ، تتكاثر ، وتتمايز معظم ذريتها لتوليد خلايا عضلية ذات كفاءة اندماجية بينما يتجدد الباقي ذاتيا لتجديد تجمع الخلايا الجذعية. في حين تم تحديد هوية الخلايا الجذعية العضلية منذ أكثر من عقد من الزمان ، بناء على التعبير المشترك لعلامات سطح الخلية ، لم يتم تحديد السلف العضلي إلا مؤخرا باستخدام مناهج أحادية الخلية عالية الأبعاد. هنا ، نقدم طريقة قياس الكتلة الخلوية أحادية الخلية (قياس الخلايا حسب وقت الرحلة [CyTOF]) لتحليل الخلايا الجذعية والخلايا السلفية في إصابة العضلات الحادة لحل الديناميات الخلوية والجزيئية التي تتكشف أثناء تجديد العضلات. يعتمد هذا النهج على الكشف المتزامن عن علامات سطح الخلية الجديدة وعوامل النسخ العضلية الرئيسية التي يتيح تعبيرها الديناميكي تحديد الخلايا الجذعية المنشطة ومجموعات الخلايا السلفية التي تمثل معالم تكوين العضلات. الأهم من ذلك ، تم وصف استراتيجية فرز تعتمد على اكتشاف علامات سطح الخلية CD9 و CD104 ، مما يتيح العزل المحتمل للخلايا الجذعية العضلية والخلايا السلفية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لإجراء دراسات متعمقة لوظيفتها. توفر الخلايا السلفية العضلية حلقة مفقودة مهمة لدراسة التحكم في مصير الخلايا الجذعية العضلية ، وتحديد الأهداف العلاجية الجديدة لأمراض العضلات ، وتطوير تطبيقات العلاج الخلوي للطب التجديدي. يمكن تطبيق النهج المقدم هنا لدراسة الخلايا الجذعية العضلية والخلايا السلفية في الجسم الحي استجابة للاضطرابات ، مثل التدخلات الدوائية التي تستهدف مسارات إشارات محددة. يمكن استخدامه أيضا للتحقيق في ديناميكيات الخلايا الجذعية العضلية والخلايا السلفية في النماذج الحيوانية لأمراض العضلات ، مما يعزز فهمنا لأمراض الخلايا الجذعية ويسرع تطوير العلاجات.
تشكل العضلات الهيكلية أكبر نسيج من حيث الكتلة في الجسم وتنظم وظائف متعددة ، من البصر إلى التنفس ، ومن الموقف إلى الحركة ، وكذلك التمثيل الغذائي1. لذلك ، فإن الحفاظ على سلامة العضلات الهيكلية ووظيفتها أمر بالغ الأهمية للصحة. الأنسجة العضلية الهيكلية ، التي تتكون من حزم معبأة بإحكام من الألياف العضلية متعددة النوى محاطة بشبكة معقدة من الأعصاب والأوعية الدموية ، تظهر إمكانات تجديد ملحوظة 1,2.
الدوافع الرئيسية لتجديد العضلات الهيكلية هي الخلايا الجذعية للعضلات البالغة (MuSCs). تعرف أيضا باسم الخلايا الساتلية ، نظرا لموقعها التشري....
تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل مفتشية التجارب الحيوانية الدنماركية (البروتوكول # 2022-15-0201-01293) ، وتم إجراء التجارب وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة آرهوس. يتم توفير التسكين (البوبرينورفين) في مياه الشرب قبل 24 ساعة من الإصابة للفئران للتكيف مع الذوق. يستمر توفير البوبرينورفين في مياه الشرب لمدة 24 ساعة بعد الإصابة. جنبا إلى جنب مع حقن تحت الجلد (s.c.) من البوبرينورفين في وقت إصابة العضلات الحادة ، البوبرينورفين في مياه الشرب بعد حقن notexin سوف يخفف الألم المرتبط بالإصابة. في حين أنه يوصى بإعطاء حقن s.c. من البوبرينورفين في وقت إصابة العضلات الحادة ، تليها البوبرينورفين في مياه الشرب ، البوبرينورفين في مياه الشرب قبل ....
نقدم هنا نظرة عامة على الإعداد التجريبي لاستخدام هذا النهج المشترك الذي يتضمن (i) تحليل CyTOF عالي الأبعاد لدورة وقت الإصابة الحادة عن طريق حقن notexin لدراسة الديناميات الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية والسلفية في العضلات الهيكلية (الشكل 1 ، المخطط العلوي) ؛ .......
تجديد العضلات الهيكلية هو عملية ديناميكية تعتمد على وظيفة الخلايا الجذعية البالغة. بينما ركزت الدراسات السابقة على دور الخلايا الجذعية العضلية أثناء التجدد ، لم تتم دراسة ذريتها في الجسم الحي ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص الأدوات لتحديد وعزل مجموعات الخلايا?.......
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
ونشكر أعضاء المرفق الأساسي لنظام مراقبة الأصول الميدانية في قسم الطب الحيوي في جامعة آرهوس على الدعم التقني. نشكر ألكسندر شميتز ، مدير وحدة قياس الكتلة الخلوية في قسم الطب الحيوي ، على المناقشة والدعم. تم إنشاء الرسوم التوضيحية العلمية باستخدام Biorender.com. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء جامعة آرهوس فورسكينغسفوند (AUFF) ومنحة حزمة البداية (0071113) من مؤسسة نوفو نورديسك إلى E.P.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
IdU | Merck | I7125 | I127 |
Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved