A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يصف هذا البروتوكول منصة زراعة الخلايا القائمة على الغشاء القابلة لإعادة التكوين والتي تدمج تنسيق البئر المفتوح مع قدرات تدفق السوائل. تتوافق هذه المنصة مع البروتوكولات القياسية وتسمح بالانتقال القابل للانعكاس بين أوضاع زراعة البئر المفتوحة والمستنبتات الدقيقة ، مما يلبي احتياجات كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.
الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة هي منصات مصغرة لزراعة الخلايا تستخدم لتقليد بنية ووظيفة الأنسجة البشرية في بيئة المختبر. ومع ذلك ، لم تكتسب هذه المنصات اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية حيث تعمل الأساليب القائمة على الأغشية المفتوحة كمعيار ذهبي لمحاكاة حواجز الأنسجة ، على الرغم من افتقارها إلى قدرات تدفق السوائل. يمكن أن تعزى هذه المشكلة في المقام الأول إلى عدم توافق الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة الحالية مع البروتوكولات والأدوات القياسية المطورة لأنظمة الآبار المفتوحة.
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء منصة قائمة على الغشاء قابلة لإعادة التشكيل مع هيكل بئر مفتوح ، وقدرة على تحسين التدفق ، والتوافق مع البروتوكولات التقليدية. يستخدم هذا النظام نهج التجميع المغناطيسي الذي يتيح التبديل العكسي بين أوضاع البئر المفتوحة وأوضاع الموائع الدقيقة. باستخدام هذا النهج ، يتمتع المستخدمون بالمرونة لبدء تجربة بتنسيق البئر المفتوح باستخدام البروتوكولات القياسية وإضافة أو إزالة إمكانات التدفق حسب الحاجة. لإثبات الاستخدام العملي لهذا النظام وتوافقه مع التقنيات القياسية ، تم إنشاء طبقة أحادية الخلية البطانية في شكل بئر مفتوح. تمت إعادة تشكيل النظام لإدخال تدفق السوائل ثم تم تحويله إلى تنسيق البئر المفتوح لإجراء تلطيخ المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي. نظرا لتوافقه مع بروتوكولات الآبار المفتوحة التقليدية وقدرة تحسين التدفق ، من المتوقع أن يتم اعتماد هذا التصميم القابل لإعادة التكوين من قبل كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.
تعمل الحواجز الوعائية كواجهة مهمة تفصل حجرة الدم عن الأنسجة المحيطة. إنها تلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن من خلال جذب الخلايا المناعية ، والتحكم في النفاذية الجزيئية ، والحماية من تسلل مسببات الأمراض إلى الأنسجة 1,2. تم تطوير نماذج الاستزراع في المختبر لمحاكاة البيئة المكروية في الجسم الحي ، مما يتيح إجراء تحقيقات منهجية في العوامل والظروف التي تؤثر على خصائص الحاجز في كل من الحالات الصحية والمريضة 3,4.
النهج الأكثر استخداما لنماذج الاستزراع هذه هو تكوين "البئر المفتوح"الشبيه ب Transwell....
يمكن استخدام هذا التصميم في أوضاع مختلفة بناء على المتطلبات التجريبية وتفضيلات المستخدم النهائي. قبل كل تجربة ، راجع مخطط تدفق القرار المعروض في الشكل 2 لتحديد الخطوات والوحدات اللازمة للبروتوكول. على سبيل المثال ، إذا كان المستخدم ينوي الحفاظ على تنسيق البئر المفتوح خلال التجربة لمقارنته مباشرة بنظام من نوع Transwell ، فإن استنسل الزخرفة غير مطلوب لبذر الخلية. الوحدة الأساسية متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، ويمكن اختيار الغشاء النانوي فائق النحافة من مكتبة المواد ذات المسامية وأحجام المسام المختلفة لتناسب الاحتياجات التجريبية.
1. تصنيع استنسل الزخرفة
يتم وضع الوحدة الأساسية المفتوحة في البداية داخل تجويف معين تم إنشاؤه بواسطة مبيت سفلي وغطاء ، كما هو موضح في الشكل 6 أ. بعد ذلك ، يتم إدخال وحدة التدفق ، التي تتضمن قناة صغيرة ومنافذ وصول ، في بئر الوحدة الأساسية. يتم إغلاق وحدة التدفق بإحكام ضد طبقة دعم السيليكون للغشاء بسب.......
الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة عملية لدمج قدرات التدفق في منصة بئر مفتوحة تتميز بغشاء نانوي فائق النحافة. في هذا التصميم ، يتم استخدام نهج الإغلاق المغناطيسي ، مما يسمح بالتبديل بين أوضاع البئر المفتوحة والسائلة أثناء التجارب والجمع بين مزايا كلا النهجين. على عكس المنصات التقليدي.......
J.L.M. هو أحد مؤسسي شركة SiMPore، Inc. ويمتلك حصة في الشركة. تقوم SiMPore بتسويق التقنيات القائمة على السيليكون فائقة النحافة ، بما في ذلك الأغشية المستخدمة في هذه الدراسة.
تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل المعهد الوطني للصحة تحت أرقام الجوائز R43GM137651 و R61HL154249 و R16GM146687 و NSF منحة CBET 2150798. يشكر المؤلفون RIT Machine Shop لتصنيع قوالب الألومنيوم. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved