Trasformazione di modelli di tessuto barriera statico in sistemi microfisiologici dinamici

Riepilogo

Questo protocollo descrive una piattaforma di coltura cellulare riconfigurabile basata su membrana che integra il formato a pozzetto aperto con capacità di flusso del fluido. Questa piattaforma è compatibile con i protocolli standard e consente transizioni reversibili tra le modalità di coltura a pozzetto aperto e microfluidica, soddisfacendo le esigenze dei laboratori di ingegneria e bioscienze.

Abstract

I sistemi microfisiologici sono piattaforme di coltura cellulare miniaturizzate utilizzate per imitare la struttura e la funzione dei tessuti umani in un ambiente di laboratorio. Tuttavia, queste piattaforme non hanno ottenuto un'adozione diffusa nei laboratori di bioscienze, dove gli approcci basati su membrana a pozzetto aperto fungono da gold standard per imitare le barriere tissutali, nonostante la mancanza di capacità di flusso dei fluidi. Questo problema può essere attribuito principalmente all'incompatibilità dei sistemi microfisiologici esistenti con i protocolli standard e gli strumenti sviluppati per i sistemi a pozzo aperto.

Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di una piattaforma riconfigurabile basata su membrana con una struttura a pozzetto aperto, capacità di miglioramento del flusso e compatibilità con i protocolli convenzionali. Questo sistema utilizza un approccio di assemblaggio magnetico che consente la commutazione reversibile tra le modalità a pozzetto aperto e microfluidica. Con questo approccio, gli utenti hanno la flessibilità di iniziare un esperimento nel formato a pozzetto aperto utilizzando protocolli standard e di aggiungere o rimuovere funzionalità di flusso in base alle esigenze. Per dimostrare l'uso pratico di questo sistema e la sua compatibilità con le tecniche standard, è stato creato un monostrato di cellule endoteliali in un formato a pozzetto aperto. Il sistema è stato riconfigurato per introdurre il flusso di fluido e quindi è passato al formato a pozzetto aperto per condurre l'immunocolorazione e l'estrazione dell'RNA. Grazie alla sua compatibilità con i protocolli convenzionali a pozzo aperto e alla capacità di miglioramento del flusso, si prevede che questo design riconfigurabile sarà adottato sia dai laboratori di ingegneria che da quelli di bioscienze.

Introduzione

Le barriere vascolari fungono da interfaccia critica che separa il compartimento sanguigno dal tessuto circostante. Svolgono un ruolo fondamentale nel preservare l'omeostasi attirando le cellule immunitarie, controllando la permeabilità molecolare e proteggendo dall'intrusione di agenti patogeni nel tessuto ^1,2. Sono stati sviluppati modelli di coltura in vitro per imitare il microambiente in vivo, consentendo indagini sistematiche sui fattori e sulle condizioni che influenzano le proprietà di barriera sia in stato sano che malato ^3,4.

L'approccio più utilizzato per tali modelli di coltura è la configurazione "a pozzetto aperto"^simile a Transwell 5, in cui una membrana di coltura porosa e incisa separa i compartimenti pieni di terreno (Figura 1A). In questo formato, le cellule possono essere seminate su entrambi i lati della membrana ed è stata sviluppata un'ampia gamma di protocolli sperimentali. Tuttavia, questi sistemi sono limitati nella loro capacità di fornire i flussi di fluidi essenziali per supportare la maturazione della barriera e imitare la circolazione delle cellule immunitarie osservate in vivo ^5,6. Di conseguenza, non possono essere utilizzati per studi che richiedono flussi dinamici che introducono dosi di farmaco, stimolazione meccanica o sollecitazioni di taglio indotte da fluidi ^6,7,8.

Per superare i limiti dei sistemi a pozzetto aperto, sono state sviluppate piattaforme microfluidiche che combinano membrane di coltura porose con canali fluidici indirizzabili individualmente⁹. Queste piattaforme offrono un controllo preciso sull'instradamento dei fluidi, la perfusione e l'introduzione di composti chimici, la stimolazione a taglio controllata e le capacità di aggiunta dinamica delle cellule 7,10,11,12,13. Nonostante le capacità avanzate fornite dalle piattaforme microfluidiche, non hanno visto un'adozione diffusa nei laboratori di bioscienze a causa dei complessi protocolli microfluidici e della loro incompatibilità con i flussi di lavoro sperimentali stabiliti ^4,10,14.

Per colmare il divario tra queste tecnologie, presentiamo un protocollo che impiega un sistema basato su moduli riconfigurabile magneticamente. Questo sistema può essere facilmente commutato tra la modalità a pozzetto aperto e la modalità microfluidica in base alle esigenze specifiche dell'esperimento. La piattaforma è dotata di un dispositivo a pozzetto aperto, noto come m-μSiM (sistema microfisiologico modulare abilitato da una membrana di silicio), con una membrana di coltura (nanomembrana) spessa 100 nm. Questa nanomembrana possiede un'elevata porosità (15%) e una trasparenza simile al vetro, come illustrato nella Figura 1B. Separa fisicamente il compartimento superiore da un canale inferiore, consentendo il trasporto molecolare attraverso scale di lunghezza fisiologiche¹⁵. A differenza delle membrane convenzionali incise su traccia, che presentano sfide note nell'imaging di cellule vive con imaging in campo chiaro, le proprietà ottiche e fisiche favorevoli della nanomembrana consentono una chiara visualizzazione delle cellule su entrambi i lati della superficie della membrana 15,16,17.

Il presente protocollo delinea la fabbricazione di moduli specializzati per la semina e il flusso e spiega la riconfigurazione magnetica della piattaforma. Dimostra come la piattaforma possa essere impiegata per stabilire barriere endoteliali sia in condizioni statiche che dinamiche. Questa dimostrazione rivela che le cellule endoteliali si allineano lungo la direzione del flusso, con una sovraregolazione dei bersagli genici sensibili al taglio sotto stimolazione al taglio.

Protocollo

Questo design può essere utilizzato in varie modalità in base alle esigenze sperimentali e alle preferenze dell'utente finale. Prima di ogni esperimento, consultare il diagramma di flusso decisionale presentato nella Figura 2 per determinare i passaggi e i moduli necessari per il protocollo. Ad esempio, se l'utente intende mantenere il formato a pozzetto aperto per tutta la durata di un esperimento per confrontarlo direttamente con il sistema di tipo Transwell, lo stencil di patterning non è necessario per la semina delle cellule. Il modulo centrale è disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) e la nanomembrana ultrasottile può essere selezionata da una libreria di materiali con diverse porosità e dimensioni dei pori per soddisfare le esigenze sperimentali.

1. Fabbricazione dello stencil di modellazione

NOTA: Lo stencil di patterning serve a posizionare le celle esclusivamente sulla regione porosa del chip di membrana, impedendo alle celle di depositarsi sullo strato di silicio circostante dove potrebbero potenzialmente subire danni dopo l'aggiunta del modulo di flusso¹⁶ (fare riferimento alla Figura 3). Il danneggiamento del monostrato può influire negativamente sull'integrità della barriera e compromettere i risultati sperimentali. Lo stencil non è necessario in una cultura aperta e statica, in quanto non vi è alcun rischio di danneggiamento.

1. Acquistare, lavorare o stampare in 3D uno stampo utilizzando il progetto fornito nel file di codifica supplementare 1 (Figura 4A).
   NOTA: Le pareti dello stencil sono rastremate per aumentare la capacità dei supporti e ridurre al minimo l'intrappolamento delle bolle rispetto alle caratteristiche a parete diritta ad alto rapporto d'aspetto.
2. Fissare una pellicola adesiva sensibile alla pressione (PSA) da 130 μm su un foglio acrilico da 3,2 mm utilizzando un rullo freddo (vedere la tabella dei materiali).
3. Tagliare al laser la lastra acrilica secondo il disegno fornito nel file di codifica supplementare 2 per creare una serie di cavità (Figura 4B).
4. Staccare lo strato protettivo dalla pellicola PSA e fissare il foglio acrilico allo stampo.
   NOTA: Assicurarsi che la lamiera tagliata al laser sia allineata con lo stampo in modo che le caratteristiche dello stampo siano centrate all'interno della cavità (Figura 4C). L'accuratezza del posizionamento delle cellule sulla membrana dipende da questo passaggio.
5. Miscelare accuratamente il prepolimero PDMS (utilizzando un rapporto base/catalizzatore di 10:1) (vedere la tabella dei materiali) e degasarlo in una camera a vuoto fino a quando non rimangono bolle visibili (5-15 min).
6. Versare lentamente il PDMS nelle cavità dello stampo, livellandolo con un bordo piatto.
   NOTA: Per evitare l'intrappolamento delle bolle, versare lentamente il PDMS in ciascuna cavità. Se sono presenti bolle dopo il versamento, posizionare lo stampo nella camera a vuoto e degasarlo nuovamente.
7. Polimerizzare il PDMS su una piastra a 70 °C per 1 ora, quindi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
8. Estrarre gli stencil dalle cavità dello stampo utilizzando una pinzetta a punta piatta.

2. Realizzazione del modulo di flusso

NOTA: Il modulo di flusso condivide un ingombro simile con il pozzetto a forma di trifoglio del modulo centrale e include un microcanale stampato (larghezza = 1,5 mm, altezza = 0,2 mm, lunghezza = 5 mm). La forma a trifoglio aiuta ad allineare il canale sulla regione porosa della coltura (Figura 5).

1. Utilizzare le tecniche standard di litografia morbida¹⁸ per creare uno stampo in silicone con caratteristiche definite dal progetto fornito nel file di codifica supplementare 3 (Figura 4D).
2. Fissare una pellicola PSA da 130 μm a un foglio acrilico di 3,2 mm di spessore.
3. Tagliare al laser la lastra acrilica in base al disegno fornito nel file di codifica supplementare 4 per creare una serie di cavità a forma di trifoglio (Figura 4E).
   NOTA: L'altezza della cavità determina l'altezza del modulo di flusso, che deve essere leggermente più alto (di 0-0.1 mm) rispetto all'altezza del pozzetto del modulo centrale per garantire una corretta tenuta.
4. Rimuovere lo strato protettivo dalla pellicola PSA, quindi fissare il foglio tagliato al laser allo stampo in silicone allineando i segni di allineamento triangolari sullo stampo in silicone con quelli sul foglio tagliato al laser.
   NOTA: Analogamente al passaggio 1.4, assicurarsi che il foglio acrilico tagliato al laser sia allineato con lo stampo in silicone in modo che le caratteristiche dello stampo siano centrate all'interno di ciascuna cavità (Figura 4F). Questo passaggio determina la posizione del microcanale rispetto all'impronta.
5. Versare lentamente il PDMS degassato sulle cavità dello stampo e livellarlo con un bordo piatto.
   NOTA: Se sono presenti bolle dopo il versamento, degassare lo stampo fino a quando le bolle non vengono rimosse.
6. Posizionare lo stampo su una piastra riscaldante e cuocere il PDMS a 70 °C per 1 ora, quindi lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente.
7. Rimuovere con cautela i moduli di flusso dalle cavità dello stampo utilizzando una pinzetta a punta piatta.
8. Orientare il modulo di flusso con le caratteristiche del microcanale rivolte verso l'alto e posizionare le porte di ingresso e uscita del nucleo all'estremità del canale utilizzando un punzone per biopsia (vedere la tabella dei materiali).

3. Fabbricazione di alloggiamenti in acrilico inferiore e superiore

NOTA: Il modulo principale si inserisce nell'alloggiamento inferiore. L'attrazione tra i magneti incorporati negli alloggiamenti comprime e sigilla il modulo di flusso al modulo centrale (Figura 6).

1. Tagliare al laser una lastra acrilica da 2 mm utilizzando il disegno fornito nel file di codifica supplementare 5 per creare l'alloggiamento superiore con i fori per l'inserimento del magnete.
2. Fissare una pellicola PSA da 130 μm su un foglio acrilico da 3,5 mm.
3. Tagliare al laser la lastra acrilica in base al disegno fornito nel file di codifica supplementare 6 per creare l'alloggiamento inferiore con i fori per l'inserimento del magnete.
   NOTA: Lo spessore dell'alloggiamento inferiore è un parametro critico e deve corrispondere allo spessore complessivo del modulo centrale per evitare perdite durante il flusso.
4. Rimuovere lo strato protettivo PSA e fissare l'alloggiamento inferiore a un vetrino coprioggetti.
5. Inserire magneti al neodimio nichelati da 4,75 mm (vedi Tabella dei materiali) nei fori tagliati al laser degli alloggiamenti.
   NOTA: Assicurarsi che i magneti negli alloggiamenti inferiore e superiore siano posizionati con polarità opposta per garantire l'attrazione magnetica (Figura 6).

4. Fabbricazione del circuito di flusso

NOTA: Il circuito di flusso a circuito chiuso contiene due fiale di raccolta del campione come serbatoi (Figura 7). Il serbatoio di ingresso è dotato di un filtro in difluoruro di polivinilidene (PVDF) per consentire al terreno cellulare di equilibrarsi con la concentrazione di CO₂ nell'incubatore.

1. Utilizzare un punzone per biopsia da 1 mm per creare due fori nel tappo di una fiala di raccolta del campione.
2. Utilizzare i punzoni per biopsia per creare due fori (1 mm e 4 mm) nel tappo di una fiala di raccolta separata del campione e creare un foro di 1 mm nella parte inferiore di questa fiala.
3. Inserire i puntali di erogazione da 20 G in ciascuno dei fori da 1 mm e sigillarli con colla a caldo.
4. Posizionare un filtro in PVDF da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali) nel foro da 4 mm e sigillarlo con colla a caldo.
5. Tagliare al laser un foglio acrilico da 1,5 mm utilizzando il design fornito nel file di codifica supplementare 7 per creare una fase di conservazione del campione.
6. Posizionare i serbatoi sul tavolino acrilico.
7. Collegare i puntali di erogazione utilizzando tubi di microflusso (vedere la tabella dei materiali).
8. Collegare i tubi all'ingresso e all'uscita del modulo di flusso utilizzando punte di erogazione da 21 G.
9. Utilizzare una pompa peristaltica (vedi Tabella dei materiali) per la circolazione del flusso.
   NOTA: Se lo si desidera, è possibile utilizzare anche pompe a siringa o pneumatiche per introdurre il flusso. La portata deve essere determinata in base alle esigenze sperimentali. Una tabella completa, derivata da un modello COMSOL validato sperimentalmente, è fornita nella Tabella supplementare 1 per aiutare gli utenti a selezionare la portata necessaria per ottenere la sollecitazione di taglio desiderata al monostrato^{di cella 16}.

5. Semina cellulare

NOTA: Analogamente agli inserti di membrana convenzionali, diversi tipi di cellule possono essere coltivati sulla nanomembrana. Un tipo di cellula secondaria può anche essere co-coltivato sull'altro lato della membrana nel canale inferiore¹⁵.

1. Rivestire la membrana con 5 μg/^cm2 di fibronectina (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora per migliorare l'adesione cellulare.
   NOTA: Il tipo di cella scelto può influenzare il rivestimento richiesto e la densità delle celle. La procedura qui descritta è per le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC, vedere la tabella dei materiali).
2. Aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta P200 e posizionare uno stencil di patterning nel pozzetto del modulo centrale.
3. Aggiungere il supporto cellulare al pozzetto e al canale inferiore del dispositivo.
4. Seminare HUVEC a una densità di 40.000 cellule/^cm2 nel pozzetto.
   NOTA: Gli HUVEC a questa densità formano tipicamente un monostrato confluente dopo 24 ore di incubazione^16,19.
5. Mettere il dispositivo in una capsula di Petri. Aggiungere un tappo conico per provetta da 15 mL con acqua deionizzata alla capsula di Petri per mantenere l'umidità locale.
6. Trasferire la capsula di Petri nell'incubatrice.
   NOTA: I supporti cellulari nel pozzetto superiore e nel canale inferiore del dispositivo devono essere cambiati ogni 24 ore. Per cambiare il supporto nel canale inferiore, iniettare delicatamente il supporto nuovo in una delle porte per spostare il vecchio supporto dall'altra porta.

6. Riconfigurazione in modalità microfluidica

1. Sterilizzare l'alloggiamento superiore, l'alloggiamento inferiore, il modulo di flusso, i serbatoi, i tubi e i puntali di erogazione mettendoli in una camera di sterilizzazione UV per 30 minuti prima dell'assemblaggio. Far circolare etanolo al 70% e poi PBS sterile nel circuito di flusso.
2. Riempire i serbatoi e le provette con i terreni di crescita delle cellule endoteliali (vedere la tabella dei materiali).
3. Posizionare l'alloggiamento inferiore sul tavolino del campione. Inserire il modulo centrale a pozzetto aperto nell'alloggiamento inferiore.
4. Aspirare il terreno cellulare dal pozzetto del modulo. Posizionare il modulo di flusso nel pozzetto.
5. Posizionare l'alloggiamento superiore per sigillare il modulo di flusso nel pozzetto del modulo centrale. Collegare i puntali di erogazione in ingresso e in uscita alle porte del modulo di flusso.
6. Avviare la pompa peristaltica per introdurre il flusso di fluido nel sistema.

7. Esecuzione dell'analisi a valle in formato a pozzo aperto dopo l'introduzione del flusso

NOTA: il tempo di coltura in questo caso dipende dagli obiettivi sperimentali. Gli utenti possono condurre analisi a valle (ad esempio, immunocitochimica, estrazione dell'RNA) in formato a pozzetto aperto o microfluidico in base alle loro preferenze. Ad esempio, se si preferisce un formato a pozzetto aperto, il sistema deve essere riconfigurato per condurre saggi basati su protocolli standard^16,19.

1. Arrestare la pompa quando viene raggiunto il tempo desiderato per l'esposizione al flusso di taglio. Rimuovere i puntali di erogazione in ingresso e in uscita.
2. Rimuovere l'alloggiamento superiore. Rimuovere delicatamente il modulo di flusso dal pozzetto utilizzando una pinzetta.
3. Aggiungere 100 μL di terreno cellulare al pozzetto. Condurre i saggi desiderati in base ai protocolli standard.

Risultati

Il modulo centrale a pozzetto aperto è inizialmente posizionato all'interno di una cavità specifica creata da un alloggiamento inferiore e da un vetrino coprioggetto, come illustrato nella Figura 6A. Successivamente, il modulo di flusso, che include un microcanale e porte di accesso, viene inserito nel pozzetto del modulo centrale. Il modulo di flusso è sigillato saldamente contro lo strato di supporto in silicio della membrana a causa della forza di attrazione magnetica tra i magneti inc...

Discussione

Lo scopo di questo protocollo è quello di sviluppare un metodo pratico per incorporare le capacità di flusso in una piattaforma a pozzetto aperto con una nanomembrana ultrasottile. In questo progetto, viene utilizzato un approccio di aggancio magnetico, che consente di passare dalla modalità a pozzetto aperto a quella fluidica durante gli esperimenti e combinando i vantaggi di entrambi gli approcci. A differenza delle piattaforme convenzionali incollate in modo permanente, la chiusura magnetica consente di smontare la...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA