A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר זיהוי וניתוח ממדי גבוה של תאי גזע שריר ותאי אב על ידי ציטומטריית מסה של תא בודד וטיהורם על ידי FACS לצורך מחקרים מעמיקים של תפקודם. גישה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור דינמיקה התחדשות במודלים של מחלות ולבדוק את היעילות של התערבויות פרמקולוגיות.

Abstract

התחדשות שרירי השלד היא תהליך דינמי המונע על ידי תאי גזע שריריים בוגרים וצאצאיהם. לרוב רגועים במצב יציב, תאי גזע שריריים בוגרים מופעלים עם פציעת שריר. לאחר ההפעלה, הם מתרבים, ורוב צאצאיהם מתמיינים ליצירת תאי שריר בעלי יכולת היתוך בעוד ששאר הצאצאים מתחדשים בעצמם כדי לחדש את מאגר תאי הגזע. בעוד שזהותם של תאי גזע שריריים הוגדרה לפני יותר מעשור, בהתבסס על ביטוי משותף של סמנים על פני התא, אבות מיוגניים זוהו רק לאחרונה באמצעות גישות חד-תאיות חד-ממדיות גבוהות. כאן, אנו מציגים שיטת ציטומטריה של מסה חד-תאית (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) לניתוח תאי גזע ותאי אב בפגיעה חריפה בשריר כדי לפתור את הדינמיקה התאית והמולקולרית המתפתחת במהלך התחדשות השריר. גישה זו מבוססת על זיהוי סימולטני של סמנים חדשים בפני השטח של התא וגורמי שעתוק מיוגניים מרכזיים שהביטוי הדינמי שלהם מאפשר זיהוי של תאי גזע פעילים ואוכלוסיות תאי אב המייצגים ציוני דרך של מיוגנזה. חשוב לציין כי מתוארת אסטרטגיית מיון המבוססת על זיהוי סמני פני התא CD9 ו- CD104, המאפשרת בידוד פרוספקטיבי של תאי גזע שריר ותאי אב באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) למחקרים מעמיקים של תפקודם. תאי אב שריריים מספקים חוליה חסרה קריטית לחקר השליטה בגורל תאי גזע שריריים, זיהוי מטרות טיפוליות חדשות למחלות שריר ופיתוח יישומי תרפיה תאית לרפואה רגנרטיבית. הגישה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת לחקר תאי גזע שריר ותאי אב in vivo בתגובה להפרעות, כגון התערבויות פרמקולוגיות המכוונות למסלולי איתות ספציפיים. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הדינמיקה של גזע שריר ותאי אב במודלים של בעלי חיים של מחלות שריר, לקדם את ההבנה שלנו של מחלות תאי גזע ולהאיץ את הפיתוח של טיפולים.

Introduction

שרירי השלד מהווים את הרקמה הגדולה ביותר מבחינת מסה בגוף ומווסתים תפקודים רבים, מראייה לנשימה, מיציבה לתנועה, כמו גם חילוף חומרים1. לכן, שמירה על שלמות שרירי השלד ותפקודם היא קריטית לבריאות. רקמת שריר השלד, המורכבת מצרורות צפופים של שרירי מיופייבר מרובי גרעינים המוקפים ברשת מורכבת של עצבים וכלי דם, מציגה פוטנציאל התחדשות יוצא דופן 1,2.

הגורמים העיקריים להתחדשות שרירי השלד הם תאי גזע שריריים בוגרים (MuSCs). ידועים גם בשם תאי לוויין, בשל מיקומם האנטומי הייחודי בסמוך לקרום הפלזמה של המיופייבר ומתחת ללמינה הבסיסית, הם זוהו לראשונה....

Protocol

נהלי בעלי חיים אושרו על ידי הפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים (פרוטוקול # 2022-15-0201-01293), והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת ארהוס. שיכוך כאבים (buprenorphine) מסופק במי שתייה 24 שעות לפני הפציעה עבור העכברים להסתגל לטעם. אספקת buprenorphine במי שתייה נמשכת במשך 24 שעות לאחר הפציעה. יחד עם הזרקה תת עורית (s.c.) של buprenorphine בזמן פגיעה שריר חריפה, buprenorphine במי השתייה לאחר הזרקת notexin יקל על הכאב הקשור לפציעה. אמנם מומלץ לתת זריקה s.c. של buprenorphine בזמן פגיעה שריר חריפה, ואחריו buprenorphine במי השתייה, buprenorphine במי השתייה לפני הפציעה הוא אופציונלי. עם זאת, על החוקרים לפעול בהתאם לסטנדרטים ולהנ....

תוצאות

כאן אנו מציגים סקירה כללית של מערך הניסוי לשימוש בגישה משולבת זו, הכוללת (i) ניתוח CyTOF בממדים גבוהים של מסלול זמן פציעה חריפה באמצעות הזרקת נוטקסין לחקר הדינמיקה התאית והמולקולרית של תאי גזע ותאי אב בשרירי השלד (איור 1, סכימה עליונה); ו-(ii) FACS של תאי גזע ותאי א.......

Discussion

התחדשות שרירי השלד היא תהליך דינמי המסתמך על תפקודם של תאי גזע בוגרים. בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בתפקידם של תאי גזע שריריים במהלך התחדשות, צאצאיהם in vivo לא נחקרו מספיק, בעיקר בשל מחסור בכלים לזהות ולבודד אוכלוסיות תאים אלה 15,16,17,18.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מתקן הליבה של FACS במחלקה לביו-רפואה באוניברסיטת Aarhus על התמיכה הטכנית. אנו מודים לאלכסנדר שמיץ, מנהל היחידה לציטומטריית מסה במחלקה לביו-רפואה, על הדיון והתמיכה. איורים מדעיים נוצרו באמצעות Biorender.com. עבודה זו מומנה על ידי מענק התחלה של Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) ומענק חבילת התחלה (0071113) מקרן נובו נורדיסק ל- E.P.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; In-house conjugated
MyoD (Clone: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; In-house conjugated
MyoG (Clone: F5D)BD Biosciences556358Gd160; In-house conjugated
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C
Nutrient mixture F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Clone: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Clone: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; In-house conjugated
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
PES Filter Units 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES Syringe FilterFisher Scientific15206869
Petri dishSarstedt82.1472.001
PFA 16% EM gradeMP Biomedicals219998320
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific10375810
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (Clone: J112-906)Standard Biotools3166011AEr166
pS6 kinase (Clone: N7-548)Standard Biotools3172008AYb172
Sca-1 (Clone: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; In-house conjugated
Sodium AzideSigma AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific10553515
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterile saline solution 0.9%FreseniusB306414/02
α7 integrin (Clone: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; In-house conjugated

References

  1. Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
  2. Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CyTOFFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved