정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

요약

이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.

초록

미세생리학적 시스템은 실험실 환경에서 인간 조직의 구조와 기능을 모방하는 데 사용되는 소형 세포 배양 플랫폼입니다. 그러나 이러한 플랫폼은 유체 흐름 기능이 부족함에도 불구하고 개방형 웰, 멤브레인 기반 접근 방식이 조직 장벽을 모방하기 위한 황금 표준 역할을 하는 생명 과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다. 이 문제는 주로 기존 미세생리학 시스템과 개방형 웰 시스템용으로 개발된 표준 프로토콜 및 도구의 비호환성에 기인할 수 있습니다.

여기에서는 개방형 웰 구조, 흐름 향상 기능 및 기존 프로토콜과의 호환성을 갖춘 재구성 가능한 멤브레인 기반 플랫폼을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 오픈 웰과 미세유체 모드 간의 가역적 전환을 가능하게 하는 자기 조립 방식을 활용합니다. 이 접근 방식을 통해 사용자는 표준 프로토콜을 사용하여 개방형 웰 형식으로 실험을 시작하고 필요에 따라 흐름 기능을 추가하거나 제거할 수 있는 유연성을 갖게 됩니다. 이 시스템의 실제 사용과 표준 기술과의 호환성을 입증하기 위해 내피 세포 단층이 개방형 웰 형식으로 설정되었습니다. 유체 흐름을 도입하도록 시스템을 재구성한 다음 면역염색 및 RNA 추출을 수행하기 위해 개방형 웰 형식으로 전환했습니다. 기존의 개방형 웰 프로토콜과의 호환성 및 흐름 향상 기능으로 인해 이 재구성 가능한 설계는 엔지니어링 및 생명과학 실험실 모두에서 채택될 것으로 예상됩니다.

서문

혈관 장벽은 주변 조직으로부터 혈액 구획을 분리하는 중요한 인터페이스 역할을 합니다. 이들은 면역 세포를 끌어당기고, 분자 투과성을 조절하며, 병원균이 조직으로 침입하는 것을 막아 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다 ^1,2. in vitro 배양 모델은 in vivo 미세환경을 모방하기 위해 개발되어 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 장벽 특성에 영향을 미치는 요인과 조건에 대한 체계적인 조사를 가능하게 합니다 ^3,4.

이러한 배양 모델에 가장 널리 사용되는 접근법은 트랜스웰(Transwell)과 같은 "open-well" 구성(open-well) 구성⁵으로, 다공성의 트랙 에칭 배양막이 배지로 채워진 구획을 분리합니다(그림 1A). 이 형식에서는 세포막의 양쪽에 세포를 파종할 수 있으며 광범위한 실험 프로토콜이 개발되었습니다. 그러나, 이들 시스템은 장벽 성숙을 지원하고 생체 내 ^5,6에서 볼 수 있는 면역 세포 순환을 모방하는 데 필수적인 유체 흐름을 제공하는 능력에 한계가 있다. 따라서 약물 투여량, 기계적 자극 또는 유체 유도 전단 응력 ^6,7,8을 도입하는 동적 흐름이 필요한 연구에는 사용할 수 없습니다.

개방형 웰 시스템의 한계를 극복하기 위해 다공성 배양막과 개별적으로 주소 지정이 가능한 유체 채널을 결합한 미세유체 플랫폼이 개발되었습니다⁹. 이 플랫폼은 유체 라우팅, 관류 및 화합물 도입, 제어된 전단 자극 및 동적 세포 추가 기능에 대한 정밀한 제어를 제공합니다 7,10,11,12,13. 미세유체 플랫폼이 제공하는 고급 기능에도 불구하고 복잡한 미세유체 프로토콜과 확립된 실험 워크플로와의 비호환성으로 인해 생명과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다 ^4,10,14.

이러한 기술 간의 격차를 해소하기 위해 당사는 자기적으로 재구성 가능한 모듈 기반 시스템을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 실험의 특정 요구 사항에 따라 개방형 웰 모드와 미세유체 모드 사이를 쉽게 전환할 수 있습니다. 이 플랫폼은 100nm 두께의 배양막(나노막)이 있는 m-μSiM(실리콘 멤브레인에 의해 활성화되는 모듈식 미세생리학 시스템)으로 알려진 개방형 웰 장치를 갖추고 있습니다. 이 나노멤브레인은 그림 1B와 같이 높은 다공성(15%)과 유리와 같은 투명도를 가지고 있습니다. 상부 구획을 하부 채널로부터 물리적으로 분리하여, 생리학적 길이 척도¹⁵를 가로지르는 분자 수송을 허용한다. 명시야 이미징으로 살아있는 세포를 이미징하는 데 문제가 있는 것으로 알려진 기존의 트랙 에칭 멤브레인과 달리 나노멤브레인의 유리한 광학 및 물리적 특성은 멤브레인^표면 15,16,17의 양쪽에 있는 세포의 명확한 시각화를 가능하게 합니다.

본 프로토콜은 특수 시드 및 플로우 모듈의 제작을 간략하게 설명하고 플랫폼의 자기 재구성을 설명합니다. 정적 및 동적 조건 모두에서 내피 장벽을 구축하기 위해 플랫폼을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 시연은 내피 세포가 전단 자극 하에서 전단 민감성 유전자 표적의 상향 조절과 함께 흐름 방향을 따라 정렬됨을 보여줍니다.

프로토콜

이 설계는 실험 요구 사항과 최종 사용자의 선호도에 따라 다양한 모드에서 사용할 수 있습니다. 각 실험 전에 그림 2 에 제시된 의사 결정 흐름도를 참조하여 프로토콜에 필요한 단계와 모듈을 결정하십시오. 예를 들어, 사용자가 Transwell 유형 시스템과 직접 비교하기 위해 실험 전반에 걸쳐 오픈 웰 형식을 유지하려는 경우 세포 파종에 패터닝 스텐실이 필요하지 않습니다. 코어 모듈은 상업적으로 이용 가능하며( 재료 표 참조), 초박형 나노멤브레인은 실험 요구 사항에 맞게 다공성 및 기공 크기가 다른 재료 라이브러리에서 선택할 수 있습니다.

1. 패터닝 스텐실 제작

참고: 패터닝 스텐실은 세포를 멤브레인 칩의 다공성 영역에만 배치하는 역할을 하며, 플로우 모듈이^추가된 후 잠재적으로 손상을 경험할 수 있는 주변 실리콘 층에 셀이 침전되는 것을 방지합니다( 그림 3 참조). 단층의 손상은 장벽 무결성에 부정적인 영향을 미치고 실험 결과를 손상시킬 수 있습니다. 스텐실은 손상 위험이 없으므로 개방적이고 정적인 문화권에서는 필요하지 않습니다.

1. 추가 코딩 파일 1(그림 4A)에 제공된 설계를 사용하여 금형을 구입, 기계 가공 또는 3D 프린팅합니다.
   참고: 스텐실 벽은 미디어 용량을 늘리고 종횡비가 높은 직선 벽 기능에 비해 기포 트래핑을 최소화하기 위해 테이퍼링됩니다.
2. 콜드 롤러를 사용하여 130μm 감압 접착제(PSA) 필름을 3.2mm 아크릴 시트에 부착합니다( 재료 표 참조).
3. 보충 코딩 파일 2에 제공된 설계에 따라 아크릴 시트를 레이저로 절단하여 캐비티 배열을 만들었습니다(그림 4B).
4. PSA 필름에서 보호층을 떼어내고 아크릴 시트를 금형에 부착합니다.
   알림: 금형 형상이 캐비티 중앙에 오도록 레이저 절단 시트가 금형과 정렬되었는지 확인합니다(그림 4C). 멤브레인에서 셀 위치 지정의 정확도는 이 단계에 따라 달라집니다.
5. PDMS 프리폴리머를 완전히 혼합하고(염기 대 촉매 비율 10:1 사용)( 재료 표 참조) 눈에 보이는 기포가 남지 않을 때까지 진공 챔버에서 가스를 제거합니다(5-15분).
6. PDMS를 금형 캐비티에 천천히 붓고 평평한 모서리로 수평을 맞춥니다.
   알림: 기포 포착을 방지하려면 PDMS를 각 캐비티에 천천히 붓습니다. 붓은 후에도 기포가 생기면 금형을 진공 챔버에 넣고 다시 가스를 제거하십시오.
7. PDMS를 70°C의 핫플레이트에서 1시간 동안 경화한 다음 실온으로 냉각합니다.
8. 끝이 납작한 핀셋을 사용하여 금형 캐비티에서 스텐실을 추출합니다.

2. 플로우 모듈의 제작

참고: 유량 모듈은 코어 모듈의 클로버 모양 웰과 유사한 설치 공간을 공유하며 성형된 마이크로 채널(너비 = 1.5mm, 높이 = 0.2mm, 길이 = 5mm)을 포함합니다. 클로버 모양은 다공성 배양 영역 위에 채널을 정렬하는 데 도움이 됩니다(그림 5).

1. 표준 소프트 리소그래피 기법(¹⁸ )을 이용하여, 보충 코딩 파일 3 (도 4D)에 제공된 설계에 의해 정의된 특징들을 갖는 실리콘 몰드를 생성한다.
2. 130μm PSA 필름을 3.2mm 두께의 아크릴 시트에 부착합니다.
3. 보충 코딩 파일 4에 제공된 디자인을 기반으로 아크릴 시트를 레이저로 절단하여 클로버 모양의 공동 어레이를 만들었습니다(그림 4E).
   알림: 캐비티의 높이는 플로우 모듈의 높이를 결정하며, 적절한 밀봉을 위해 코어 모듈 웰의 높이보다 약간 더 높아야 합니다(0-0.1mm).
4. PSA 필름에서 보호층을 제거한 다음 실리콘 몰드의 삼각형 정렬 표시를 레이저 커팅 시트의 정렬 표시와 정렬하여 레이저 커팅 시트를 실리콘 몰드에 부착합니다.
   알림: 1.4단계와 유사하게 레이저 절단 아크릴 시트가 실리콘 몰드와 정렬되어 몰드 형상이 각 캐비티 중앙에 오도록 합니다(그림 4F). 이 단계는 풋프린트를 기준으로 마이크로채널의 위치를 결정합니다.
5. 가스가 제거된 PDMS를 금형 캐비티에 천천히 붓고 평평한 모서리로 수평을 맞춥니다.
   알림: 붓은 후 기포가 있으면 기포가 제거될 때까지 곰팡이의 가스를 제거하십시오.
6. 금형을 열판에 놓고 PDMS를 70°C에서 1시간 동안 구운 다음 금형을 실온으로 식힙니다.
7. 끝이 납작한 핀셋을 사용하여 금형 캐비티에서 흐름 모듈을 조심스럽게 제거합니다.
8. 마이크로 채널 형상이 위쪽을 향하도록 흐름 모듈의 방향을 지정하고 생검 펀치를 사용하여 코어 입구 및 출구 포트를 채널 끝에 배치합니다( 재료 표 참조).

3. 하부 및 상부 아크릴 하우징 제작

알림: 코어 모듈은 하단 하우징에 맞습니다. 하우징에 내장된 자석 사이의 인력은 유량 모듈을 코어 모듈로 압축하고 밀봉합니다(그림 6).

1. 보충 코딩 파일 2에 제공된 디자인을 사용하여 5mm 아크릴 시트를 레이저로 절단하여 자석 삽입을 위한 구멍이 있는 상부 하우징을 만듭니다.
2. 130μm PSA 필름을 3.5mm 아크릴 시트에 부착합니다.
3. Supplementary Coding File 6에 제공된 디자인에 따라 아크릴 시트를 레이저로 절단하여 자석 삽입을 위한 구멍이 있는 하부 하우징을 만듭니다.
   알림: 하부 하우징의 두께는 중요한 매개변수이며 흐름 중 누출을 방지하기 위해 코어 모듈의 전체 두께와 일치해야 합니다.
4. PSA 보호층을 제거하고 하부 하우징을 유리 커버슬립에 부착합니다.
5. 4.75mm 니켈 도금 네오디뮴 자석( 재료 표 참조)을 하우징의 레이저 절단 구멍에 압입합니다.
   알림: 하부 및 상부 하우징의 자석이 반대 극성으로 배치되어 자기 인력을 보장하는지 확인합니다(그림 6).

4. 유량 회로의 제작

참고: 폐쇄 루프 흐름 회로에는 저장소로 두 개의 샘플 수집 바이알이 포함되어 있습니다(그림 7). 입구 저장소에는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 필터가 있어 세포 배지가 인큐베이터의_CO2 농도와 평형을 이룰 수 있습니다.

1. 1mm 생검 펀치를 사용하여 검체 채취 바이알의 뚜껑에 두 개의 구멍을 만듭니다.
2. 생검 펀치를 사용하여 별도의 검체 채취 바이알의 캡에 두 개의 구멍(1mm 및 4mm)을 만들고 이 바이알의 하부에 1mm 구멍을 만듭니다.
3. 20mm 구멍 각각에 1G 디스펜싱 팁을 삽입하고 뜨거운 접착제로 밀봉합니다.
4. 0.22mm 구멍에 4μm PVDF 필터( 재료 표 참조)를 놓고 뜨거운 접착제로 밀봉합니다.
5. 보충 코딩 파일 7에 제공된 디자인을 사용하여 1.5mm 아크릴 시트를 레이저로 절단하여 샘플 홀딩 스테이지를 만듭니다.
6. 아크릴 스테이지에 저장소를 배치합니다.
7. 마이크로 플로우 튜브를 사용하여 디스펜싱 팁을 연결합니다( 재료 표 참조).
8. 21G 디스펜싱 팁을 사용하여 튜브를 유량 모듈의 입구와 출구에 연결합니다.
9. 흐름 순환을 위해 연동 펌프( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
   알림: 원하는 경우 주사기 또는 공압 펌프를 사용하여 흐름을 도입할 수도 있습니다. 유속은 실험적 필요에 따라 결정되어야 합니다. 실험적으로 검증된 COMSOL 모델에서 파생된 포괄적인 표가 보충 표 1 에 제공되어 사용자가 셀 단층(¹⁶)에서 원하는 전단 응력을 달성하는 데 필요한 유량을 선택하는 데 도움을 줍니다.

5. 세포 파종

참고: 기존의 멤브레인 인서트와 유사하게, 다양한 세포 유형을 나노멤브레인에서 배양할 수 있습니다. 2차 세포 유형은 또한 하부 채널⁽¹⁵)에서 막의 다른 쪽에서 공동배양될 수 있다.

1. 세포막에 5μg/^cm2 의 피브로넥틴( 재료 표 참조)을 실온에서 1시간 동안 코팅하여 세포 부착을 개선합니다.
   알림: 선택한 셀 유형은 필요한 코팅 및 셀 밀도에 영향을 줄 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC, 재료 표 참조)에 대한 것입니다.
2. P200 피펫을 사용하여 코팅 용액을 흡입하고 패터닝 스텐실을 코어 모듈 웰에 놓습니다.
3. 장치의 웰 및 하단 채널에 셀 미디어를 추가합니다.
4. 40,000 cells/^cm2 밀도의 HUVEC을 우물에 파종합니다.
   참고: 이 밀도의 HUVEC는 전형적으로 24시간의 배양^16,19 후에 합류 단층을 형성한다.
5. 장치를 페트리 접시에 놓습니다. 국소 습도를 유지하기 위해 DI 물이 담긴 15mL 원뿔형 튜브 캡을 페트리 접시에 추가합니다.
6. 페트리 접시를 인큐베이터로 옮깁니다.
   알림: 장치의 상단 웰과 하단 채널에 있는 셀 미디어는 24시간마다 교체해야 합니다. 하단 채널의 매체를 교체하려면 포트 중 하나에 새 매체를 부드럽게 삽입하여 다른 포트에서 기존 매체를 교체합니다.

6. 미세유체 모드로 재구성

1. 상부 하우징, 하부 하우징, 유량 모듈, 저장소, 튜브 및 디스펜싱 팁을 조립 전 30분 동안 UV 멸균 챔버에 넣어 멸균합니다. 70% 에탄올을 순환시킨 다음 유동 회로에서 멸균 PBS를 순환시킵니다.
2. 저장소와 튜브를 Endothelial Cell Growth 배지로 채웁니다( 재료 표 참조).
3. 샘플 스테이지에 하단 하우징을 놓습니다. 오픈 웰 코어 모듈을 하단 하우징에 삽입합니다.
4. 모듈의 웰에서 세포 배지를 흡입합니다. 흐름 모듈을 우물에 놓습니다.
5. 흐름 모듈을 코어 모듈 웰에 밀봉하기 위해 상부 하우징을 배치합니다. 입구 및 출구 디스펜싱 팁을 유량 모듈 포트에 연결합니다.
6. 연동 펌프를 시작하여 유체 흐름을 시스템에 도입합니다.

7. 흐름 도입 후 open-well 형식으로 다운스트림 분석 수행

참고: 여기서 배양 시간은 실험 목표에 따라 다릅니다. 사용자는 선호도에 따라 개방형 웰 또는 미세유체 형식으로 다운스트림 분석(예: 면역세포화학, RNA 추출)을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 개방형 웰 형식이 선호되는 경우, 시스템은 표준 프로토콜^16,19에 기초하여 분석을 수행하도록 재구성되어야 합니다.

1. 원하는 전단 유동 노출 시간에 도달하면 펌프를 중지하십시오. 입구 및 출구 디스펜싱 팁을 제거합니다.
2. 상부 하우징을 제거합니다. 핀셋을 사용하여 웰에서 흐름 모듈을 부드럽게 제거합니다.
3. 웰에 100μL의 셀 배지를 추가합니다. 표준 프로토콜에 따라 원하는 분석을 수행합니다.

결과

오픈 웰 코어 모듈은 처음에 그림 6A와 같이 하부 하우징과 커버슬립에 의해 생성된 특정 캐비티 내에 배치됩니다. 이어서, 마이크로채널과 액세스 포트를 포함하는 플로우 모듈이 코어 모듈의 웰에 삽입됩니다. 유량 모듈은 그림 6B와 같이 하부 하우징과 상부 하우징에 내장된 자석 사이의 자기 인력으로 인해 멤브레인의 실리콘 지지층에 대해 단단히 ...

토론

이 프로토콜의 목적은 초박형 나노멤브레인을 특징으로 하는 개방형 웰 플랫폼에 유동 기능을 통합하기 위한 실용적인 방법을 개발하는 것입니다. 이 설계에서는 자기 래칭 접근 방식이 사용되어 실험 중에 오픈 웰 모드와 유체 모드 사이를 전환하고 두 접근 방식의 장점을 결합할 수 있습니다. 종래의 영구적으로 결합된 플랫폼과는 달리, 마그네틱 래칭은 플랫폼이 실험 워크플로우(^{16,25,26,27...}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA