정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

요약

이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.

초록

미세생리학적 시스템은 실험실 환경에서 인간 조직의 구조와 기능을 모방하는 데 사용되는 소형 세포 배양 플랫폼입니다. 그러나 이러한 플랫폼은 유체 흐름 기능이 부족함에도 불구하고 개방형 웰, 멤브레인 기반 접근 방식이 조직 장벽을 모방하기 위한 황금 표준 역할을 하는 생명 과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다. 이 문제는 주로 기존 미세생리학 시스템과 개방형 웰 시스템용으로 개발된 표준 프로토콜 및 도구의 비호환성에 기인할 수 있습니다.

여기에서는 개방형 웰 구조, 흐름 향상 기능 및 기존 프로토콜과의 호환성을 갖춘 재구성 가능한 멤브레인 기반 플랫폼을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 오픈 웰과 미세유체 모드 간의 가역적 전환을 가능하게 하는 자기 조립 방식을 활용합니다. 이 접근 방식을 통해 사용자는 표준 프로토콜을 사용하여 개방형 웰 형식으로 실험을 시작하고 필요에 따라 흐름 기능을 추가하거나 제거할 수 있는 유연성을 갖게 됩니다. 이 시스템의 실제 사용과 표준 기술과의 호환성을 입증하기 위해 내피 세포 단층이 개방형 웰 형식으로 설정되었습니다. 유체 흐름을 도입하도록 시스템을 재구성한 다음 면역염색 및 RNA 추출을 수행하기 위해 개방형 웰 형식으로 전환했습니다. 기존의 개방형 웰 프로토콜과의 호환성 및 흐름 향상 기능으로 인해 이 재구성 가능한 설계는 엔지니어링 및 생명과학 실험실 모두에서 채택될 것으로 예상됩니다.

서문

혈관 장벽은 주변 조직으로부터 혈액 구획을 분리하는 중요한 인터페이스 역할을 합니다. 이들은 면역 세포를 끌어당기고, 분자 투과성을 조절하며, 병원균이 조직으로 침입하는 것을 막아 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 ^1,2. in vitro 배양 모델은 in vivo 미세환경을 모방하기 위해 개발되어 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 장벽 특성에 영향을 미치는 요인과 조건에 대한 체계적인 조사를 가능하게 합니다 ^3,4.

이러한 배양 모델에 가장 널리 사용되는 접근법은 트랜스웰(Transwell)과 같은 "open-well" 구성(open-well) 구성⁵으로, 다공성의 트랙 에칭 배양막이 배지로 채워진 구획을 분리합니다(그림 1A). 이 형식에서는 세포막의 양쪽에 세포를 파종할 수 있으며 광범위한 실험 프로토콜이 개발되었습니다. 그러나, 이들 시스템은 장벽 성숙을 지원하고 생체 내

프로토콜

이 설계는 실험 요구 사항과 최종 사용자의 선호도에 따라 다양한 모드에서 사용할 수 있습니다. 각 실험 전에 그림 2 에 제시된 의사 결정 흐름도를 참조하여 프로토콜에 필요한 단계와 모듈을 결정하십시오. 예를 들어, 사용자가 Transwell 유형 시스템과 직접 비교하기 위해 실험 전반에 걸쳐 오픈 웰 형식을 유지하려는 경우 세포 파종에 패터닝 스텐실이 필요하지 않습니다. 코어 모듈은 상업적으로 이용 가능하며( 재료 표 참조), 초박형 나노멤브레인은 실험 요구 사항에 맞게 다공성 및 기공 크기가 다른 재료 라이브러리에서 선택할 수 있습니다.

1. 패터닝 스텐실 제작

참고: 패터닝 스텐실은 세포를 멤브레인 칩의 다공성 영역에만 배치하는 역할을 하며, 플로우 모듈이^추가된 후 잠재적으로 손상을 경험할 수 있는 주변 실리콘 층에 셀이 침전되는 것을 방지합니다( 그림 3 참조). 단층의 손상은 장벽 무결성에 부정적인 영향을 미치고 실험 결과를 손상시킬 수 있습니다. 스텐실은 손상 위험이 없으므로 개....

토론

이 프로토콜의 목적은 초박형 나노멤브레인을 특징으로 하는 개방형 웰 플랫폼에 유동 기능을 통합하기 위한 실용적인 방법을 개발하는 것입니다. 이 설계에서는 자기 래칭 접근 방식이 사용되어 실험 중에 오픈 웰 모드와 유체 모드 사이를 전환하고 두 접근 방식의 장점을 결합할 수 있습니다. 종래의 영구적으로 결합된 플랫폼과는 달리, 마그네틱 래칭은 플랫폼이 실험 워크플로우(^{16,25,26,27.......}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA