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Resumo

O protocolo aqui apresentado permite a identificação e análise de alta dimensão de células-tronco musculares e progenitoras por citometria de massa de célula única e sua purificação por FACS para estudos aprofundados de sua função. Essa abordagem pode ser aplicada para estudar a dinâmica de regeneração em modelos de doenças e testar a eficácia de intervenções farmacológicas.

Resumo

A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico impulsionado por células-tronco musculares adultas e sua progênie. Principalmente quiescentes em um estado estacionário, as células-tronco musculares adultas são ativadas após a lesão muscular. Após a ativação, eles proliferam e a maior parte de sua progênie se diferencia para gerar células musculares competentes para fusão, enquanto o restante se auto-renova para reabastecer o pool de células-tronco. Embora a identidade das células-tronco musculares tenha sido definida há mais de uma década, com base na co-expressão de marcadores de superfície celular, os progenitores miogênicos foram identificados apenas recentemente usando abordagens unicelulares de alta dimensão. Aqui, apresentamos um método de citometria de massa de célula única (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para analisar células-tronco e células progenitoras na lesão muscular aguda para resolver a dinâmica celular e molecular que se desdobra durante a regeneração muscular. Essa abordagem é baseada na detecção simultânea de novos marcadores de superfície celular e fatores-chave de transcrição miogênica cuja expressão dinâmica permite a identificação de células-tronco ativadas e populações de células progenitoras que representam marcos da miogênese. É importante ressaltar que uma estratégia de classificação baseada na detecção dos marcadores de superfície celular CD9 e CD104 é descrita, permitindo o isolamento prospectivo de células-tronco musculares e células progenitoras usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para estudos aprofundados de sua função. As células progenitoras musculares fornecem um elo perdido crítico para estudar o controle do destino das células-tronco musculares, identificar novos alvos terapêuticos para doenças musculares e desenvolver aplicações de terapia celular para medicina regenerativa. A abordagem apresentada aqui pode ser aplicada para estudar células-tronco musculares e progenitoras in vivo em resposta a perturbações, como intervenções farmacológicas direcionadas a vias de sinalização específicas. Também pode ser usado para investigar a dinâmica das células-tronco musculares e progenitoras em modelos animais de doenças musculares, avançando nossa compreensão das doenças com células-tronco e acelerando o desenvolvimento de terapias.

Introdução

O músculo esquelético constitui o maior tecido em massa do corpo e regula múltiplas funções, da visão à respiração, da postura ao movimento, bem como o metabolismo1. Portanto, manter a integridade e a função do músculo esquelético é fundamental para a saúde. O tecido muscular esquelético, que consiste em feixes compactados de miofibras multinucleadas cercadas por uma complexa rede de nervos e vasos sanguíneos, exibe notável potencial regenerativo 1,2.

Os principais impulsionadores da regeneração do músculo esquelético são as células-tronco musculares adultas (MuSCs). Também conhecidas como células satélites, devido à sua localização anatômica única adjacente à membrana plasmática da miofibra e abaixo da lâmina basal, foram identificadas pela primeira vez em 19613. Os MuSCs expressam um marcador molecular único, o fator de transcrição pareado box 7 (Pax7)4. Principalmente quiescentes em adultos saudáveis, eles são ativados após lesão muscular e proliferam para dar origem a descendentes que (i) se diferenciam em células musculares competentes para fusão que formarão novas miofibras para reparar danos musculares ou (ii) se auto-renovam para reabastecer o pool de células-tronco5.

No nível celular e molecular, o processo de regeneração é bastante dinâmico e envolve transições de estado celular, caracterizadas pela expressão coordenada de fatores-chave de transcrição miogênicos, também conhecidos como fatores reguladores miogênicos (MRFs)6,7. Estudos anteriores de desenvolvimento in vivo, experimentos de rastreamento de linhagem e trabalho de cultura de células usando mioblastos mostraram que a expressão sequencial desses fatores de transcrição impulsiona a miogênese, com o fator miogênico 5 (Myf5) sendo expresso na ativação, a diferenciação miogênica 1 (MyoD1) marcando o compromisso com o programa miogênico e a expressão de miogenina (MyoG) marcando a diferenciação 8,9,10,11, 12,13,14. Apesar desse conhecimento e da descoberta de marcadores de superfície celular para purificar MuSCs, faltam estratégias e ferramentas para identificar e isolar populações discretas ao longo da via de diferenciação miogênica e resolver uma progressão miogênica in vivo 15,16,17,18.

Aqui, apresentamos um novo método, baseado em pesquisas publicadas recentemente, que permite a identificação de células-tronco e progenitoras no músculo esquelético e a análise de sua dinâmica celular, molecular e de proliferação no contexto da lesão muscular aguda19. Essa abordagem se baseia na citometria de massa de célula única (também conhecida como Citometria por Tempo de Voo [CyTOF]) para detectar simultaneamente os principais marcadores de superfície celular (integrina α7, CD9, CD44, CD98 e CD104), fatores de transcrição miogênica intracelular (Pax7, Myf5, MyoD e MyoG) e um análogo de nucleosídeo (5-Iodo-2′-desoxiuridina, IdU), para monitorar células na fase S19,20, 21,22,23. Além disso, o protocolo apresenta uma estratégia baseada na detecção de dois marcadores de superfície celular, CD9 e CD104, para purificar essas populações celulares por classificação celular ativada por fluorescência (FACS), permitindo assim futuros estudos aprofundados de sua função no contexto de lesões e doenças musculares. Embora os mioblastos primários tenham sido amplamente utilizados no passado para estudar os estágios finais da diferenciação miogênica in vitro, não se sabe se eles recapitulam o estado molecular das células progenitoras musculares encontradas in vivo24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. A produção de mioblastos é trabalhosa e demorada, e o estado molecular dessa cultura primária muda rapidamente após a passagem31. Assim, progenitores miogênicos recém-isolados e purificados com este método fornecerão um sistema mais fisiológico para estudar a miogênese e o efeito de manipulações genéticas ou farmacológicas ex vivo.

O protocolo aqui apresentado pode ser aplicado para abordar uma variedade de questões de pesquisa, por exemplo, para estudar a dinâmica do compartimento miogênico in vivo em modelos animais de doenças musculares, em resposta a manipulações genéticas agudas ou em intervenções farmacológicas, aprofundando assim nossa compreensão da disfunção das células-tronco musculares em diferentes contextos biológicos e facilitando o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.

Protocolo

Os procedimentos em animais foram aprovados pela inspeção dinamarquesa de experimentos com animais (protocolo # 2022-15-0201-01293) e os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Aarhus. A analgesia (buprenorfina) é fornecida na água potável 24 horas antes da lesão para que os camundongos se adaptem ao sabor. O fornecimento de buprenorfina na água potável é continuado por 24 horas após a lesão. Juntamente com uma injeção subcutânea (s.c.) de buprenorfina no momento da lesão muscular aguda, a buprenorfina na água potável após a injeção de notexina aliviará a dor associada à lesão. Embora seja recomendado administrar uma injeção s.c. de buprenorfina no momento da lesão muscular aguda, seguida de buprenorfina na água de beber, a buprenorfina na água de beber antes da lesão é opcional. No entanto, os pesquisadores devem seguir os padrões e diretrizes de bem-estar animal estabelecidos pela agência reguladora competente.

NOTA: Para experimentos de citometria de massa de célula única (CyTOF) de músculos lesionados dos membros posteriores, comece na seção 1: Analgesia em água 24 h antes da lesão muscular até 24 h após a lesão. Para a classificação do tronco muscular e das células progenitoras de camundongos não lesionados, execute as seções 5 e 6: Eutanásia + Dissecção e dissociação do músculo esquelético e continue na seção 11: Coloração com anticorpos conjugados com fluoróforo para FACS. Uma visão geral da configuração experimental e do protocolo é mostrada na Figura 1.

1. Analgesia em água 24 h antes da lesão muscular até 24 h após a lesão

  1. Em um frasco escuro ou embrulhado em papel alumínio, adicione 3 mL de buprenorfina (0,3 mg / mL) e encha até 100 mL com água filtrada para atingir uma concentração final de 0,009 mg / mL 24 h antes da lesão. Anexe à gaiola do mouse.
  2. Remova o bebedouro 24 h após a lesão e reconecte a gaiola do mouse ao sistema de válvula de bebida.

2. Preparando-se para o procedimento de lesão aguda

NOTA: Use etanol 70% para desinfetar a bancada de trabalho, a configuração do cone do nariz e a caixa de indução.

  1. Prepare um tubo de 1,5 mL com notexina diluída em PBS (5 μg / mL). Dilua a buprenorfina (0,3 mg / mL) em solução salina estéril a 0,9% para 0,015 mg / mL em um tubo de 1,5 mL à prova de luz. Mantenha no gelo. Prepare seringas de insulina para injeções de buprenorfina (28 G, 0,5 mL) e notexina (29 G, 0,3 mL).
  2. Configure unidades anestésicas à base de isoflurano:
    1. Para anestesia em caixa de indução, use isoflurano a 3% com fluxo de 1,5 L/min (50% O2, 50% ar atmosférico).
    2. Para manutenção utilizando uma configuração de cone nasal, use isoflurano a 1,5% com um fluxo de 0,6 L/min (50% O2, 50% de ar atmosférico).

3. Lesão aguda por injeção de notexina

CUIDADO: A notoxina tem atividade fosfolipase A2 e é o principal componente do veneno da cobra-tigre australiana (Notechis scutatus), com um LD50 intravenoso de 5–17 mg de notoxina / kg em camundongos32,33. No presente protocolo, o músculo tibial anterior (TA) de cada membro posterior é injetado com 10 μL de 5 mg/mL de notexina, e o músculo gastrocnêmio (GA) de cada membro posterior é injetado duas vezes (uma vez em cada cabeça do músculo) com 15 μL de 5 mg/mL de notexina. É importante realizar as injeções intramusculares (i.m.) corretamente para limitar os danos e inspecionar frequentemente os animais injetados para garantir o mínimo de dor.

  1. Anestesiar o mouse na caixa de indução (isoflurano a 3%). Quando o camundongo estiver inconsciente, abaixe o nível de isoflurano para 1,5% na caixa de indução.
  2. Pese e marque individualmente os camundongos de acordo com os procedimentos aprovados pela instituição. Sob a configuração do cone do nariz, raspe os membros posteriores com um aparador e transfira de volta para a caixa de indução.
  3. Calcule o volume de buprenorfina para cada camundongo: figure-protocol-4406
  4. Misture a solução de notexina pipetando para cima e para baixo. Prepare 2 seringas de insulina (29 G, 0,3 mL) carregadas com 10 μL de solução de notexina (5 μg / mL) para injeções de TA e 4 seringas de insulina carregadas com 15 μL de solução de notexina (5 μg / mL) para injeção de GA.
    NOTA: O músculo tibial anterior (TA) está localizado no lado anterior da perna do camundongo, estendendo-se do joelho ao tornozelo. O músculo gastrocnêmio (GA) é um músculo de duas cabeças localizado na parte de trás da perna, superficial ao sóleo. Ele vai de suas duas cabeças (medial e lateral) logo acima do joelho até o calcanhar, estendendo-se por um total de três articulações (joelho, tornozelo e articulações subtalares).
  5. Realizar injeções intramusculares
    1. Injeção de TA (2 injeções no total)
      1. Coloque o mouse em decúbito dorsal sob a configuração do cone do nariz e desinfete o local da injeção com lenços umedecidos com álcool estéril (etanol 70% ou isopropanol). Insira a agulha, chanfrada para baixo, na barriga do TA (distal ao meio da barriga) em um ângulo de 30°. Avance a agulha ao longo do músculo, movendo-se paralelamente à tíbia, para alcançar o meio da barriga do TA. Injete a notexina lenta e continuamente, deixando a agulha no lugar por 10 s antes de retirá-la. Não insira a agulha muito fundo inicialmente (para evitar a injeção de notexina abaixo do TA no músculo extensor longo dos dedos) e não muito proximalmente ao avançar a agulha (para evitar injetar muito perto do joelho).
    2. Injeção de GA (4 injeções no total)
      1. Insira a agulha, chanfrada para baixo, em um ângulo de ~ 45 ° no meio da barriga da cabeça lateral do GA. Injete a notexina lenta e continuamente, deixando a agulha no lugar por 10 s antes de retirá-la. Gire o membro posterior e injete notexina na cabeça medial do músculo GA como acima. Deve-se tomar cuidado para não inserir a agulha muito profundamente.
  6. Vire o mouse e injete buprenorfina s.c. usando uma seringa de insulina (28 G, 0,5 mL). Transfira o mouse para uma gaiola de recuperação vazia em uma placa de aquecimento. Apenas metade do fundo da gaiola deve ser colocada sobre a placa de aquecimento para permitir que o mouse termorregule durante a recuperação34. Repita as etapas 3.3 a 3.6 para os mouses restantes.
  7. Quando o mouse na gaiola de recuperação estiver totalmente acordado, mova-o de volta para a gaiola original. Devolva-o ao estábulo e complemente-o com ração molhada. Remova o frasco de buprenorfina 24 h após a injeção.
  8. Monitore os camundongos por 6 h após a injeção de notexina e depois a cada 12 h por 2 dias quanto a sinais de dor, mobilidade prejudicada e diminuição do consumo de alimentos35,36.

4. Injeção de 5-Iodo-2'-desoxiuridina

CUIDADO: Suspeita-se que o 5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU) cause defeitos genéticos e prejudique a fertilidade ou o feto. Leia a ficha de dados de segurança (SDS) antes de manusear. Equipamento de proteção individual deve ser usado durante o manuseio. Use uma capela ao pesar o pó IdU. Os materiais que estiveram em contato com o IdU devem ser descartados de acordo com os regulamentos de segurança locais.

NOTA: A marcação de IdU in vivo é usada para monitorar a divisão celular durante o curso do tempo de lesão porque o IdU, um análogo da timidina iodada, é incorporado ao DNA das células na fase S. A IdU é injetada por via intraperitoneal (i.p.) a 20 mg/kg de peso corporal 8 h antes do sacrifício do camundongo.

  1. Utilizar um sonicador a 37 °C para preparar uma solução-mãe de 2 mg/ml de IdU em PBS estéril. IdU é sensível à luz; use no mesmo dia ou congele a -20 °C por até 3 meses. Se estiver usando IdU congelado: descongele, vórtice, centrifugue a 10.000 x g por 30 s e use o sobrenadante para injeções abaixo.
  2. Anestesiar o mouse na caixa de indução (isoflurano a 3%). Observe a marcação, pese os camundongos e calcule o volume da solução IdU: figure-protocol-8687
  3. Execute a injeção intravenosa usando uma seringa de insulina (28 G, 0,5 mL) e transfira o mouse para uma gaiola de recuperação vazia em uma placa de aquecimento. Quando acordado, mova o mouse de volta para sua gaiola original. Repita as etapas 4.2 a 4.3 para os mouses restantes e devolva-os ao estábulo.

5. Eutanásia

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de buffer. Prepare o meio de lavagem (mistura de nutrientes F-10 (presunto), soro de cavalo a 10%, 1x caneta / estreptococo) e filtre através de uma membrana de polietersulfona (PES) em um recipiente de poliestireno. Prepare o tampão de dissociação (meio de lavagem suplementado com 650 U / mL de colagenase, tipo II) e mantenha no gelo. As medições de citometria de massa CyTOF são muito sensíveis a contaminantes. Por esse motivo, é essencial usar reagentes do mais alto grau analítico para o processamento de amostras. Para evitar a contaminação por metais, é altamente recomendável usar plásticos estéreis e copos novos que nunca foram lavados com detergente, pois muitos sabões de laboratório contêm altos níveis de bário. Recomenda-se o uso de água duplamente filtrada, destilada e deionizada para a preparação do reagente. A solução salina tamponada com fosfato (PBS) é preparada internamente. Dilua os estoques 10x para 1x e filtre o PBS 1x com filtros de 0,2 μm. Filtre o PBS 1x novamente no início de cada experimento. As ferramentas de dissecação não devem ser limpas com detergente devido à presença de bário.

  1. Prepare a balança, o recipiente e a unidade anestésica à base de isoflurano com a caixa de indução. Desinfete as ferramentas de dissecação apropriadas.
  2. Prepare e marque tubos de 50 mL para cada camundongo com 5 mL de tampão de dissociação e uma placa de Petri. Mantenha o tampão de dissociação no gelo.
  3. Anestesiar o camundongo na caixa de indução (isoflurano a 3%, aumentar para 5% quando inconsciente) e realizar a luxação cervical.

6. Dissecção e dissociação do músculo esquelético

  1. Disseque os músculos TA e GA de ambos os membros posteriores e transfira para a tampa de uma placa de Petri. Use uma tesoura para cortar o tecido em uma pasta picada (~ 1 mm3 peças). Transfira para um tubo de 50 mL contendo 5 mL de tampão de dissociação gelado. Mantenha no gelo.
  2. Repita o procedimento de eutanásia (etapa 5.3) e o procedimento de dissecção e dissociação do músculo esquelético (etapa 6.1) até que todos os camundongos tenham sido processados.
  3. Pré-aqueça todos os tubos de amostra em banho-maria a 37 °C (2 min) e incube por 45 min em rotação em uma incubadora (37 °C).
  4. Vortex e lave adicionando 10 mL de meio de lavagem. Centrifugue (380 x g, 10 min, temperatura ambiente [RT]) e aspire a 4 mL.
  5. Adicione 0,5 mL de colagenase (1000 U/mL) e 0,5 mL de dispase (11 U/mL). Vórtice e incubar por 20 min em rotação a 37 °C (por exemplo, em uma incubadora). Centrifugue (380 x g, 1 min, RT) e ressuspenda com uma pipeta de 5 mL.
  6. Adicione filtros de células de 40 μm a tubos de 50 mL e pré-umedeça com 5 mL de meio de lavagem. Aspire e ejete a suspensão celular 10 vezes usando uma seringa de 5 mL com uma agulha de 20 G. Coe através do filtro de células pré-umedecido de 40 μm. Lave o tubo de 50 ml com um meio de lavagem de 10 ml, transfira-o para o filtro de células de 40 μm e centrifugue (380 x g, 10 min, 4 °C) a suspensão celular.

7. Coloração viva/morta com fixação de cisplatina e paraformaldeído

CUIDADO: A cisplatina e o paraformaldeído (PFA) são cancerígenos. Leia a FISPQ antes de manusear. O paraformaldeído (PFA; 16%) é um irritante para a pele, os olhos e as vias respiratórias. Use equipamento de proteção individual e manuseie essas substâncias sob uma hotte. Durante a fixação das células, a concentração final de PFA será de 1,6%. Medidas de proteção corretas devem ser tomadas e os resíduos devem ser manuseados de acordo com os regulamentos locais.

NOTA: Prepare DMEM sem soro frio (4 ° C) e quente (37 ° C). Prepare o DMEM suplementado com 10% de FBS, filtre através de uma membrana PES em um recipiente de poliestireno e mantenha no gelo. Prepare PBS e meios de coloração celular (CSM; PBS, 0,5% BSA, 0,02% azida de sódio) em um frasco de vidro dedicado a CyTOF e filtre através de uma membrana PES. O CSM pode ser armazenado a 4 °C por até 6 meses.

  1. Aspire o sobrenadante, sacuda o pellet e ressuspenda em 1 mL de DMEM sem soro frio. Conte as células e ajuste a densidade celular para 1 x 106 células/mL em DMEM sem soro.
  2. Adicione estoque de cisplatina (25 mM) a uma concentração final de 25 μM. Vórtice 10 s e incube por exatamente 1 min (a reação é muito sensível ao tempo). Extinguir a reação com DMEM gelado + 10% FBS (3 vezes o volume da amostra) e mantê-lo no gelo. Centrifugar (380 x g, 10 min, 4 °C), aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento (até 10 x 106 células/ml em CSM). Filtrar a suspensão através de um filtro de células de 35 μm.
  3. Fixe a suspensão celular com solução estoque de PFA filtrada (16%) e pipete para cima e para baixo (execute sob uma capela de exaustão) para atingir a concentração final de PFA (1,6%) (por exemplo, adicione 100 μL de PFA a 16% a 900 μL de suspensão celular). Vortex por 30 s, incubar por 10 min em gelo e lavar duas vezes com 2 mL de CSM por centrifugação (800 x g, 5 min, RT).
    NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser congeladas em gelo seco e armazenadas a -80 °C ou usadas diretamente para coloração de anticorpos. Se as células forem congeladas, transfira as células para tubos de polipropileno de 5 mL, pois o poliestireno pode rachar em baixas temperaturas. Se células recém-fixadas forem usadas para coloração, prossiga para a etapa 8.2.

8. Coloração com anticorpos conjugados com metal

CUIDADO: O metanol (MeOH) é altamente inflamável e corrosivo para o trato respiratório. Leia a FISPQ antes de manusear. Use equipamento de proteção individual e manuseie esta substância sob um exaustor. Manuseie os resíduos de acordo com os regulamentos locais.

NOTA: A lista de anticorpos (Ab) direcionados a marcadores de superfície e marcadores intracelulares pode ser encontrada na Tabela 2.

Conjugação de anticorpos: A maioria dos anticorpos usados neste protocolo foram conjugados internamente porque não estavam disponíveis comercialmente. Protocolos para conjugação metálica de anticorpos foram publicados anteriormente, e os kits de conjugação estão agora disponíveis comercialmente37,38. A imunoglobulina tipo G (IgG) é compatível com os protocolos de conjugação disponíveis. É de grande importância que a formulação de anticorpos usada para conjugação de metais esteja livre de proteínas transportadoras contendo cisteína (por exemplo, albumina de soro bovino (BSA)), que podem afetar a eficiência da conjugação competindo pelos grupos maleimida livres do polímero e podem interferir na quantificação do anticorpo conjugado com metal. O teor de cisteína da gelatina é muito menor do que o da BSA. No entanto, recomenda-se que, se a formulação de anticorpos contiver proteínas transportadoras, essas proteínas sejam removidas antes da conjugação. Agora é possível solicitar anticorpos livres de BSA e gelatina do fabricante. Conservantes de moléculas pequenas (por exemplo, azida sódica, glicerol e trealose) são compatíveis com protocolos de conjugação de metais37,38.

Titulação de anticorpos: Após cada conjugação de metais, os anticorpos devem ser titulados para determinar a concentração ideal de anticorpos que fornece a relação sinal-ruído máxima. Para titulação de anticorpos, execute uma diluição serial dupla de 6 etapas e core ambas as amostras conhecidas por expressar (por exemplo, células musculares, controles positivos) e não (controles negativos) a proteína de interesse 19,21,37,38.

Prepare uma nova solução de trabalho Cell-ID Intercalator-Ir (estoque = 500 μM; solução intercalator-ir) diluindo o estoque a 0,1 μM em PBS / 1,6% PFA.

  1. Descongele as amostras congeladas por 5 min em RT e centrifugue (800 x g, 1 min, RT). Lavar com 2 mL de CSM por centrifugação (800 x g, 5 min, RT).
  2. Prepare uma mistura de coloração de anticorpos de superfície (Ab) 2,5x em CSM. Aspirar o sobrenadante a ~60 μL e ressuspender completamente o sedimento. Pinte as células adicionando 40 μL de mistura de coloração Ab superficial e incubando-a por 1 h em RT.
  3. Agite as amostras a cada 20 minutos para misturar. Lavar duas vezes com 1 ml de CSM por centrifugação (800 x g, 5 min, RT). Aspirar o sobrenadante e sacudir o projétil.
    NOTA: Se nenhuma coloração intracelular for necessária, a permeabilização do metanol não é necessária. No entanto, se apenas a coloração da superfície for realizada, a solução intercalator-ir deve ser diluída em um tampão contendo um agente permeabilizante (por exemplo, Maxpar fix e tampão permanente) para penetrar na membrana nuclear. Prossiga para a etapa 8.5 e dilua o Cell-ID Intercalator-Ir em um tampão contendo um agente permeabilizante e 1.6% de PFA. Caso contrário, continue com a coloração intracelular abaixo.
    CUIDADO: O irídio é perigoso e devem ser tomadas precauções para um manuseio seguro. O irídio é inflamável e irritante para os olhos/pele. Evite criar e respirar poeira ou fumaça. Evite o contato com a pele e os olhos. No entanto, a mistura de solução intercalator-ir é fornecida na concentração de <1% em água, que é considerada não perigosa de acordo com o sistema globalmente harmonizado (GHS) de classificação e rotulagem de produtos químicos. Leia o SDS da Standard Biotools antes de manusear. Equipamento de proteção individual deve ser usado durante o manuseio. Os materiais que estiveram em contato com a solução intercalator-ir devem ser descartados de acordo com os regulamentos de segurança locais.
  4. Para permeabilizar as células, adicione 0,5 mL de MeOH gelado gota a gota durante o vórtice. Incubar durante 15 min em gelo sob uma hotte. Centrifugue (800 x g, 5 min, RT) e depois lave duas vezes com 1 mL de CSM por centrifugação (800 x g, 5 min, RT). Após a última lavagem, aspirar o sobrenadante a ~60 μL e ressuspender completamente o sedimento.
  5. Prepare uma mistura de coloração de Ab intracelular 2.5x em CSM. Pinte as células adicionando 40 μL de mistura de coloração Ab intracelular e incubando por 1 h em RT. Agite as amostras a cada 20 minutos para misturar.
  6. Lavar duas vezes com 1 ml de CSM por centrifugação (800 x g, 5 min, RT). Aspirar o sobrenadante e sacudir o projétil. Ressuspender as amostras em 0,5 mL de solução de intercalador-irídio (Tabela 1) e vórtice. Incubar as amostras durante 1 h em RT ou durante a noite (O/N) a 4 °C (ver nota abaixo).
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas em solução intercalator-irídio a 4 °C por até 48 h. O protocolo de coloração utilizado neste estudo foi desenvolvido com base no trabalho pioneiro do laboratório de Nolan{C}23. Ele difere dos protocolos da Standard Biotools, pois (i) tampões preparados internamente são usados para lavagem e coloração, (ii) as células são fixadas antes da coloração da superfície e (iii) as células são permeabilizadas com metanol para coloração intracelular com anticorpos para fatores de transcrição ou moléculas de sinalização. Os pesquisadores que desenvolvem um novo protocolo devem testar minuciosamente a compatibilidade de seu painel de anticorpos com o metanol como agente de permeabilização. Ao adicionar novos anticorpos a um painel, recomenda-se testar a especificidade do anticorpo por citometria de fluxo usando amostras de controle positivo e negativo antes da conjugação e titulação do metal.

9. Preparação da amostra para carregamento no citômetro de massa

NOTA: Os pellets de células ficam muito soltos quando em tampão CAS (Tabela de Materiais). Durante as lavagens com tampão CAS, não aspire ao ressecamento. Em vez disso, mantenha um volume residual conforme descrito abaixo.

  1. Vórtice e centrifugação (800 x g, 10 min, RT) as amostras. Despeje o sobrenadante (manuseie como resíduo de PFA) e o vórtice.
  2. Lavar com 1 ml de CSM por centrifugação (800 x g, 10 min, RT). Aspirar o sobrenadante e sacudir o projétil.
  3. Lavar com 1 ml de tampão CAS por centrifugação (800 x g, 10 min, RT). Aspire a ~ 200 μL. Vórtice e adicione 1 mL de tampão CAS. Retirar alíquota de 5 μL para contagem de células. Centrifugue (800 x g, 10 min, RT) e aspire cuidadosamente a ≤50 μL. Não perturbe o pellet.
  4. Ressuspenda o pellet a 1–2 x 106 células/mL em tampão CAS e adicione esferas de calibração (1x; Tabela de Materiais) a uma concentração final de 0,1x (por exemplo, adicione 100 μL de grânulos de calibração 1x a 900 μL de suspensão celular).
  5. Carregue a amostra no citômetro de massa e colete dados usando uma taxa de fluxo de 400–500 células/s.
  6. Realizar a normalização de dados de arquivos FCS usando o software CyTOF ou ferramentas de normalização desenvolvidas anteriormente39.
    NOTA: A operação dos citômetros de massa CyTOF é específica do instrumento40,41. Recomenda-se consultar o manual do usuário CyTOF antes da operação. Os grânulos de calibração são padrões de grânulos de normalização de poliestireno embutidos em metal contendo concentrações conhecidas dos isótopos metálicos cério (140/142Ce), európio (151/153Eu), hólmio (165Ho) e lutécio (175/176Lu). As esferas de calibração permitem o controle da sensibilidade da máquina, que pode variar ao longo do tempo, principalmente devido ao acúmulo de material biológico e variações na ionização do plasma ao longo do tempo.

10. Análise de dados CyTOF

NOTA: Para análise downstream, os arquivos FCS normalizados podem ser analisados localmente ou carregados em soluções de software baseadas em nuvem, como Cytobank, Cell Engine, OMIQ ou FCS Express42.

  1. Concatene arquivos FCS individuais para cada exemplo em um único arquivo, se necessário.
  2. Identifique células individuais por meio de eventos positivos do intercalador de irídio, o que permite a discriminação de células nucleadas únicas de detritos ou dupletos.
  3. Portão para células vivas selecionando eventos negativos de cisplatina. A cisplatina liga-se covalentemente às proteínas celulares e marca as células moribundas e mortas com membranas comprometidas em maior extensão do que as células vivas43.
  4. Gate na população de interesse, por exemplo, o compartimento miogênico (Live / CD45- / CD31- / Sca1- / α7integrina + / CD9 +) (Figura 2A) e quantifique a proporção relativa de células-tronco e progenitoras. Essa abordagem requer conhecimento prévio da superfície celular ou expressão de marcadores intracelulares para definir populações individuais.
  5. Para realizar análises de alta dimensão que permitirão a identificação de subconjuntos de células raras anteriormente não reconhecidos dentro de uma população complexa, exportar a população de interesse e usar algoritmos de agrupamento que foram desenvolvidos especificamente para análise de dados CyTOF44.
    NOTA: Trabalhos anteriores empregaram o algoritmo X-shift, que usa estimativa ponderada da densidade do vizinho mais próximo (kNN-DE) em espaço de alta dimensão para realizar agrupamento não supervisionado com base em parâmetros definidos19. O X-shift demonstrou ser altamente eficaz na identificação de populações de células raras45.
  6. Para análise de X-shift, baixe o pacote de software de vórtice (da página do GitHub do laboratório Nolan [https://github.com/nolanlab/vortex]) e Java 64-bit46. As instruções podem ser encontradas aqui: https://github.com/nolanlab/vortex/wiki/Getting-Started.
  7. Carregue as populações de células exportadas para um banco de dados local e defina os parâmetros de agrupamento. Entre os parâmetros definidos pelo usuário estão (i) os marcadores usados para agrupamento, (ii) o intervalo de valores k (por exemplo, 5 a 150) e (iii) o número de etapas de agrupamento.
    NOTA: Trabalhos anteriores usaram, como marcadores de agrupamento, uma combinação de marcadores de superfície conhecidos por serem expressos em células-tronco musculares, novos marcadores de superfície identificados em uma triagem citométrica de fluxo de alto rendimento de células musculares e mioblastos e fatores de transcrição miogênicos (TFs) conhecidos por definir diferentes estágios da miogênese. Essa abordagem permitiu a identificação de dois marcadores de superfície celular, CD9 e CD104, cujo padrão de co-expressão distingue populações de células progenitoras anteriormente não reconhecidas19.  A escolha cuidadosa dos marcadores de agrupamento permitirá que o pesquisador responda a perguntas específicas de pesquisa. Por exemplo, se a identificação e análise ao longo do tempo de subconjuntos de células em divisão for desejada, recomenda-se incluir IdU como um dos marcadores de agrupamento. O X-shift pode realizar clustering em vários valores k e identificar automaticamente, calculando o "ponto de cotovelo", o valor k que resulta no número ideal de cluster, evitando assim subclustering ou fragmentação excessiva. Recomenda-se calcular o ponto de cotovelo e usar a análise de agrupamento definida pelo valor ideal de k para visualização de dados e aplicativos downstream.
  8. Para visualizar as relações espaciais entre as populações de células dentro dos aglomerados X-shift, execute um layout direcionado por força, que gerará um mapa 2D onde a distância entre os aglomerados indica sua semelhança na expressão do marcador no espaço fenotípico de alta dimensão. Ao colorir o mapa usando um marcador de cada vez, é possível descobrir novas populações de células e acompanhar sua dinâmica. Recomenda-se a quantificação de acompanhamento por gating manual em software, como Cytobank e Cell Engine.
  9. Realize análises de mapa de calor para quantificar a expressão dinâmica de várias proteínas de superfície e intracelulares ao longo do curso do tempo e revelar novas tendências.
    NOTA: Ao realizar um curso de tempo de lesão, é possível agrupar dados de todos os pontos de tempo para gerar um mapa de regeneração. Além disso, é possível dissecar esse mapa em pontos de tempo individuais para acompanhar a dinâmica celular e molecular da regeneração ao longo do tempo19.

11. Coloração com anticorpos conjugados com fluoróforo para FACS

NOTA: As células usadas para controles de cor única não corados e controles de fluorescência menos um (FMO) podem se originar do conjunto TA e GA de um mouse extra, se disponível. Alternativamente, o quadríceps (músculo anterior superior da coxa) pode ser dissecado e digerido em uma suspensão de célula única, seguindo o mesmo procedimento do conjunto TA+GA acima e usado para controles. Prepare o tampão FACS (PBS, soro de cabra a 2,5%, EDTA 2 mM), filtre através de uma membrana PES em um recipiente de poliestireno e mantenha no gelo. O buffer FACS pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês. Uma lista de anticorpos usados para FACS pode ser encontrada na Tabela 3.

  1. Prepare uma mistura de linhagem. Manchar cada controle em 50 μL (contendo aprox. 3–5 x 105 células). Calcule a quantidade de mistura de linhagem necessária. Faça 20% a 30% de excesso de volume. A concentração de estoque de anticorpos usados para a mistura de linhagens é de 0,2 mg/mL.
    1. Em um tubo de 0,5 mL, adicione anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD31 APC-Cy7, anti-Sca1 APC-Cy7 e anti-CD11b APC-Cy7 para atingir concentrações finais de 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 2,5 μg/mL e 0,63 μg/mL, respectivamente.
  2. Prepare a mistura para todas as manchas. Manchar cada amostra totalmente corada em 500 μL (contendo aprox. 3–5 x 106 células). Faça 10% de excesso de volume de mistura de todas as manchas.
    1. Em um tubo de 1,5 mL, adicione anticorpos de mistura de linhagem como acima + anti-α7 integrina PE, anti-CD9 APC e anti-CD104 FITC para atingir concentrações finais de 2 μg/mL, 1,2 μg/mL e 3 μg/mL, respectivamente.
  3. Prepare o tampão FACS + DAPI: Para 10 mL de tampão FACS, adicione 1 μL de DAPI (estoque = 1 mg/mL) para atingir uma concentração final de 100 ng/mL de DAPI.
    CUIDADO: DAPI (dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol) é classificado como um possível irritante cutâneo e respiratório. No entanto, a solução de DAPI na concentração de <1% é considerada não perigosa, de acordo com o GHS. Leia a FISPQ antes de manusear. Equipamento de proteção individual deve ser usado durante o manuseio. Os materiais que estiveram em contato com o DAPI devem ser descartados de acordo com os regulamentos de segurança locais.
  4. Ressuspender células da seção 6: Dissecção e dissociação do músculo esquelético:
    1. Para todas as amostras coradas, ressuspenda os conjuntos TA e GA de um único camundongo em 500 μL de tampão FACS e transfira-o para tubos de 15 mL para coloração.
    2. Para controles, use conjuntos TA e GA ou conjuntos de quadríceps. Se estiver usando 1 mouse para controles, ressuspenda as células em 750 μL de tampão FACS. Se vários camundongos, ressuspenda cada conjunto TA e GA ou quadríceps em 500 μL de tampão FACS e combine os conjuntos em uma única amostra de 1 mL retirando uma fração de cada amostra. Adicione 50 μL de células de controle (3–5 x 105 células) a tubos de polipropileno de 5 mL para coloração.
  5. Manchar conforme descrito na Tabela 4 por 45 min a 4 ° C no escuro.
  6. Lave todas as amostras coradas adicionando 5 mL de tampão FACS. Lave os controles adicionando 1 mL de tampão FACS e centrífuga (380 x g, 10 min, 4 °C).
  7. Ressuspenda todas as amostras coradas em 1 mL de tampão FACS + DAPI. Ressuspenda os controles em 300 μL de buffer FACS com ou sem DAPI.
  8. Manter as células a 4 °C na obscuridade até serem classificadas num citómetro de fluxo com 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm).
  9. Execute os controles e amostras no classificador e crie portões de classificação usando o software relevante. Para controles sem coloração/cor única e controles FMO, registre 1 x 104 e 0,3–1 x 105 eventos, respectivamente. Para amostras totalmente coradas, registre até 1 x 106 eventos. Classifique todas as amostras coradas, ou quantas forem necessárias, dependendo dos requisitos do ensaio a jusante. Para o citómetro de fluxo utilizado aqui (FACSAria III), classificar em modo de pureza utilizando um bico de 70 mm.
  10. Consulte a Figura 4 para obter a estratégia de gating.
    1. Use os controles sem coloração e de cor única para definir a tensão para todos os detectores.
    2. Use os controles de cor única para configurar a matriz de compensação.
    3. Use os controles FMO para estabelecer portões de classificação.
  11. Populações distintas de células-tronco musculares e progenitoras são classificadas em tampão FACS gelado.
  12. Centrifugar (380 x g, 10 min, 4 °C) as populações celulares. Ressuspenda no buffer apropriado, conte e continue com a análise downstream.

Resultados

Aqui, apresentamos uma visão geral da configuração experimental para usar essa abordagem combinada, que inclui (i) análise CyTOF de alta dimensão de um curso de tempo de lesão aguda por injeção de notexina para estudar a dinâmica celular e molecular de células-tronco e progenitoras no músculo esquelético (Figura 1, esquema superior); e (ii) FACS de células-tronco e progenitoras usando dois marcadores de superfície celular, CD9 e CD104, para iso...

Discussão

A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico que depende da função das células-tronco adultas. Embora estudos anteriores tenham se concentrado no papel das células-tronco musculares durante a regeneração, sua progênie in vivo foi pouco estudada, principalmente devido à falta de ferramentas para identificar e isolar essas populações de células 15,16,17,18....

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do FACS Core Facility no Departamento de Biomedicina da Universidade de Aarhus pelo apoio técnico. Agradecemos a Alexander Schmitz, gerente da Unidade de Citometria de Massa do Departamento de Biomedicina, pela discussão e apoio. Ilustrações científicas foram criadas usando Biorender.com. Este trabalho foi financiado por uma bolsa inicial da Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) e uma bolsa do pacote inicial (0071113) da Fundação Novo Nordisk para a EP

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; In-house conjugated
MyoD (Clone: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; In-house conjugated
MyoG (Clone: F5D)BD Biosciences556358Gd160; In-house conjugated
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C
Nutrient mixture F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Clone: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Clone: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; In-house conjugated
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
PES Filter Units 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES Syringe FilterFisher Scientific15206869
Petri dishSarstedt82.1472.001
PFA 16% EM gradeMP Biomedicals219998320
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific10375810
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (Clone: J112-906)Standard Biotools3166011AEr166
pS6 kinase (Clone: N7-548)Standard Biotools3172008AYb172
Sca-1 (Clone: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; In-house conjugated
Sodium AzideSigma AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific10553515
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterile saline solution 0.9%FreseniusB306414/02
α7 integrin (Clone: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; In-house conjugated

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