Transformando Modelos de Tecidos de Barreira Estática em Sistemas Microfisiológicos Dinâmicos

Resumo

Este protocolo descreve uma plataforma de cultura celular baseada em membrana reconfigurável que integra o formato de poço aberto com recursos de fluxo de fluido. Esta plataforma é compatível com protocolos padrão e permite transições reversíveis entre os modos de cultura de poço aberto e microfluídica, acomodando as necessidades dos laboratórios de engenharia e biociências.

Resumo

Sistemas microfisiológicos são plataformas de cultura celular miniaturizadas usadas para mimetizar a estrutura e função de tecidos humanos em laboratório. No entanto, essas plataformas não ganharam ampla adoção em laboratórios de biociências, onde abordagens baseadas em membranas de poço aberto servem como padrão-ouro para mimetizar barreiras teciduais, apesar de não terem capacidade de fluxo de fluidos. Esse problema pode ser atribuído principalmente à incompatibilidade dos sistemas microfisiológicos existentes com protocolos e ferramentas padronizadas desenvolvidas para sistemas de poço aberto.

Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de uma plataforma reconfigurável baseada em membrana com uma estrutura de poço aberto, capacidade de aumento de fluxo e compatibilidade com protocolos convencionais. Este sistema utiliza uma abordagem de montagem magnética que permite a comutação reversível entre os modos de poço aberto e microfluídico. Com essa abordagem, os usuários têm a flexibilidade de iniciar um experimento no formato de poço aberto usando protocolos padrão e adicionar ou remover recursos de fluxo conforme necessário. Para demonstrar o uso prático desse sistema e sua compatibilidade com técnicas padrão, uma monocamada de células endoteliais foi estabelecida em um formato de poço aberto. O sistema foi reconfigurado para introduzir fluxo de fluido e, em seguida, mudou para o formato de poço aberto para conduzir a imunomarcação e extração de RNA. Devido à sua compatibilidade com protocolos convencionais de poço aberto e capacidade de aumento de fluxo, espera-se que este projeto reconfigurável seja adotado por laboratórios de engenharia e biociências.

Introdução

As barreiras vasculares servem como uma interface crítica que separa o compartimento sanguíneo do tecido circundante. Desempenham papel fundamental na preservação da homeostase, atraindo células imunes, controlando a permeabilidade molecular e blindando contra a intrusão de patógenos no tecido ^1,2. Modelos de cultivo in vitro têm sido desenvolvidos para mimetizar o microambiente in vivo, permitindo investigações sistemáticas sobre os fatores e condições que afetam as propriedades de barreira tanto em estados saudáveis quanto doentes ^3,4.

A abordagem mais utilizada para tais modelos de cultura é a configuração Transwell-like "open-well"⁵, onde uma membrana de cultura porosa e condicionada por trilhos separa compartimentos preenchidos por meios (Figura 1A). Neste formato, as células podem ser semeadas em ambos os lados da membrana, e uma ampla gama de protocolos experimentais foi desenvolvida. No entanto, esses sistemas são limitados em sua capacidade de fornecer os fluxos de fluidos essenciais para suportar a maturação da barreira e mimetizar a circulação de células imunes observadas in vivo ^5,6. Consequentemente, não podem ser utilizados para estudos que necessitem de fluxos dinâmicos que introduzam doses de fármacos, estimulação mecânica ou tensões de cisalhamento induzidas por fluidos ^6,7,8.

Para superar as limitações dos sistemas de poço aberto, plataformas microfluídicas que combinam membranas de cultura porosas com canais fluídicos endereçáveis individualmente foram desenvolvidas⁹. Essas plataformas oferecem controle preciso sobre o roteamento de fluidos, perfusão e introdução de compostos químicos, estimulação de cisalhamento controlada e capacidade de adição dinâmica de células 7,10,11,12,13. Apesar das capacidades avançadas proporcionadas pelas plataformas microfluídicas, elas não têm sido amplamente adotadas nos laboratórios de biociências devido aos complexos protocolos microfluídicos e sua incompatibilidade com fluxos de trabalho experimentais estabelecidos4,10,14.

Para preencher a lacuna entre essas tecnologias, apresentamos um protocolo que emprega um sistema baseado em módulos reconfigurável magneticamente. Este sistema pode ser facilmente alternado entre os modos de poço aberto e microfluídico com base nas necessidades específicas do experimento. A plataforma possui um dispositivo de poço aberto, conhecido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por uma membrana de silício), com uma membrana de cultura de 100 nm de espessura (nanomembrana). Esta nanomembrana possui alta porosidade (15%) e transparência semelhante a vidro, como ilustrado na Figura 1B. Ele separa fisicamente o compartimento superior de um canal inferior, permitindo o transporte molecular através de escalas de comprimento fisiológico¹⁵. Ao contrário das membranas convencionais gravadas por trilhos, que têm desafios conhecidos na obtenção de imagens de células vivas com imagens de campo claro, as propriedades ópticas e físicas favoráveis da nanomembrana permitem a visualização clara das células em ambos os lados da superfície da membrana 15,16,17.

O presente protocolo descreve a fabricação de módulos especializados de semeadura e fluxo e explica a reconfiguração magnética da plataforma. Isso demonstra como a plataforma pode ser empregada para estabelecer barreiras endoteliais em condições estáticas e dinâmicas. Esta demonstração revela que as células endoteliais alinham-se ao longo da direção do fluxo, com uma upregulation de alvos gênicos sensíveis ao cisalhamento sob estimulação de cisalhamento.

Protocolo

Este projeto pode ser usado em vários modos com base em requisitos experimentais e nas preferências do usuário final. Antes de cada experimento, consulte o fluxograma de decisão apresentado na Figura 2 para determinar as etapas e módulos necessários para o protocolo. Por exemplo, se o usuário pretende manter o formato de poço aberto durante um experimento para compará-lo diretamente com o sistema do tipo Transwell, o estêncil de padronização não é necessário para a semeadura de células. O módulo central está disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais), e a nanomembrana ultrafina pode ser selecionada de uma biblioteca de materiais com diferentes porosidades e tamanhos de poros para atender às necessidades experimentais.

1. Fabricação do estêncil de padronização

NOTA: O estêncil de padronização serve para posicionar as células exclusivamente na região porosa do chip de membrana, impedindo que as células se instalem na camada de silício circundante, onde poderiam sofrer danos após a adição do módulo de fluxo¹⁶ (consulte a Figura 3). Danos à monocamada podem afetar adversamente a integridade da barreira e comprometer os resultados experimentais. O estêncil é desnecessário em uma cultura aberta e estática, pois não há risco de danos.

1. Compre, usine ou imprima um molde em 3D usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1 (Figura 4A).
   NOTA: As paredes do estêncil são cônicas para aumentar a capacidade da mídia e minimizar o aprisionamento de bolhas em comparação com os recursos de parede reta de alta taxa de aspecto.
2. Anexe um filme adesivo sensível à pressão (PSA) de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,2 mm usando um rolo frio (consulte a Tabela de Materiais).
3. O corte a laser da folha de acrílico de acordo com o projeto fornecido no Supplementary Coding File 2 para criar uma matriz de cavidades (Figura 4B).
4. Retire a camada protetora da película de PSA e prenda a folha de acrílico ao molde.
   NOTA: Certifique-se de que a folha cortada a laser esteja alinhada com o molde de modo que as características do molde estejam centralizadas dentro da cavidade (Figura 4C). A precisão do posicionamento celular na membrana depende dessa etapa.
5. Misture completamente o pré-polímero PDMS (usando uma proporção de base para catalisador de 10:1) (consulte a Tabela de Materiais) e desgaseifique-o em uma câmara de vácuo até que não restem bolhas visíveis (5-15 min).
6. Despeje lentamente o PDMS nas cavidades do molde, nivelando-o com uma borda plana.
   NOTA: Para evitar o aprisionamento de bolhas, despeje o PDMS em cada cavidade lentamente. Se houver bolhas após o derramamento, coloque o molde na câmara de vácuo e desgaseifique-o novamente.
7. Curar o PDMS numa placa de aquecimento a 70 °C durante 1 h e, em seguida, deixá-lo arrefecer até à temperatura ambiente.
8. Extrair os estênceis das cavidades do molde usando pinças de ponta plana.

2. Fabricação do módulo de fluxo

NOTA: O módulo de fluxo compartilha uma pegada semelhante com o poço em forma de trevo do módulo central e inclui um microcanal moldado (largura = 1,5 mm, altura = 0,2 mm, comprimento = 5 mm). A forma do trevo auxilia no alinhamento do canal sobre a região de cultura porosa (Figura 5).

1. Use técnicas padrão de litografia suave¹⁸ para criar um molde de silício com características definidas pelo projeto fornecido no Supplementary Coding File 3 (Figura 4D).
2. Anexe um filme PSA de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,2 mm de espessura.
3. O corte a laser da folha de acrílico com base no desenho dado no Arquivo de Codificação Suplementar 4 para criar uma matriz de cavidades em forma de trevo (Figura 4E).
   NOTA: A altura da cavidade determina a altura do módulo de fluxo, que deve ser ligeiramente mais alto (por 0-0,1 mm) do que a altura do poço do módulo central para garantir a vedação adequada.
4. Remova a camada protetora da película PSA e, em seguida, conecte a folha cortada a laser ao molde de silicone alinhando as marcas de alinhamento triangular no molde de silicone com as da folha cortada a laser.
   NOTA: Semelhante ao passo 1.4, certifique-se de que a folha de acrílico cortada a laser esteja alinhada com o molde de silicone de modo que as características do molde estejam centralizadas dentro de cada cavidade (Figura 4F). Esta etapa determina a posição do microcanal em relação à pegada.
5. Despeje lentamente o PDMS desgaseificado nas cavidades do molde e nivele-o com uma borda plana.
   NOTA: Se houver bolhas após o derramamento, desgaseifique o molde até que as bolhas sejam removidas.
6. Coloque o molde em uma placa de aquecimento e asse o PDMS a 70 °C por 1 h, em seguida, deixe o molde esfriar até a temperatura ambiente.
7. Remova cuidadosamente os módulos de fluxo das cavidades do molde usando pinças de ponta plana.
8. Orientar o módulo de fluxo com as características do microcanal voltadas para cima e posicionar as portas de entrada e saída do núcleo no final do canal usando um punção de biópsia (consulte a Tabela de Materiais).

3. Fabricação de carcaças de acrílico inferior e superior

NOTA: O módulo principal se encaixa na carcaça inferior. A atração entre ímãs embutidos nas carcaças comprime e sela o módulo de fluxo para o módulo central (Figura 6).

1. Corte a laser uma folha de acrílico de 2 mm usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 5 para criar a carcaça superior com furos para inserção de ímã.
2. Fixe um filme PSA de 130 μm a uma folha de acrílico de 3,5 mm.
3. Corte a laser a folha de acrílico com base no design dado no Arquivo de Codificação Suplementar 6 para criar a carcaça inferior com furos para inserção de ímã.
   NOTA: A espessura da carcaça inferior é um parâmetro crítico e deve corresponder à espessura total do módulo central para evitar fugas durante o fluxo.
4. Remova a camada protetora PSA e fixe a carcaça inferior a uma tampa de vidro.
5. Encaixe ímãs de neodímio niquelados de 4,75 mm (ver Tabela de Materiais) nos orifícios cortados a laser das carcaças.
   NOTA: Certifique-se de que os ímãs nas caixas inferior e superior sejam colocados com polaridade oposta para garantir a atração magnética (Figura 6).

4. Fabricação do circuito de fluxo

NOTA: O circuito de fluxo em circuito fechado contém dois frascos de coleta de amostras como reservatórios (Figura 7). O reservatório de entrada possui um filtro de difluoreto de polivinilideno (PVDF) para permitir que o meio celular se equilibre com a concentração de CO₂ na incubadora.

1. Use um punch de biópsia de 1 mm para criar dois orifícios na tampa de um frasco de coleta de amostra.
2. Use punções de biópsia para criar dois orifícios (1 mm e 4 mm) na tampa de um frasco de coleta de amostra separado e crie um orifício de 1 mm na parte inferior deste frasco.
3. Insira pontas dosadoras de 20 G em cada um dos orifícios de 1 mm e seque-os com cola quente.
4. Coloque um filtro PVDF de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) no orifício de 4 mm e sele com cola quente.
5. Corte a laser uma folha de acrílico de 1,5 mm usando o design fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 7 para criar um estágio de retenção de amostra.
6. Posicione os reservatórios sobre o palco de acrílico.
7. Conecte as pontas de dosagem usando tubos de microfluxo (consulte a Tabela de Materiais).
8. Conecte os tubos à entrada e saída do módulo de fluxo usando ponteiras dosadoras de 21 G.
9. Utilize uma bomba peristáltica (consulte a Tabela de Materiais) para a circulação do fluxo.
   NOTA: Bombas de seringa ou pneumáticas também podem ser usadas para introduzir fluxo, se desejado. O caudal deve ser determinado com base nas necessidades experimentais. Uma tabela abrangente, derivada de um modelo COMSOL validado experimentalmente, é fornecida na Tabela Suplementar 1 para ajudar os usuários a selecionar a vazão necessária para atingir a tensão de cisalhamento desejada na monocamada celular¹⁶.

5. Semeadura celular

NOTA: Semelhante às inserções de membrana convencionais, diferentes tipos de células podem ser cultivados na nanomembrana. Um tipo celular secundário também pode ser co-cultivado do outro lado da membrana no canal inferior¹⁵.

1. Revestir a membrana com 5 μg/^cm2 de fibronectina (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente durante 1 h para melhorar a fixação celular.
   NOTA: O tipo de célula escolhido pode influenciar o revestimento necessário e a densidade celular. O procedimento descrito aqui é para células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs, ver Tabela de Materiais).
2. Aspirar a solução de revestimento usando uma pipeta P200 e colocar um estêncil de padronização no poço do módulo central.
3. Adicione mídia celular ao canal de poço e inferior do dispositivo.
4. Seme HUVECs a uma densidade de 40.000 células/cm² no poço.
   NOTA: HUVECs nesta densidade tipicamente formam uma monocamada confluente após 24 h de incubação^16,19.
5. Coloque o dispositivo em uma placa de Petri. Adicione uma tampa de tubo cônico de 15 mL com água DI à placa de Petri para manter a umidade local.
6. Transfira a placa de Petri para a incubadora.
   NOTA: A mídia celular no poço superior e no canal inferior do dispositivo deve ser trocada a cada 24 h. Para alterar a mídia no canal inferior, injete suavemente a mídia nova em uma das portas para deslocar a mídia antiga da outra porta.

6. Reconfiguração para modo microfluídico

1. Esterilize a carcaça superior, a carcaça inferior, o módulo de fluxo, reservatórios, tubos e pontas de dosagem, colocando-os em uma câmara de esterilização UV por 30 minutos antes da montagem. Circular etanol 70% e, em seguida, PBS estéril no circuito de fluxo.
2. Encher os reservatórios e tubos com meios de crescimento de células endoteliais (ver Tabela de Materiais).
3. Coloque a carcaça inferior no estágio de amostragem. Insira o módulo principal de poço aberto na caixa inferior.
4. Aspirar o meio celular do poço do módulo. Coloque o módulo de fluxo no poço.
5. Coloque a carcaça superior para selar bem o módulo de fluxo no módulo principal. Conecte as pontas dosadoras de entrada e saída às portas do módulo de fluxo.
6. Ligue a bomba peristáltica para introduzir o fluxo de fluido no sistema.

7. Realização de análise a jusante em formato de poço aberto após a introdução do fluxo

NOTA: O tempo de cultura aqui depende dos objetivos experimentais. Os usuários podem realizar análises a jusante (por exemplo, imunocitoquímica, extração de RNA) nos formatos de poço aberto ou microfluídico com base em sua preferência. Por exemplo, se preferir um formato de poço aberto, o sistema deve ser reconfigurado para conduzir ensaios baseados em protocolos padrão^16,19.

1. Pare a bomba quando o tempo desejado para exposição ao fluxo de cisalhamento for atingido. Remova as pontas dosadoras de entrada e saída.
2. Remova a carcaça superior. Remova suavemente o módulo de fluxo do poço usando uma pinça.
3. Adicione 100 μL de meio celular ao poço. Realizar ensaios desejados com base em protocolos padronizados.

Resultados

O módulo central de poço aberto é inicialmente posicionado dentro de uma cavidade específica criada por uma carcaça inferior e uma lamínula, como ilustrado na Figura 6A. Posteriormente, o módulo de fluxo, que inclui um microcanal e portas de acesso, é inserido no poço do módulo principal. O módulo de fluxo é selado firmemente contra a camada de suporte de silício da membrana devido à força de atração magnética entre os ímãs embutidos nas carcaças inferior e superior, con...

Discussão

O objetivo deste protocolo é desenvolver um método prático para incorporar capacidades de fluxo em uma plataforma de poço aberto com uma nanomembrana ultrafina. Neste projeto, uma abordagem de travamento magnético é utilizada, permitindo alternar entre os modos de poço aberto e fluídico durante os experimentos e combinando as vantagens de ambas as abordagens. Ao contrário das plataformas convencionais com ligação permanente, o travamento magnético permite que a plataforma seja desmontada em pontos conveniente...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA