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Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und hochdimensionale Analyse von Muskelstamm- und Vorläuferzellen mittels Einzelzell-Massenzytometrie und deren Aufreinigung durch FACS für vertiefte Studien ihrer Funktion. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Regenerationsdynamik in Krankheitsmodellen zu untersuchen und die Wirksamkeit pharmakologischer Interventionen zu testen.
Zusammenfassung
Die Regeneration der Skelettmuskulatur ist ein dynamischer Prozess, der von adulten Muskelstammzellen und ihren Nachkommen gesteuert wird. Adulte Muskelstammzellen, die meist in einem stationären Zustand ruhen, werden bei Muskelverletzungen aktiviert. Nach der Aktivierung vermehren sie sich, und die meisten ihrer Nachkommen differenzieren sich, um fusionskompetente Muskelzellen zu erzeugen, während sich der Rest selbst erneuert, um den Stammzellpool aufzufüllen. Während die Identität von Muskelstammzellen vor mehr als einem Jahrzehnt auf der Grundlage der Co-Expression von Zelloberflächenmarkern definiert wurde, wurden myogene Vorläuferzellen erst vor kurzem mit Hilfe hochdimensionaler Einzelzellansätze identifiziert. Hier stellen wir eine Einzelzell-Massenzytometrie-Methode (Cytometry by Time of Flight [CyTOF]) vor, um Stammzellen und Vorläuferzellen bei akuten Muskelverletzungen zu analysieren, um die zelluläre und molekulare Dynamik aufzuklären, die sich während der Muskelregeneration entfaltet. Dieser Ansatz basiert auf der gleichzeitigen Detektion neuartiger Zelloberflächenmarker und wichtiger myogener Transkriptionsfaktoren, deren dynamische Expression die Identifizierung von aktivierten Stammzellen und Vorläuferzellpopulationen ermöglicht, die Meilensteine der Myogenese darstellen. Wichtig ist, dass eine Sortierstrategie beschrieben wird, die auf dem Nachweis der Zelloberflächenmarker CD9 und CD104 basiert und die prospektive Isolierung von Muskelstamm- und Vorläuferzellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) für eingehende Studien ihrer Funktion ermöglicht. Muskelvorläuferzellen stellen ein entscheidendes fehlendes Bindeglied dar, um die Kontrolle des Schicksals von Muskelstammzellen zu untersuchen, neue therapeutische Ziele für Muskelerkrankungen zu identifizieren und zelltherapeutische Anwendungen für die regenerative Medizin zu entwickeln. Der hier vorgestellte Ansatz kann angewendet werden, um Muskelstamm- und Vorläuferzellen in vivo als Reaktion auf Störungen zu untersuchen, wie z.B. pharmakologische Interventionen, die auf bestimmte Signalwege abzielen. Es kann auch verwendet werden, um die Dynamik von Muskelstamm- und Vorläuferzellen in Tiermodellen von Muskelerkrankungen zu untersuchen, unser Verständnis von Stammzellerkrankungen zu verbessern und die Entwicklung von Therapien zu beschleunigen.
Einleitung
Die Skelettmuskulatur stellt das massemäßig größte Gewebe des Körpers dar und reguliert mehrere Funktionen, vom Sehvermögen bis zur Atmung, von der Haltung bis zur Bewegung sowie den Stoffwechsel1. Daher ist die Aufrechterhaltung der Integrität und Funktion der Skelettmuskulatur entscheidend für die Gesundheit. Das Skelettmuskelgewebe, das aus dicht gepackten Bündeln mehrkerniger Myofasern besteht, die von einem komplexen Netzwerk von Nerven und Blutgefäßen umgeben sind, weist ein bemerkenswertes regeneratives Potenzialauf 1,2.
Protokoll
Die Tierversuche wurden von der dänischen Tierversuchsaufsichtsbehörde genehmigt (Protokoll # 2022-15-0201-01293), und die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Universität Aarhus durchgeführt. Die Analgesie (Buprenorphin) wird 24 Stunden vor der Verletzung im Trinkwasser verabreicht, damit sich die Mäuse an den Geschmack anpassen können. Die Zufuhr von Buprenorphin ins Trinkwasser wird für 24 Stunden nach der Verletzung fortgesetzt. Zusammen mit einer subkutanen (s.c.) Injektion von Buprenorphin zum Zeitpunkt einer akuten Muskelverletzung lindert Buprenorphin im Trinkwasser nach Notexin-Injektion....
Repräsentative Ergebnisse
Hier präsentieren wir einen Überblick über den experimentellen Aufbau für die Verwendung dieses kombinierten Ansatzes, der Folgendes umfasst: (i) hochdimensionale CyTOF-Analyse eines akuten Verletzungszeitverlaufs durch Notexin-Injektion zur Untersuchung der zellulären und molekularen Dynamik von Stamm- und Vorläuferzellen im Skelettmuskel (Abbildung 1, oberes Schema); und (ii) FACS von Stamm- und Vorläuferzellen unter Verwendung von zwei Zelloberflä.......
Diskussion
Die Regeneration der Skelettmuskulatur ist ein dynamischer Prozess, der auf der Funktion adulter Stammzellen beruht. Während sich frühere Studien auf die Rolle von Muskelstammzellen während der Regeneration konzentriert haben, wurden ihre Nachkommen in vivo zu wenig untersucht, vor allem aufgrund eines Mangels an Instrumenten zur Identifizierung und Isolierung dieser Zellpopulationen 15,16,17,18.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern der FACS Core Facility in der Abteilung für Biomedizin der Universität Aarhus für die technische Unterstützung. Wir danken Alexander Schmitz, dem Leiter der Abteilung Massenzytometrie an der Klinik für Biomedizin, für das Gespräch und die Unterstützung. Wissenschaftliche Illustrationen wurden mit Biorender.com erstellt. Diese Arbeit wurde durch einen Starting Grant des Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) und einen Start Package Grant (0071113) der Novo Nordisk Foundation an E.P. finanziert.
....Materialien
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
Referenzen
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
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