Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Идентификация и анализ миогенных предшественников in vivo при остром повреждении скелетных мышц методом многомерной одноклеточной массовой цитометрии
В этой статье
Резюме
Представленный здесь протокол позволяет проводить идентификацию и многомерный анализ мышечных стволовых и прогениторных клеток с помощью одноклеточной массовой цитометрии и их очистку с помощью FACS для углубленного изучения их функции. Этот подход может быть применен для изучения динамики регенерации в моделях заболеваний и проверки эффективности фармакологических вмешательств.
Аннотация
Регенерация скелетных мышц — это динамический процесс, приводимый в движение взрослыми мышечными стволовыми клетками и их потомством. Взрослые мышечные стволовые клетки, находящиеся в основном в состоянии покоя в стационарном состоянии, активируются при повреждении мышц. После активации они размножаются, и большая часть их потомства дифференцируется для создания компетентных к слиянию мышечных клеток, в то время как оставшиеся самообновляются для пополнения пула стволовых клеток. В то время как идентичность мышечных стволовых клеток была определена более десяти лет назад на основе совместной экспрессии маркеров клеточной поверхности, миогенные предшественники были идентифицированы только недавно с использованием подходов к размерным одиночным клеткам. В данной работе мы представляем метод одноклеточной масс-цитометрии (цитометрия по времени пролета [CyTOF]) для анализа стволовых клеток и клеток-предшественников при остром мышечном повреждении для разрешения клеточной и молекулярной динамики, которая разворачивается во время регенерации мышц. Этот подход основан на одновременном обнаружении новых маркеров клеточной поверхности и ключевых миогенных факторов транскрипции, динамическая экспрессия которых позволяет идентифицировать активированные стволовые клетки и популяции клеток-предшественников, представляющие собой вехи миогенеза. Важно отметить, что описана стратегия сортировки, основанная на обнаружении маркеров клеточной поверхности CD9 и CD104, позволяющая проспективно выделять мышечные стволовые и прогениторные клетки с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) для углубленного изучения их функции. Мышечные клетки-предшественники являются критически важным недостающим звеном для изучения контроля судьбы мышечных стволовых клеток, выявления новых терапевтических мишеней для мышечных заболеваний и разработки приложений клеточной терапии для регенеративной медицины. Представленный здесь подход может быть применен для изучения мышечных стволовых и прогениторных клеток in vivo в ответ на возмущения, такие как фармакологические вмешательства, нацеленные на конкретные сигнальные пути. Он также может быть использован для исследования динамики мышечных стволовых и прогениторных клеток на животных моделях мышечных заболеваний, углубляя наше понимание болезней стволовых клеток и ускоряя разработку методов лечения.
Введение
Скелетные мышцы представляют собой самую большую по массе ткань в организме и регулируют множество функций, от зрения до дыхания, от осанки до движения, а также обмен веществ1. Поэтому поддержание целостности и функции скелетных мышц имеет решающее значение для здоровья. Скелетная мышечная ткань, состоящая из плотно упакованных пучков многоядерных миоволокон, окруженных сложной сетью нервов и кровеносных сосудов, демонстрирует замечательный регенеративный потенциал1,2.
Основными факторами регенерации скелетных мышц являются в....
протокол
Процедуры на животных были одобрены датской инспекцией по экспериментам на животных (протокол # 2022-15-0201-01293), а эксперименты проводились в соответствии с институциональными рекомендациями Орхусского университета. Анальгезия (бупренорфин) вводится в питьевую воду за 24 часа до травмы, чтобы мыши могли адаптироваться к вкусу. Подача бупренорфина в питьевую воду продолжается в течение 24 ч после травмы. Вместе с подкожной инъекцией бупренорфина во время острой мышечной травмы, бупренорфин в питьевой воде после инъекции нотексина облегчит боль, связанную с травмой. В то время как рекомендуется вводить внутривенно бупренорфин во вре....
Результаты
Здесь мы представляем обзор экспериментальной установки для использования этого комбинированного подхода, которая включает в себя: (i) многомерный анализ CyTOF временного течения острой травмы при введении нотексина для изучения клеточной и молекулярной динамики ство.......
Обсуждение
Регенерация скелетных мышц – это динамический процесс, который опирается на функцию взрослых стволовых клеток. В то время как предыдущие исследования были сосредоточены на роли мышечных стволовых клеток во время регенерации, их потомство in vivo было недостаточно.......
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим членов Основного фонда FACS на факультете биомедицины Орхусского университета за техническую поддержку. Мы благодарим Александра Шмитца, руководителя отделения массовой цитометрии отделения биомедицины, за обсуждение и поддержку. Научные иллюстрации были созданы с использованием Biorender.com. Эта работа финансировалась за счет стартового гранта Орхусского университета Forskningsfond (AUFF) и гранта Start Package (0071113) от Фонда Novo Nordisk для E.P.
....Материалы
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
Ссылки
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены