הפיכת מודלים של רקמת מחסום סטטי למערכות מיקרופיזיולוגיות דינמיות

Summary

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת תרבית תאים מבוססת קרום הניתנת להגדרה מחדש המשלבת את פורמט הבאר הפתוחה עם יכולות זרימת נוזלים. פלטפורמה זו תואמת לפרוטוקולים סטנדרטיים ומאפשרת מעברים הפיכים בין מצבי תרבית פתוחה ומיקרופלואידית, תוך מתן מענה לצרכים של מעבדות הנדסה וביו-מדע כאחד.

Abstract

מערכות מיקרופיזיולוגיות הן פלטפורמות ממוזערות של תרביות תאים המשמשות לחיקוי המבנה והתפקוד של רקמות אנושיות בתנאי מעבדה. עם זאת, פלטפורמות אלה לא זכו לאימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות שבהן גישות פתוחות מבוססות ממברנה משמשות כתקן הזהב לחיקוי מחסומי רקמות, למרות שאין להן יכולות זרימת נוזלים. בעיה זו ניתן לייחס בעיקר את חוסר התאימות של מערכות מיקרופיזיולוגיות קיימות עם פרוטוקולים סטנדרטיים וכלים שפותחו עבור מערכות באר פתוחה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פלטפורמה מבוססת ממברנה הניתנת להגדרה מחדש עם מבנה באר פתוחה, יכולת שיפור זרימה ותאימות לפרוטוקולים קונבנציונליים. מערכת זו משתמשת בגישת הרכבה מגנטית המאפשרת מעבר הפיך בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד. בגישה זו, למשתמשים יש את הגמישות להתחיל ניסוי בפורמט באר פתוחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ולהוסיף או להסיר יכולות זרימה לפי הצורך. כדי להדגים את השימוש המעשי במערכת זו ואת התאמתה לטכניקות סטנדרטיות, הוקמה מונושכבה של תאי אנדותל בפורמט פתוח. המערכת הוגדרה מחדש כדי להכניס זרימת נוזלים ולאחר מכן עברה לפורמט באר פתוחה כדי לבצע אימונוסטיין ומיצוי RNA. בשל תאימותו לפרוטוקולי באר פתוחה קונבנציונליים ויכולת שיפור זרימה, תכנון זה הניתן להגדרה מחדש צפוי להיות מאומץ הן על ידי מעבדות הנדסה והן על ידי מעבדות ביו-מדעיות.

Introduction

מחסומי כלי הדם משמשים כממשק קריטי המפריד בין תא הדם לרקמה הסובבת אותו. הם ממלאים תפקיד קריטי בשימור הומאוסטזיס על ידי משיכת תאים חיסוניים, שליטה בחדירות מולקולרית והגנה מפני חדירת פתוגנים לרקמה ^1,2. מודלים של תרביות חוץ גופיות פותחו כדי לחקות את המיקרו-סביבה in vivo, ומאפשרים חקירות שיטתיות של הגורמים והתנאים המשפיעים על תכונות המחסום במצבים בריאים וחולים^{כאחד 3,4}.

הגישה הנפוצה ביותר עבור מודלים כאלה של תרביות היא תצורת "באר פתוחה"⁵ דמוית Transwell, שבה קרום תרבית נקבובי חרוט מסילה מפריד בין ת....

Protocol

ניתן להשתמש בעיצוב זה במצבים שונים בהתבסס על דרישות ניסיוניות והעדפות משתמש הקצה. לפני כל ניסוי, עיין בתרשים זרימת ההחלטות המוצג באיור 2 כדי לקבוע את השלבים והמודולים הדרושים עבור הפרוטוקול. לדוגמה, אם המשתמש מתכוון לשמור על תבנית הבאר הפתוחה במהלך ניסוי כדי להשוות אותה ישירות למערכת מסוג Transwell, הסטנסיל של תבנית אינו נדרש לזריעת תאים. מודול הליבה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), וניתן לבחור את הננוממברנה הדקה במיוחד מתוך ספרייה של חומרים עם נקבוביות וגדלי נקבוביות שונים כדי להתאים לצרכים ניסיוניים.

1. ייצור שבלונה של דוגמאות

הערה: שבלונה של תבניות מש....

תוצאות

מודול הליבה הפתוח ממוקם בתחילה בתוך חלל ספציפי שנוצר על-ידי בית תחתון וכיסוי, כפי שמודגם באיור 6A. לאחר מכן, מודול הזרימה, הכולל מיקרו-ערוץ ויציאות גישה, מוכנס לבאר של מודול הליבה. מודול הזרימה אטום היטב כנגד שכבת התמיכה בסיליקון של הממברנה עקב כוח המשיכה המגנטי בין מגנטים המ.......

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא לפתח שיטה מעשית לשילוב יכולות זרימה בפלטפורמת באר פתוחה הכוללת ננו-ממברנה דקה במיוחד. בתכנון זה נעשה שימוש בגישת הצמדה מגנטית, המאפשרת מעבר בין מצב באר פתוחה למצב זורם במהלך ניסויים ושילוב היתרונות של שתי הגישות. שלא כמו פלטפורמות קונבנציונליות מלוכדות לצמיתות, הצמדה.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA