Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Identification et analyse de progéniteurs myogéniques in vivo au cours d’une lésion aiguë des muscles squelettiques par cytométrie de masse unicellulaire de grande dimension
Dans cet article
Résumé
Le protocole présenté ici permet l’identification et l’analyse de haute dimension des cellules souches musculaires et progénitrices par cytométrie de masse unicellulaire et leur purification par FACS pour des études approfondies de leur fonction. Cette approche peut être appliquée pour étudier la dynamique de régénération dans des modèles de maladies et tester l’efficacité d’interventions pharmacologiques.
Résumé
La régénération des muscles squelettiques est un processus dynamique piloté par les cellules souches musculaires adultes et leur progéniture. La plupart du temps au repos à l’état d’équilibre, les cellules souches musculaires adultes s’activent lors d’une lésion musculaire. Après l’activation, ils prolifèrent et la plupart de leur progéniture se différencie pour générer des cellules musculaires compétentes en matière de fusion, tandis que le reste s’auto-renouvelle pour reconstituer le pool de cellules souches. Alors que l’identité des cellules souches musculaires a été définie il y a plus d’une décennie, sur la base de la co-expression de marqueurs de surface cellulaire, les progéniteurs myogéniques n’ont été identifiés que récemment à l’aide d’approches unicellulaires de grande dimension. Ici, nous présentons une méthode de cytométrie de masse unicellulaire (cytométrie par temps de vol [CyTOF]) pour analyser les cellules souches et les cellules progénitrices dans les lésions musculaires aiguës afin de résoudre la dynamique cellulaire et moléculaire qui se déroule pendant la régénération musculaire. Cette approche est basée sur la détection simultanée de nouveaux marqueurs de surface cellulaire et de facteurs clés de transcription myogénique dont l’expression dynamique permet l’identification de cellules souches activées et de populations de cellules progénitrices qui représentent des jalons de la myogenèse. Il est important de noter qu’une stratégie de tri basée sur la détection des marqueurs de surface cellulaire CD9 et CD104 est décrite, permettant l’isolement prospectif des cellules souches musculaires et des cellules progénitrices à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour des études approfondies de leur fonction. Les cellules progénitrices musculaires constituent un chaînon manquant essentiel pour étudier le contrôle du destin des cellules souches musculaires, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies musculaires et développer des applications de thérapie cellulaire pour la médecine régénérative. L’approche présentée ici peut être appliquée à l’étude des cellules souches musculaires et des cellules progénitrices in vivo en réponse à des perturbations, telles que des interventions pharmacologiques ciblant des voies de signalisation spécifiques. Il peut également être utilisé pour étudier la dynamique des cellules souches musculaires et des cellules progénitrices dans des modèles animaux de maladies musculaires, faisant progresser notre compréhension des maladies des cellules souches et accélérant le développement de thérapies.
Introduction
Le muscle squelettique constitue le plus grand tissu en masse du corps et régule de multiples fonctions, de la vue à la respiration, de la posture au mouvement, ainsi que le métabolisme1. Par conséquent, le maintien de l’intégrité et de la fonction des muscles squelettiques est essentiel à la santé. Le tissu musculaire squelettique, qui se compose de faisceaux serrés de myofibres multinucléées entourés d’un réseau complexe de nerfs et de vaisseaux sanguins, présente un potentiel de régénération remarquable 1,2.
Les principaux....
Protocole
Les procédures sur les animaux ont été approuvées par l’inspection danoise des expériences sur les animaux (protocole # 2022-15-0201-01293), et les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université d’Aarhus. L’analgésie (buprénorphine) est fournie dans l’eau de boisson 24 h avant la blessure pour que les souris s’adaptent au goût. L’apport de buprénorphine dans l’eau potable est maintenu pendant 24 heures après la blessure. Associée à une injection sous-cutanée (s.c.) de buprénorphine au moment de la lésion musculaire aiguë, la buprénorphine dans l’eau de boisson après l’injection de notexine ....
Résultats Représentatifs
Nous présentons ici un aperçu du dispositif expérimental d’utilisation de cette approche combinée, qui comprend : (i) l’analyse CyTOF de haute dimension de l’évolution temporelle d’une lésion aiguë par injection de notexine pour étudier la dynamique cellulaire et moléculaire des cellules souches et progénitrices dans le muscle squelettique (Figure 1, schéma du haut) ; et (ii) FACS de cellules souches et progénitrices à l’aide de deux m.......
Discussion
La régénération des muscles squelettiques est un processus dynamique qui repose sur la fonction des cellules souches adultes. Alors que des études antérieures se sont concentrées sur le rôle des cellules souches musculaires lors de la régénération, leur descendance in vivo a été sous-étudiée, principalement en raison d’un manque d’outils pour identifier et isoler ces populations cellulaires 15,16,17,18........
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions les membres de la plateforme FACS du Département de biomédecine de l’Université d’Aarhus pour leur soutien technique. Nous remercions Alexander Schmitz, directeur de l’unité de cytométrie de masse du Département de biomédecine, pour ses discussions et son soutien. Les illustrations scientifiques ont été créées à l’aide de Biorender.com. Ce travail a été financé par une bourse de démarrage de l’Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) et une subvention Start Package (0071113) de la Fondation Novo Nordisk à E.P.
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
Références
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
Réimpressions et Autorisations
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon
À PROPOS DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.