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Identificación y análisis de progenitores miogénicos in vivo durante la lesión aguda del músculo esquelético mediante citometría de masa unicelular de alta dimensión
En este artículo
Resumen
El protocolo aquí presentado permite la identificación y el análisis de alta dimensión de células madre y progenitoras musculares mediante citometría de masas unicelulares y su purificación por FACS para estudios en profundidad de su función. Este enfoque se puede aplicar para estudiar la dinámica de regeneración en modelos de enfermedad y probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas.
Resumen
La regeneración del músculo esquelético es un proceso dinámico impulsado por las células madre musculares adultas y su progenie. En su mayoría inactivas en un estado estacionario, las células madre musculares adultas se activan tras una lesión muscular. Después de la activación, proliferan, y la mayoría de su progenie se diferencia para generar células musculares competentes para la fusión, mientras que el resto se renueva para reponer la reserva de células madre. Si bien la identidad de las células madre musculares se definió hace más de una década, sobre la base de la coexpresión de marcadores de superficie celular, los progenitores miogénicos se identificaron solo recientemente utilizando enfoques unicelulares de alta dimensión. Aquí, presentamos un método de citometría de masa unicelular (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para analizar células madre y células progenitoras en lesiones musculares agudas para resolver la dinámica celular y molecular que se despliega durante la regeneración muscular. Este enfoque se basa en la detección simultánea de nuevos marcadores de superficie celular y factores de transcripción miogénicos clave cuya expresión dinámica permite la identificación de células madre activadas y poblaciones de células progenitoras que representan hitos de miogénesis. Es importante destacar que se describe una estrategia de clasificación basada en la detección de los marcadores de superficie celular CD9 y CD104, que permite el aislamiento prospectivo de células madre y progenitoras musculares mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para estudios en profundidad de su función. Las células progenitoras musculares proporcionan un eslabón perdido crítico para estudiar el control del destino de las células madre musculares, identificar nuevos objetivos terapéuticos para las enfermedades musculares y desarrollar aplicaciones de terapia celular para la medicina regenerativa. El enfoque presentado aquí se puede aplicar para estudiar las células madre y progenitoras musculares in vivo en respuesta a perturbaciones, como las intervenciones farmacológicas dirigidas a vías de señalización específicas. También se puede utilizar para investigar la dinámica de las células madre y progenitoras musculares en modelos animales de enfermedades musculares, avanzando en nuestra comprensión de las enfermedades de las células madre y acelerando el desarrollo de terapias.
Introducción
El músculo esquelético constituye el tejido más grande por masa en el cuerpo y regula múltiples funciones, desde la vista hasta la respiración, desde la postura hasta el movimiento, así como el metabolismo1. Por lo tanto, mantener la integridad y la función del músculo esquelético es fundamental para la salud. El tejido muscular esquelético, que consiste en haces apretados de miofibras multinucleadas rodeadas por una compleja red de nervios y vasos sanguíneos, exhibe un notable potencial regenerativo 1,2.
Los principales impu....
Protocolo
Los procedimientos con animales fueron aprobados por la inspección danesa de experimentos con animales (protocolo # 2022-15-0201-01293), y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Aarhus. Se proporciona analgesia (buprenorfina) en el agua potable 24 horas antes de la lesión para que los ratones se adapten al sabor. El suministro de buprenorfina en el agua potable se continúa durante 24 horas después de la lesión. Junto con una inyección subcutánea (s.c.) de buprenorfina en el momento de la lesión muscular aguda, la buprenorfina en el agua potable después de la inyección de note....
Resultados Representativos
Aquí presentamos una descripción general de la configuración experimental para usar este enfoque combinado que incluye (i) análisis CyTOF de alta dimensión del curso del tiempo de una lesión aguda mediante inyección de notexina para estudiar la dinámica celular y molecular de las células madre y progenitoras en el músculo esquelético (Figura 1, esquema superior); y (ii) FACS de células madre y progenitoras utilizando dos marcadores de superficie .......
Discusión
La regeneración del músculo esquelético es un proceso dinámico que depende de la función de las células madre adultas. Si bien los estudios previos se han centrado en el papel de las células madre musculares durante la regeneración, su progenie in vivo ha sido poco estudiada, principalmente debido a la falta de herramientas para identificar y aislar estas poblaciones celulares 15,16,17,18.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del Centro Principal de FACS en el Departamento de Biomedicina de la Universidad de Aarhus por su apoyo técnico. Agradecemos a Alexander Schmitz, gerente de la Unidad de Citometría de Masas del Departamento de Biomedicina, por la discusión y el apoyo. Las ilustraciones científicas se crearon utilizando Biorender.com. Este trabajo fue financiado por una beca inicial de Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) y una subvención del paquete Start (0071113) de la Fundación Novo Nordisk a E.P.
....Materiales
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
Referencias
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
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