A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
זיהוי וניתוח של אבות מיוגניים in vivo במהלך פגיעה חריפה בשרירי השלד על ידי ציטומטריית מסה חד-תאית חד-ממדית גבוהה
In This Article
Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר זיהוי וניתוח ממדי גבוה של תאי גזע שריר ותאי אב על ידי ציטומטריית מסה של תא בודד וטיהורם על ידי FACS לצורך מחקרים מעמיקים של תפקודם. גישה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור דינמיקה התחדשות במודלים של מחלות ולבדוק את היעילות של התערבויות פרמקולוגיות.
Abstract
התחדשות שרירי השלד היא תהליך דינמי המונע על ידי תאי גזע שריריים בוגרים וצאצאיהם. לרוב רגועים במצב יציב, תאי גזע שריריים בוגרים מופעלים עם פציעת שריר. לאחר ההפעלה, הם מתרבים, ורוב צאצאיהם מתמיינים ליצירת תאי שריר בעלי יכולת היתוך בעוד ששאר הצאצאים מתחדשים בעצמם כדי לחדש את מאגר תאי הגזע. בעוד שזהותם של תאי גזע שריריים הוגדרה לפני יותר מעשור, בהתבסס על ביטוי משותף של סמנים על פני התא, אבות מיוגניים זוהו רק לאחרונה באמצעות גישות חד-תאיות חד-ממדיות גבוהות. כאן, אנו מציגים שיטת ציטומטריה של מסה חד-תאית (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) לניתוח תאי גזע ותאי אב בפגיעה חריפה בשריר כדי לפתור את הדינמיקה התאית והמולקולרית המתפתחת במהלך התחדשות השריר. גישה זו מבוססת על זיהוי סימולטני של סמנים חדשים בפני השטח של התא וגורמי שעתוק מיוגניים מרכזיים שהביטוי הדינמי שלהם מאפשר זיהוי של תאי גזע פעילים ואוכלוסיות תאי אב המייצגים ציוני דרך של מיוגנזה. חשוב לציין כי מתוארת אסטרטגיית מיון המבוססת על זיהוי סמני פני התא CD9 ו- CD104, המאפשרת בידוד פרוספקטיבי של תאי גזע שריר ותאי אב באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) למחקרים מעמיקים של תפקודם. תאי אב שריריים מספקים חוליה חסרה קריטית לחקר השליטה בגורל תאי גזע שריריים, זיהוי מטרות טיפוליות חדשות למחלות שריר ופיתוח יישומי תרפיה תאית לרפואה רגנרטיבית. הגישה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת לחקר תאי גזע שריר ותאי אב in vivo בתגובה להפרעות, כגון התערבויות פרמקולוגיות המכוונות למסלולי איתות ספציפיים. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הדינמיקה של גזע שריר ותאי אב במודלים של בעלי חיים של מחלות שריר, לקדם את ההבנה שלנו של מחלות תאי גזע ולהאיץ את הפיתוח של טיפולים.
Introduction
שרירי השלד מהווים את הרקמה הגדולה ביותר מבחינת מסה בגוף ומווסתים תפקודים רבים, מראייה לנשימה, מיציבה לתנועה, כמו גם חילוף חומרים1. לכן, שמירה על שלמות שרירי השלד ותפקודם היא קריטית לבריאות. רקמת שריר השלד, המורכבת מצרורות צפופים של שרירי מיופייבר מרובי גרעינים המוקפים ברשת מורכבת של עצבים וכלי דם, מציגה פוטנציאל התחדשות יוצא דופן 1,2.
הגורמים העיקריים להתחדשות שרירי השלד הם תאי גזע שריריים בוגרים (MuSCs). ידועים גם בשם תאי לוויין, בשל מיקומם האנטומי הייחודי בסמוך לקרום הפלזמה של המיופייבר ומתחת ללמינה הבסיסית, הם זוהו לראשונה....
Protocol
נהלי בעלי חיים אושרו על ידי הפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים (פרוטוקול # 2022-15-0201-01293), והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת ארהוס. שיכוך כאבים (buprenorphine) מסופק במי שתייה 24 שעות לפני הפציעה עבור העכברים להסתגל לטעם. אספקת buprenorphine במי שתייה נמשכת במשך 24 שעות לאחר הפציעה. יחד עם הזרקה תת עורית (s.c.) של buprenorphine בזמן פגיעה שריר חריפה, buprenorphine במי השתייה לאחר הזרקת notexin יקל על הכאב הקשור לפציעה. אמנם מומלץ לתת זריקה s.c. של buprenorphine בזמן פגיעה שריר חריפה, ואחריו buprenorphine במי השתייה, buprenorphine במי השתייה לפני הפציעה הוא אופציונלי. עם זאת, על החוקרים לפעול בהתאם לסטנדרטים ולהנ....
תוצאות
כאן אנו מציגים סקירה כללית של מערך הניסוי לשימוש בגישה משולבת זו, הכוללת (i) ניתוח CyTOF בממדים גבוהים של מסלול זמן פציעה חריפה באמצעות הזרקת נוטקסין לחקר הדינמיקה התאית והמולקולרית של תאי גזע ותאי אב בשרירי השלד (איור 1, סכימה עליונה); ו-(ii) FACS של תאי גזע ותאי א.......
Discussion
התחדשות שרירי השלד היא תהליך דינמי המסתמך על תפקודם של תאי גזע בוגרים. בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בתפקידם של תאי גזע שריריים במהלך התחדשות, צאצאיהם in vivo לא נחקרו מספיק, בעיקר בשל מחסור בכלים לזהות ולבודד אוכלוסיות תאים אלה 15,16,17,18.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מתקן הליבה של FACS במחלקה לביו-רפואה באוניברסיטת Aarhus על התמיכה הטכנית. אנו מודים לאלכסנדר שמיץ, מנהל היחידה לציטומטריית מסה במחלקה לביו-רפואה, על הדיון והתמיכה. איורים מדעיים נוצרו באמצעות Biorender.com. עבודה זו מומנה על ידי מענק התחלה של Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) ומענק חבילת התחלה (0071113) מקרן נובו נורדיסק ל- E.P.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
References
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved