تحويل نماذج أنسجة الحاجز الثابت إلى أنظمة فسيولوجية دقيقة ديناميكية

Summary

يصف هذا البروتوكول منصة زراعة الخلايا القائمة على الغشاء القابلة لإعادة التكوين والتي تدمج تنسيق البئر المفتوح مع قدرات تدفق السوائل. تتوافق هذه المنصة مع البروتوكولات القياسية وتسمح بالانتقال القابل للانعكاس بين أوضاع زراعة البئر المفتوحة والمستنبتات الدقيقة ، مما يلبي احتياجات كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.

Abstract

الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة هي منصات مصغرة لزراعة الخلايا تستخدم لتقليد بنية ووظيفة الأنسجة البشرية في بيئة المختبر. ومع ذلك ، لم تكتسب هذه المنصات اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية حيث تعمل الأساليب القائمة على الأغشية المفتوحة كمعيار ذهبي لمحاكاة حواجز الأنسجة ، على الرغم من افتقارها إلى قدرات تدفق السوائل. يمكن أن تعزى هذه المشكلة في المقام الأول إلى عدم توافق الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة الحالية مع البروتوكولات والأدوات القياسية المطورة لأنظمة الآبار المفتوحة.

هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء منصة قائمة على الغشاء قابلة لإعادة التشكيل مع هيكل بئر مفتوح ، وقدرة على تحسين التدفق ، والتوافق مع البروتوكولات التقليدية. يستخدم هذا النظام نهج التجميع المغناطيسي الذي يتيح التبديل العكسي بين أوضاع البئر المفتوحة وأوضاع الموائع الدقيقة. باستخدام هذا النهج ، يتمتع المستخدمون بالمرونة لبدء تجربة بتنسيق البئر المفتوح باستخدام البروتوكولات القياسية وإضافة أو إزالة إمكانات التدفق حسب الحاجة. لإثبات الاستخدام العملي لهذا النظام وتوافقه مع التقنيات القياسية ، تم إنشاء طبقة أحادية الخلية البطانية في شكل بئر مفتوح. تمت إعادة تشكيل النظام لإدخال تدفق السوائل ثم تم تحويله إلى تنسيق البئر المفتوح لإجراء تلطيخ المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي. نظرا لتوافقه مع بروتوكولات الآبار المفتوحة التقليدية وقدرة تحسين التدفق ، من المتوقع أن يتم اعتماد هذا التصميم القابل لإعادة التكوين من قبل كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.

Introduction

تعمل الحواجز الوعائية كواجهة مهمة تفصل حجرة الدم عن الأنسجة المحيطة. إنها تلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن من خلال جذب الخلايا المناعية ، والتحكم في النفاذية الجزيئية ، والحماية من تسلل مسببات الأمراض إلى الأنسجة ^1,2. تم تطوير نماذج الاستزراع في المختبر لمحاكاة البيئة المكروية في الجسم الحي ، مما يتيح إجراء تحقيقات منهجية في العوامل والظروف التي تؤثر على خصائص الحاجز في كل من الحالات الصحية والمريضة ^3,4.

النهج الأكثر استخداما لنماذج الاستزراع هذه هو تكوين "البئر المفتوح"^الشبيه ب Transwell....

Protocol

يمكن استخدام هذا التصميم في أوضاع مختلفة بناء على المتطلبات التجريبية وتفضيلات المستخدم النهائي. قبل كل تجربة ، راجع مخطط تدفق القرار المعروض في الشكل 2 لتحديد الخطوات والوحدات اللازمة للبروتوكول. على سبيل المثال ، إذا كان المستخدم ينوي الحفاظ على تنسيق البئر المفتوح خلال التجربة لمقارنته مباشرة بنظام من نوع Transwell ، فإن استنسل الزخرفة غير مطلوب لبذر الخلية. الوحدة الأساسية متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، ويمكن اختيار الغشاء النانوي فائق النحافة من مكتبة المواد ذات المسامية وأحجام المسام المختلفة لتناسب الاحتياجات التجريبية.

1. تصنيع استنسل الزخرفة

النتائج

يتم وضع الوحدة الأساسية المفتوحة في البداية داخل تجويف معين تم إنشاؤه بواسطة مبيت سفلي وغطاء ، كما هو موضح في الشكل 6 أ. بعد ذلك ، يتم إدخال وحدة التدفق ، التي تتضمن قناة صغيرة ومنافذ وصول ، في بئر الوحدة الأساسية. يتم إغلاق وحدة التدفق بإحكام ضد طبقة دعم السيليكون للغشاء بسب.......

Discussion

الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة عملية لدمج قدرات التدفق في منصة بئر مفتوحة تتميز بغشاء نانوي فائق النحافة. في هذا التصميم ، يتم استخدام نهج الإغلاق المغناطيسي ، مما يسمح بالتبديل بين أوضاع البئر المفتوحة والسائلة أثناء التجارب والجمع بين مزايا كلا النهجين. على عكس المنصات التقليدي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA