A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منصة زراعة الخلايا القائمة على الغشاء القابلة لإعادة التكوين والتي تدمج تنسيق البئر المفتوح مع قدرات تدفق السوائل. تتوافق هذه المنصة مع البروتوكولات القياسية وتسمح بالانتقال القابل للانعكاس بين أوضاع زراعة البئر المفتوحة والمستنبتات الدقيقة ، مما يلبي احتياجات كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.

Abstract

الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة هي منصات مصغرة لزراعة الخلايا تستخدم لتقليد بنية ووظيفة الأنسجة البشرية في بيئة المختبر. ومع ذلك ، لم تكتسب هذه المنصات اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية حيث تعمل الأساليب القائمة على الأغشية المفتوحة كمعيار ذهبي لمحاكاة حواجز الأنسجة ، على الرغم من افتقارها إلى قدرات تدفق السوائل. يمكن أن تعزى هذه المشكلة في المقام الأول إلى عدم توافق الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة الحالية مع البروتوكولات والأدوات القياسية المطورة لأنظمة الآبار المفتوحة.

هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء منصة قائمة على الغشاء قابلة لإعادة التشكيل مع هيكل بئر مفتوح ، وقدرة على تحسين التدفق ، والتوافق مع البروتوكولات التقليدية. يستخدم هذا النظام نهج التجميع المغناطيسي الذي يتيح التبديل العكسي بين أوضاع البئر المفتوحة وأوضاع الموائع الدقيقة. باستخدام هذا النهج ، يتمتع المستخدمون بالمرونة لبدء تجربة بتنسيق البئر المفتوح باستخدام البروتوكولات القياسية وإضافة أو إزالة إمكانات التدفق حسب الحاجة. لإثبات الاستخدام العملي لهذا النظام وتوافقه مع التقنيات القياسية ، تم إنشاء طبقة أحادية الخلية البطانية في شكل بئر مفتوح. تمت إعادة تشكيل النظام لإدخال تدفق السوائل ثم تم تحويله إلى تنسيق البئر المفتوح لإجراء تلطيخ المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي. نظرا لتوافقه مع بروتوكولات الآبار المفتوحة التقليدية وقدرة تحسين التدفق ، من المتوقع أن يتم اعتماد هذا التصميم القابل لإعادة التكوين من قبل كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.

Introduction

تعمل الحواجز الوعائية كواجهة مهمة تفصل حجرة الدم عن الأنسجة المحيطة. إنها تلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن من خلال جذب الخلايا المناعية ، والتحكم في النفاذية الجزيئية ، والحماية من تسلل مسببات الأمراض إلى الأنسجة 1,2. تم تطوير نماذج الاستزراع في المختبر لمحاكاة البيئة المكروية في الجسم الحي ، مما يتيح إجراء تحقيقات منهجية في العوامل والظروف التي تؤثر على خصائص الحاجز في كل من الحالات الصحية والمريضة 3,4.

النهج الأكثر استخداما لنماذج الاستزراع هذه هو تكوين "البئر المفتوح"الشبيه ب Transwell....

Protocol

يمكن استخدام هذا التصميم في أوضاع مختلفة بناء على المتطلبات التجريبية وتفضيلات المستخدم النهائي. قبل كل تجربة ، راجع مخطط تدفق القرار المعروض في الشكل 2 لتحديد الخطوات والوحدات اللازمة للبروتوكول. على سبيل المثال ، إذا كان المستخدم ينوي الحفاظ على تنسيق البئر المفتوح خلال التجربة لمقارنته مباشرة بنظام من نوع Transwell ، فإن استنسل الزخرفة غير مطلوب لبذر الخلية. الوحدة الأساسية متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، ويمكن اختيار الغشاء النانوي فائق النحافة من مكتبة المواد ذات المسامية وأحجام المسام المختلفة لتناسب الاحتياجات التجريبية.

1. تصنيع استنسل الزخرفة

النتائج

يتم وضع الوحدة الأساسية المفتوحة في البداية داخل تجويف معين تم إنشاؤه بواسطة مبيت سفلي وغطاء ، كما هو موضح في الشكل 6 أ. بعد ذلك ، يتم إدخال وحدة التدفق ، التي تتضمن قناة صغيرة ومنافذ وصول ، في بئر الوحدة الأساسية. يتم إغلاق وحدة التدفق بإحكام ضد طبقة دعم السيليكون للغشاء بسب.......

Discussion

الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة عملية لدمج قدرات التدفق في منصة بئر مفتوحة تتميز بغشاء نانوي فائق النحافة. في هذا التصميم ، يتم استخدام نهج الإغلاق المغناطيسي ، مما يسمح بالتبديل بين أوضاع البئر المفتوحة والسائلة أثناء التجارب والجمع بين مزايا كلا النهجين. على عكس المنصات التقليدي.......

Disclosures

J.L.M. هو أحد مؤسسي شركة SiMPore، Inc. ويمتلك حصة في الشركة. تقوم SiMPore بتسويق التقنيات القائمة على السيليكون فائقة النحافة ، بما في ذلك الأغشية المستخدمة في هذه الدراسة.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل المعهد الوطني للصحة تحت أرقام الجوائز R43GM137651 و R61HL154249 و R16GM146687 و NSF منحة CBET 2150798. يشكر المؤلفون RIT Machine Shop لتصنيع قوالب الألومنيوم. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubesLanger InstrumentsWX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra MiltexVWR95039-090
1x PBS 7.4 pHThermoFisher Scientific10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIPJensen GlobalJG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIPJensen GlobalJG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)DigiKey3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)DigiKey3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidinThermoFisher ScientificA12379 
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 gVWRAAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic SheetMcMaster-Carr8560K17112" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic SheetMcMaster-Carr8589K3112" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic SheetMcMaster-Carr8560K19112" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mgCorning47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mmVWR10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KITEllsworth Adhesives4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fixture A1&A2SiMPore Inc.NA
Fixture B1&B2SiMPore Inc.NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorThermo Fisher Scientific4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)ThermoFisher ScientificC0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)Thermo Fisher ScientificR37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)K&J MagneticsD313/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa AesarFisher Scientificaa47392-9M
Peristaltic PumpLanger InstrumentsBQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solutionFisher ScientificNC9901158
PVDF syringe filtersPerkinElmer2542913
Silicon waferUniversity wafer,USA1196
SU-8 3050Fisher ScientificNC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)ThermoFisher Scientific4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, SterileVWR100500-422
TRI-reagentThermoFisher ScientificAM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane ChipSiMPore Inc.NPSN100-1LThe design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1SiMPore Inc.NA
uSiM component 2SiMPore Inc.NA

References

  1. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
  2. Vera, D., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved