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高次元シングルセルマスサイトメトリーによる急性骨格筋損傷時のin vivoにおける筋原性前駆細胞の同定と解析
要約
ここで紹介するプロトコールは、シングルセルマスサイトメトリーによる筋幹細胞および前駆細胞の同定と高次元解析、およびFACSによるそれらの精製を可能にし、それらの機能の詳細な研究を可能にします。このアプローチは、疾患モデルにおける再生動態の研究や、薬理学的介入の有効性の検証に適用することができます。
要約
骨格筋の再生は、成体筋幹細胞とその子孫によって駆動されるダイナミックなプロセスです。定常状態ではほとんどが静止している成体の筋幹細胞は、筋肉の損傷時に活性化されます。活性化後、それらは増殖し、その子孫の大部分は分化して融合能力のある筋肉細胞を生成し、残りの子孫は自己再生して幹細胞プールを補充します。筋幹細胞の同定は10年以上前に定義されましたが、細胞表面マーカーの共発現に基づいて、筋原性前駆細胞が同定されたのはごく最近のことで、高次元のシングルセルアプローチを使用して明らかになりました。ここでは、急性筋損傷における幹細胞および前駆細胞を解析し、筋肉再生中に展開する細胞および分子動態を解明するためのシングルセルマスサイトメトリー(Site by Time of Flight [CyTOF])法を紹介します。このアプローチは、新規の細胞表面マーカーと主要な筋原性転写因子の同時検出に基づいており、その動的発現により、筋形成のランドマークである活性化幹細胞と前駆細胞集団の同定が可能になります。重要なことに、細胞表面マーカーCD9およびCD104の検出に基づくソーティング戦略が説明されており、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して筋幹細胞および前駆細胞を前向きに分離し、それらの機能の詳細な研究を可能にします。筋前駆細胞は、筋幹細胞の運命制御を研究し、筋疾患の新規治療標的を特定し、再生医療のための細胞治療アプリケーションを開発するための重要なミッシングリンクを提供します。ここで紹介するアプローチは、特定のシグナル伝達経路を標的とする薬理学的介入など、摂動に応答するin vivo の筋幹細胞および前駆細胞の研究に適用することができます。また、筋疾患の動物モデルにおける筋幹細胞および前駆細胞の動態を調査するためにも使用でき、幹細胞疾患の理解を深め、治療法の開発を加速させます。
概要
骨格筋は、体内で質量で最大の組織を構成し、視力から呼吸、姿勢から動き、代謝まで、複数の機能を調節しています1。したがって、骨格筋の完全性と機能を維持することは、健康にとって非常に重要です。骨格筋組織は、神経と血管の複雑なネットワークに囲まれた多核筋線維の密集した束で構成されており、顕著な再生能力を示しています1,2。
骨格筋の再生の主な推進力は、成体筋幹細胞(MuSC)です。サテライト細胞とも呼ばれ、筋線維の原形質膜に隣接し、基底椎弓板の下にユニークな解剖学的位置にあるため、1961年に初めて同定されました3。MuSCは、転写因子対ボックス7(Pax7)4というユニークな分子マーカーを発現します。健康な成人ではほとんどが静止しますが、筋肉の損傷を受けると活性化して増殖し、子孫を生じさせます。これは、(i)融合能力のある筋肉細胞に分化して筋肉の損傷を修復するための新しい筋繊維を形成するか、(ii)幹細胞プールを補充するために自己再生します5。
細胞およ....
プロトコル
動物実験はデンマークの動物実験検査官によって承認され(プロトコル#2022-15-0201-01293)、実験はオーフス大学の機関ガイドラインに準拠して行われました。鎮痛剤(ブプレノルフィン)は、マウスが味に適応するために、傷害の24時間前に飲料水に提供されます。飲料水へのブプレノルフィンの供給は、損傷後24時間継続されます。.急性筋肉損傷時のブプレノルフィンの皮下注射(皮下注射)とともに、ノテキシン注射後の飲料水中のブプレノルフィンは、損傷に関連する痛みを軽減します。.急性筋肉損傷時にブプレノルフィンの皮下注射を投与し、続いて飲料水にブプレノルフィンを投与することをお勧めしますが、損傷前の飲料水中のブプレノルフィンはオプションです。.ただし、研究者は、適切な規制当局が定めた動物福祉の基準とガイドラインに従わなければなりません。
注:損傷した後肢筋のシングルセルマスサイトメトリー(CyTOF)実験の場合、セクション1:筋肉損傷の24時間前から損傷後24時間までの水中鎮痛から開始します。損傷していないマウスからの筋幹細胞および前駆細胞の選別については、セクション5および6:安楽死+骨格筋の解剖および解離を行い、セクション11:FACSの蛍光色素標識抗体による染色に進みます。 実験のセットアップとプロトコルの概要を 図1に示します。
代表的な結果
ここでは、(i) 骨格筋の幹細胞と前駆細胞の細胞および分子動態を研究するためのノテキシン注射による急性損傷時間経過の高次元 CyTOF 分析 (図 1、上のスキーム) を含む、この組み合わせアプローチを使用するための実験設定の概要を示します。(ii)幹細胞および前駆細胞のFACSは、CD9およびCD104の2つの細胞表面マーカーを使用して、これらの集?.......
ディスカッション
骨格筋の再生は、成体幹細胞の機能に依存するダイナミックなプロセスです。先行研究は、再生中の筋幹細胞の役割に焦点を当ててきたが、その子孫のin vivoは、主にこれらの細胞集団を同定し単離するためのツールが不足しているため、十分に研究されていなかった15,16,17,18。
開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
謝辞
オーフス大学生物医学科のFACSコアファシリティのメンバーの技術サポートに感謝します。私たちは、生物医学部門の質量サイトメトリーユニットのマネージャーであるAlexander Schmitz氏に、ディスカッションとサポートを提供していただいたことに感謝します。サイエンティフィックイラストレーションは Biorender.com を使用して作成されました。この研究は、オーフス大学フォルスニングスフォンド(AUFF)のスターティンググラントと、ノボノルディスク財団からE.P.へのスタートパッケージグラント(0071113)によって資金提供されました。
....資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
参考文献
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
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