Statik Bariyer Doku Modellerinin Dinamik Mikrofizyolojik Sistemlere Dönüştürülmesi

Özet

Bu protokol, açık kuyu formatını sıvı akış yetenekleriyle bütünleştiren yeniden yapılandırılabilir bir membran tabanlı hücre kültürü platformunu açıklar. Bu platform standart protokollerle uyumludur ve hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarlarının ihtiyaçlarını karşılayarak açık kuyu ve mikroakışkan kültür modları arasında tersine çevrilebilir geçişlere izin verir.

Özet

Mikrofizyolojik sistemler, laboratuvar ortamında insan dokularının yapısını ve işlevini taklit etmek için kullanılan minyatür hücre kültürü platformlarıdır. Bununla birlikte, bu platformlar, sıvı akış yeteneklerinden yoksun olmasına rağmen, açık kuyulu, membran tabanlı yaklaşımların doku bariyerlerini taklit etmek için altın standart olarak hizmet ettiği biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu sorun öncelikle mevcut mikrofizyolojik sistemlerin açık kuyu sistemleri için geliştirilen standart protokoller ve araçlarla uyumsuzluğuna bağlanabilir.

Burada, açık kuyu yapısına, akış geliştirme kabiliyetine ve geleneksel protokollerle uyumluluğa sahip yeniden yapılandırılabilir membran tabanlı bir platform oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, açık kuyu ve mikroakışkan modlar arasında tersine çevrilebilir geçiş sağlayan bir manyetik montaj yaklaşımı kullanır. Bu yaklaşımla kullanıcılar, standart protokolleri kullanarak açık kuyu biçiminde bir deneye başlama ve gerektiğinde akış özellikleri ekleme veya kaldırma esnekliğine sahip olur. Bu sistemin pratik kullanımını ve standart tekniklerle uyumluluğunu göstermek için, açık kuyu formatında bir endotel hücre tek tabakası oluşturulmuştur. Sistem, sıvı akışını sağlamak için yeniden yapılandırıldı ve daha sonra immün boyama ve RNA ekstraksiyonu yapmak için açık kuyu formatına geçildi. Konvansiyonel açık kuyu protokolleri ile uyumluluğu ve akış geliştirme kabiliyeti nedeniyle, bu yeniden yapılandırılabilir tasarımın hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarları tarafından benimsenmesi beklenmektedir.

Giriş

Vasküler bariyerler, kan bölmesini çevreleyen dokudan ayıran kritik bir arayüz görevi görür. Bağışıklık hücrelerini çekerek, moleküler geçirgenliği kontrol ederek ve patojenlerin dokuya girmesine karşı kalkan oluşturarak homeostazın korunmasında kritik bir rol oynarlar ^1,2. İn vivo mikroçevreyi taklit etmek için in vitro kültür modelleri geliştirilmiştir ve hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda bariyer özelliklerini etkileyen faktörlerin ve koşulların sistematik olarak araştırılmasını sağlar ^3,4.

Bu tür kültür modelleri için en yaygın kullanılan yaklaşım, gözenekli, iz ile kazınmış bir kültür zarının ortamla dolu bölmeleri ayırdığı Transwell benzeri "açık kuyu" konfigürasyonu^5'tir (Şekil 1A). Bu formatta, hücreler zarın her iki tarafına da ekilebilir ve çok çeşitli deneysel protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo ^5,6'da görülen bariyer olgunlaşmasını desteklemek ve bağışıklık hücresi dolaşımını taklit etmek için gerekli olan sıvı akışlarını sağlama yetenekleri bakımından sınırlıdır. Sonuç olarak, ilaç dozları, mekanik stimülasyon veya sıvı kaynaklı kesme gerilmeleri ^6,7,8 uygulayan dinamik akışlar gerektiren çalışmalar için kullanılamazlar.

Açık kuyu sistemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, gözenekli kültür membranlarını ayrı ayrı adreslenebilir akışkan kanallarla birleştiren mikroakışkan platformlar geliştirilmiştir⁹. Bu platformlar, sıvı yönlendirme, perfüzyon ve kimyasal bileşiklerin eklenmesi, kontrollü kesme stimülasyonu ve dinamik hücre ekleme yetenekleri üzerinde hassas kontrol sunar 7,10,11,12,13. Mikroakışkan platformlar tarafından sağlanan gelişmiş yeteneklere rağmen, karmaşık mikroakışkan protokoller ve yerleşik deneysel iş akışlarıyla uyumsuzlukları nedeniyle biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemişlerdir ^4,10,14.

Bu teknolojiler arasındaki boşluğu doldurmak için, manyetik olarak yeniden yapılandırılabilir, modül tabanlı bir sistem kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, deneyin özel ihtiyaçlarına göre açık kuyu ve mikroakışkan modları arasında kolayca değiştirilebilir. Platform, 100 nm kalınlığında bir kültür zarına (nanomembran) sahip m-μSiM (silikon membran tarafından etkinleştirilen modüler mikrofizyolojik sistem) olarak bilinen açık kuyulu bir cihaza sahiptir. Bu nanomembran, Şekil 1B'de gösterildiği gibi yüksek gözenekliliğe (% 15) ve cam benzeri şeffaflığa sahiptir. Üst bölmeyi bir alt kanaldan fiziksel olarak ayırır ve fizyolojik uzunluk ölçekleri¹⁵ boyunca moleküler taşımaya izin verir. Parlak alan görüntüleme ile canlı hücrelerin görüntülenmesinde bilinen zorluklara sahip olan geleneksel iz kazınmış membranların aksine, nanomembranın uygun optik ve fiziksel özellikleri, membran yüzeyinin her iki tarafındaki hücrelerin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar 15,16,17.

Mevcut protokol, özel tohumlama ve akış modüllerinin imalatını özetlemekte ve platformun manyetik olarak yeniden yapılandırılmasını açıklamaktadır. Platformun hem statik hem de dinamik koşullar altında endotel bariyerleri oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösterir. Bu gösteri, endotel hücrelerinin, kayma stimülasyonu altında kaymaya duyarlı gen hedeflerinin yukarı regülasyonu ile akış yönü boyunca hizalandığını ortaya koymaktadır.

Protokol

Bu tasarım, deneysel gereksinimlere ve son kullanıcının tercihlerine göre çeşitli modlarda kullanılabilir. Her deneyden önce, protokol için gerekli adımları ve modülleri belirlemek için Şekil 2'de sunulan karar akış şemasına bakın. Örneğin, kullanıcı bir deney boyunca Transwell tipi sistemle doğrudan karşılaştırmak için açık kuyu biçimini korumayı planlıyorsa, hücre tohumlama için desen şablonu gerekli değildir. Çekirdek modül ticari olarak temin edilebilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ultra ince nanomembran, deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde farklı gözeneklilik ve gözenek boyutlarına sahip bir malzeme kütüphanesinden seçilebilir.

1. Desen şablonunun imalatı

NOT: Desen şablonu, hücreleri yalnızca membran çipinin gözenekli bölgesine yerleştirmeye yarar ve hücrelerin, akış modülü eklendikten sonra potansiyel olarak hasar görebilecekleri çevreleyen silikon katmana yerleşmesini önler¹⁶ (bkz. Şekil 3). Tek katmanın hasar görmesi, bariyer bütünlüğünü olumsuz etkileyebilir ve deneysel sonuçları tehlikeye atabilir. Açık, statik bir kültürde şablon gereksizdir, çünkü hasar riski yoktur.

1. Ek Kodlama Dosyası 1'de (Şekil 4A) sağlanan tasarımı kullanarak bir kalıp satın alın, işleyin veya 3D yazdırın.
   NOT: Şablon duvarları, yüksek en-boy oranlı düz duvarlı özelliklere kıyasla ortam kapasitesini artırmak ve kabarcık sıkışmasını en aza indirmek için koniktir.
2. Soğuk bir rulo kullanarak 130 μm basınca duyarlı yapışkan (PSA) filmi 3.2 mm'lik bir akrilik levhaya yapıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).
3. Bir dizi boşluk oluşturmak için akrilik levhayı Ek Kodlama Dosyası 2'de sağlanan tasarıma göre lazerle kesin (Şekil 4B).
4. Koruyucu tabakayı PSA filminden soyun ve akrilik tabakayı kalıba yapıştırın.
   NOT: Kalıp özellikleri boşluk içinde ortalanacak şekilde lazerle kesilmiş tabakanın kalıpla hizalandığından emin olun (Şekil 4C). Zar üzerindeki hücre konumlandırmasının doğruluğu bu adıma bağlıdır.
5. PDMS prepolimerini iyice karıştırın (10:1 baz-katalizör oranı kullanarak) ( Malzeme Tablosuna bakın) ve görünür kabarcık kalmayana kadar (5-15 dakika) bir vakum odasında gazını alın.
6. PDMS'yi yavaşça kalıp boşluklarına dökün ve düz bir kenarla düzleştirin.
   NOT: Kabarcık sıkışmasını önlemek için PDMS'yi her boşluğa yavaşça dökün. Döküldükten sonra kabarcıklar varsa, kalıbı vakum odasına yerleştirin ve tekrar gazdan arındırın.
7. PDMS'yi bir ocak gözü üzerinde 70 °C'de 1 saat kürleyin ve ardından oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
8. Düz uçlu cımbız kullanarak kalıpları kalıp boşluklarından çıkarın.

2. Akış modülünün imalatı

NOT: Akış modülü, çekirdek modülün yonca şeklindeki kuyusu ile benzer bir ayak izini paylaşır ve kalıplanmış bir mikro kanal içerir (genişlik = 1.5 mm, yükseklik = 0.2 mm, uzunluk = 5 mm). Yonca şekli, kanalın gözenekli kültür bölgesi üzerinde hizalanmasına yardımcı olur (Şekil 5).

1. Ek Kodlama Dosyası ^{3'te (}Şekil 4D) sağlanan tasarım tarafından tanımlanan özelliklere sahip bir silikon kalıp oluşturmak için standart yumuşak litografi tekniklerini 18 kullanın.
2. 3,2 mm kalınlığında bir akrilik levhaya 130 μm PSA filmi yapıştırın.
3. Bir dizi yonca şeklindeki boşluk oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 4'te verilen tasarıma dayalı olarak akrilik levhayı lazerle kesin (Şekil 4E).
   NOT: Boşluğun yüksekliği, uygun sızdırmazlığı sağlamak için çekirdek modülün yüksekliğinden biraz daha uzun (0-0.1 mm) olması gereken akış modülünün yüksekliğini belirler.
4. Koruyucu tabakayı PSA filminden çıkarın ve ardından silikon kalıp üzerindeki üçgen hizalama işaretlerini lazer kesim tabakadakilerle hizalayarak lazer kesim tabakayı silikon kalıba yapıştırın.
   NOT: Adım 1.4'e benzer şekilde, lazerle kesilmiş akrilik levhanın, kalıp özellikleri her boşlukta ortalanacak şekilde silikon kalıpla hizalandığından emin olun (Şekil 4F). Bu adım, mikrokanalın ayak izine göre konumunu belirler.
5. Gazdan arındırılmış PDMS'yi kalıp boşluklarına yavaşça dökün ve düz bir kenarla düzleştirin.
   NOT: Döküldükten sonra kabarcıklar varsa, kabarcıklar çıkana kadar kalıbın gazını alın.
6. Kalıbı bir ocak gözüne yerleştirin ve PDMS'yi 70 °C'de 1 saat pişirin, ardından kalıbın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
7. Düz uçlu cımbız kullanarak akış modüllerini kalıp boşluklarından dikkatlice çıkarın.
8. Akış modülünü mikro kanal özellikleri yukarı bakacak şekilde yönlendirin ve bir biyopsi zımbası kullanarak çekirdek giriş ve çıkış portlarını kanalın sonuna yerleştirin (bkz.

3. Alt ve üst akrilik muhafazaların imalatı

NOT: Çekirdek modül alt muhafazaya sığar. Muhafazalardaki gömülü mıknatıslar arasındaki çekim, akış modülünü çekirdek modüle sıkıştırır ve sızdırmaz hale getirir (Şekil 6).

1. Mıknatıs yerleştirme delikleri olan üst muhafazayı oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 5'te sağlanan tasarımı kullanarak 2 mm'lik bir akrilik levhayı lazerle kesin.
2. 3,5 mm'lik bir akrilik levhaya 130 μm'lik bir PSA filmi yapıştırın.
3. Mıknatıs yerleştirme delikleri olan alt muhafazayı oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 6'da verilen tasarıma göre akrilik levhayı lazerle kesin.
   NOT: Alt muhafazanın kalınlığı kritik bir parametredir ve akış sırasında sızıntıyı önlemek için çekirdek modülün toplam kalınlığına uygun olmalıdır.
4. PSA koruyucu tabakayı çıkarın ve alt muhafazayı bir cam lamel üzerine takın.
5. 4,75 mm nikel kaplı neodimyum mıknatısları ( Malzeme Tablosuna bakın) muhafazaların lazerle kesilmiş deliklerine bastırın.
   NOT: Manyetik çekimi sağlamak için alt ve üst muhafazalardaki mıknatısların zıt kutuplarla yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 6).

4. Akış devresinin imalatı

NOT: Kapalı döngü akış devresi, rezervuar olarak iki numune toplama şişesi içerir (Şekil 7). Giriş rezervuarı, hücre ortamının inkübatördeki CO₂ konsantrasyonu ile dengelenmesini sağlamak için bir poliviniliden diflorür (PVDF) filtresine sahiptir.

1. Bir numune toplama şişesinin kapağında iki delik oluşturmak için 1 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın.
2. Ayrı bir numune toplama şişesinin kapağında iki delik (1 mm ve 4 mm) oluşturmak için biyopsi zımbaları kullanın ve bu şişenin alt kısmında 1 mm'lik bir delik oluşturun.
3. 20 mm'lik deliklerin her birine 1 G dağıtım ucu yerleştirin ve bunları sıcak tutkalla kapatın.
4. 4 mm'lik deliğe 0,22 μm'lik bir PVDF filtresi ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin ve sıcak tutkalla kapatın.
5. Bir numune tutma aşaması oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 7'de sağlanan tasarımı kullanarak 1,5 mm'lik bir akrilik levhayı lazerle kesin.
6. Rezervuarları akrilik tabla üzerine yerleştirin.
7. Mikro akış tüpleri kullanarak dağıtım uçlarını bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
8. 21 G dağıtım uçlarını kullanarak tüpleri akış modülünün giriş ve çıkışına bağlayın.
9. Akış sirkülasyonu için peristaltik bir pompa ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
   NOT: İstenirse akışı sağlamak için şırınga veya pnömatik pompalar da kullanılabilir. Akış hızı deneysel ihtiyaçlara göre belirlenmelidir. Deneysel olarak doğrulanmış bir COMSOL modelinden türetilen kapsamlı bir tablo, kullanıcıların hücre tek tabakası^16'da istenen kesme gerilimini elde etmek için gerekli akış hızını seçmelerine yardımcı olmak için Ek Tablo 1'de verilmiştir.

5. Hücre tohumlama

NOT: Geleneksel membran eklerine benzer şekilde, nanomembran üzerinde farklı hücre tipleri kültürlenebilir. İkincil bir hücre tipi, alt kanal^15'teki zarın diğer tarafında da birlikte kültürlenebilir.

1. Hücre yapışmasını iyileştirmek için membranı 5 μg /^cm2 fibronektin ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat.
   NOT: Seçilen hücre tipi, gerekli kaplamayı ve hücre yoğunluğunu etkileyebilir. Burada açıklanan prosedür, İnsan umbilikal ven endotel hücreleri içindir (HUVEC'ler, bkz.
2. Kaplama solüsyonunu bir P200 pipeti kullanarak aspire edin ve çekirdek modül kuyucuğuna bir desen şablonu yerleştirin.
3. Cihazın kuyusuna ve alt kanalına hücre ortamı ekleyin.
4. 40.000 hücre/^cm2 yoğunlukta HUVEC'leri kuyuya tohumlayın.
   NOT: Bu yoğunluktaki HUVEC'ler tipik olarak 24 saatlik inkübasyondan^{sonra birleşik} bir tek tabaka oluşturur ^16,19.
5. Cihazı bir Petri kabına yerleştirin. Yerel nemi korumak için Petri kabına DI su içeren 15 mL'lik bir konik tüp kapağı ekleyin.
6. Petri kabını inkübatöre aktarın.
   NOT: Cihazın üst kuyu ve alt kanalındaki hücre ortamı her 24 saatte bir değiştirilmelidir. Alt kanaldaki medyayı değiştirmek için, eski medyayı diğer porttan çıkarmak için portlardan birine yavaşça yeni medya enjekte edin.

6. Mikroakışkan moduna yeniden yapılandırma

1. Üst muhafazayı, alt muhafazayı, akış modülünü, rezervuarları, tüpleri ve dağıtım uçlarını montajdan önce 30 dakika boyunca bir UV sterilizasyon odasına yerleştirerek sterilize edin. Akış devresinde% 70 etanol ve ardından steril PBS dolaştırın.
2. Rezervuarları ve tüpleri Endotel Hücre Büyüme ortamı ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Alt muhafazayı s'ye yerleştirinamptage. Açık kuyu çekirdek modülünü alt muhafazaya yerleştirin.
4. Modülün kuyusundan hücre ortamını aspire edin. Akış modülünü kuyuya yerleştirin.
5. Akış modülünü çekirdek modül kuyusuna sızdırmaz hale getirmek için üst muhafazayı yerleştirin. Giriş ve çıkış dağıtım uçlarını akış modülü bağlantı noktalarına bağlayın.
6. Sisteme sıvı akışı sağlamak için peristaltik pompayı çalıştırın.

7. Akış girişinden sonra açık kuyu formatında aşağı akış analizinin yapılması

NOT: Buradaki kültür süresi deneysel hedeflere bağlıdır. Kullanıcılar, tercihlerine göre açık kuyu veya mikroakışkan formatlarda aşağı akış analizi (örneğin, İmmünositokimya, RNA ekstraksiyonu) yapabilirler. Örneğin, bir açık kuyu formatı tercih edilirse, sistem standart protokollere^16,19 dayalı tahliller yapacak şekilde yeniden yapılandırılmalıdır.

1. Kesme akışına maruz kalma için istenen süreye ulaşıldığında pompayı durdurun. Giriş ve çıkış dağıtım uçlarını çıkarın.
2. Üst muhafazayı çıkarın. Akış modülünü cımbız kullanarak kuyudan yavaşça çıkarın.
3. Kuyuya 100 μL hücre ortamı ekleyin. Standart protokollere dayalı olarak istenen tahlilleri gerçekleştirin.

Sonuçlar

Açık kuyu çekirdek modülü, Şekil 6A'da gösterildiği gibi, başlangıçta bir alt mahfaza ve bir lamel tarafından oluşturulan belirli bir boşluk içine yerleştirilir. Daha sonra, bir mikrokanal ve erişim portları içeren akış modülü, çekirdek modülün kuyusuna yerleştirilir. Akış modülü, Şekil 6B'de gösterildiği gibi, alt ve üst yuvalara gömülü mıknatıslar arasındaki manyetik çekim kuvveti nedeniyle membranın silikon destek ka...

Tartışmalar

Bu protokolün amacı, akış yeteneklerini ultra ince bir nanomembran içeren bir açık kuyu platformuna dahil etmek için pratik bir yöntem geliştirmektir. Bu tasarımda, deneyler sırasında açık kuyu ve akışkan modları arasında geçişe izin veren ve her iki yaklaşımın avantajlarını birleştiren manyetik bir kilitleme yaklaşımı kullanılmıştır. Geleneksel kalıcı olarak bağlı platformların aksine, manyetik kilitleme, platformun deneysel iş akışı ^16,25,26,27

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA