Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan protokol, kas sapı ve progenitör hücrelerin tek hücreli kütle sitometrisi ile tanımlanmasını ve yüksek boyutlu analizini ve işlevlerinin derinlemesine incelenmesi için FACS ile saflaştırılmasını sağlar. Bu yaklaşım, hastalık modellerinde rejenerasyon dinamiklerini incelemek ve farmakolojik müdahalelerin etkinliğini test etmek için uygulanabilir.

Özet

İskelet kası rejenerasyonu, yetişkin kas kök hücreleri ve onların soyları tarafından yönlendirilen dinamik bir süreçtir. Çoğunlukla sabit bir durumda hareketsiz olan yetişkin kas kök hücreleri, kas yaralanması üzerine aktive olur. Aktivasyonu takiben çoğalırlar ve döllerinin çoğu, füzyona yetkin kas hücreleri oluşturmak için farklılaşırken, geri kalanlar kök hücre havuzunu yenilemek için kendi kendini yeniler. Kas kök hücrelerinin kimliği, hücre yüzey belirteçlerinin birlikte ekspresyonuna dayalı olarak on yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanırken, miyojenik progenitörler, yüksek boyutlu tek hücreli yaklaşımlar kullanılarak ancak son zamanlarda tanımlanmıştır. Burada, kas rejenerasyonu sırasında ortaya çıkan hücresel ve moleküler dinamikleri çözmek için akut kas hasarında kök hücreleri ve progenitör hücreleri analiz etmek için tek hücreli bir kütle sitometrisi (uçuş zamanına göre sitometri [CyTOF]) yöntemi sunuyoruz. Bu yaklaşım, dinamik ekspresyonu, miyogenezin dönüm noktalarını temsil eden aktive edilmiş kök hücrelerin ve progenitör hücre popülasyonlarının tanımlanmasını sağlayan yeni hücre yüzeyi belirteçlerinin ve anahtar miyojenik transkripsiyon faktörlerinin eşzamanlı olarak saptanmasına dayanmaktadır. Daha da önemlisi, hücre yüzeyi belirteçleri CD9 ve CD104'ü tespit etmeye dayanan bir sıralama stratejisi tanımlanmıştır ve bu da işlevlerinin derinlemesine incelenmesi için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) kullanılarak kas sapı ve progenitör hücrelerin prospektif izolasyonunu sağlar. Kas progenitör hücreleri, kas kök hücre kaderinin kontrolünü incelemek, kas hastalıkları için yeni terapötik hedefleri belirlemek ve rejeneratif tıp için hücre tedavisi uygulamaları geliştirmek için kritik bir eksik bağlantı sağlar. Burada sunulan yaklaşım, spesifik sinyal yolaklarını hedef alan farmakolojik müdahaleler gibi bozulmalara yanıt olarak kas sapı ve progenitör hücreleri in vivo olarak incelemek için uygulanabilir. Ayrıca, kas hastalıklarının hayvan modellerinde kas kökü ve progenitör hücrelerin dinamiklerini araştırmak, kök hücre hastalıkları hakkındaki anlayışımızı ilerletmek ve tedavilerin geliştirilmesini hızlandırmak için de kullanılabilir.

Giriş

İskelet kası vücutta kütlece en büyük dokuyu oluşturur ve görmeden solunuma, duruştan harekete ve metabolizmaya kadar birçok işlevi düzenler1. Bu nedenle, iskelet kası bütünlüğünü ve işlevini korumak sağlık için kritik öneme sahiptir. Karmaşık bir sinir ve kan damarı ağı ile çevrili, sıkıca paketlenmiş çok çekirdekli miyofiber demetlerinden oluşan iskelet kası dokusu, dikkate değer rejeneratif potansiyel sergiler 1,2.

İskelet kası rejenerasyonunun ana itici güçleri yetişkin kas kök hücreleridir (MuSC'ler). Uydu hücreleri olar....

Protokol

Hayvan prosedürleri Danimarka hayvan deneyleri müfettişliği tarafından onaylandı (protokol # 2022-15-0201-01293) ve deneyler Aarhus Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Analjezi (buprenorfin), farelerin tada uyum sağlaması için yaralanmadan 24 saat önce içme suyunda sağlanır. İçme suyuna buprenorfin verilmesine yaralanma sonrası 24 saat boyunca devam edilir. Akut kas yaralanması sırasında deri altı (s.c.) buprenorfin enjeksiyonu ile birlikte, noteksin enjeksiyonundan sonra içme suyundaki buprenorfin, yaralanma ile ilişkili ağrıyı hafifletecektir. Akut kas yaralanması sırasında bir s.c. buprenorfin enj....

Temsili Sonuçlar

Burada, (i) iskelet kasındaki kök ve progenitör hücrelerin hücresel ve moleküler dinamiklerini incelemek için noteksin enjeksiyonu ile akut yaralanma zaman seyrinin yüksek boyutlu CyTOF analizini içeren bu birleşik yaklaşımı kullanmak için deneysel kuruluma genel bir bakış sunuyoruz (Şekil 1, üst şema); ve (ii) bu popülasyonları izole etmek ve işlevleri hakkında derinlemesine çalışmalar yapmak için CD9 ve CD104 olmak üzere iki hü.......

Tartışmalar

İskelet kası rejenerasyonu, yetişkin kök hücrelerin işlevine dayanan dinamik bir süreçtir. Önceki çalışmalar, rejenerasyon sırasında kas kök hücrelerinin rolüne odaklanmış olsa da, bunların soyları in vivo, öncelikle bu hücre popülasyonlarını tanımlamak ve izole etmek için gerekli araçların eksikliği nedeniyle yeterince çalışılmamıştır 15,16,17,18.<.......

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Aarhus Üniversitesi Biyotıp Bölümü'ndeki FACS Çekirdek Tesisi üyelerine teknik destek için teşekkür ederiz. Biyotıp Anabilim Dalı Kitle Sitometrisi Birimi yöneticisi Alexander Schmitz'e tartışma ve destek için teşekkür ederiz. Bilimsel İllüstrasyonlar Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışma, Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) Başlangıç Hibesi ve Novo Nordisk Vakfı'ndan EP'ye bir Başlangıç Paketi hibesi (0071113) ile finanse edilmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; In-house conjugated
MyoD (Clone: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; In-house conjugated
MyoG (Clone: F5D)BD Biosciences556358Gd160; In-house conjugated
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C
Nutrient mixture F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Clone: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Clone: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; In-house conjugated
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
PES Filter Units 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES Syringe FilterFisher Scientific15206869
Petri dishSarstedt82.1472.001
PFA 16% EM gradeMP Biomedicals219998320
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific10375810
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (Clone: J112-906)Standard Biotools3166011AEr166
pS6 kinase (Clone: N7-548)Standard Biotools3172008AYb172
Sca-1 (Clone: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; In-house conjugated
Sodium AzideSigma AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific10553515
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterile saline solution 0.9%FreseniusB306414/02
α7 integrin (Clone: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; In-house conjugated

Referanslar

  1. Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
  2. Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler skelet Kas RejenerasyonuKas K k H creleriKas Progenit rleriTek H creli K tle SitometrisiCyTOFFACSKas HasarMiyojenezH cre Y zey Belirte leriTranskripsiyon Fakt rleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır