Transformación de modelos tisulares de barrera estática en sistemas microfisiológicos dinámicos

Resumen

Este protocolo describe una plataforma de cultivo celular basada en membranas reconfigurable que integra el formato de pozo abierto con capacidades de flujo de fluidos. Esta plataforma es compatible con los protocolos estándar y permite transiciones reversibles entre los modos de cultivo microfluídico y de pozo abierto, adaptándose a las necesidades de los laboratorios de ingeniería y biociencias.

Resumen

Los sistemas microfisiológicos son plataformas de cultivo celular miniaturizadas que se utilizan para imitar la estructura y la función de los tejidos humanos en un entorno de laboratorio. Sin embargo, estas plataformas no han obtenido una adopción generalizada en los laboratorios de biociencias, donde los enfoques basados en membranas de pozo abierto sirven como el estándar de oro para imitar las barreras tisulares, a pesar de carecer de capacidades de flujo de fluidos. Este problema se puede atribuir principalmente a la incompatibilidad de los sistemas microfisiológicos existentes con los protocolos y herramientas estándar desarrollados para los sistemas de pozos abiertos.

Aquí, presentamos un protocolo para crear una plataforma reconfigurable basada en membranas con una estructura de pozo abierto, capacidad de mejora de flujo y compatibilidad con protocolos convencionales. Este sistema utiliza un enfoque de ensamblaje magnético que permite la conmutación reversible entre los modos de pozo abierto y microfluídico. Con este enfoque, los usuarios tienen la flexibilidad de comenzar un experimento en el formato de pozo abierto utilizando protocolos estándar y agregar o eliminar capacidades de flujo según sea necesario. Para demostrar el uso práctico de este sistema y su compatibilidad con las técnicas estándar, se estableció una monocapa de células endoteliales en un formato de pocillo abierto. El sistema se reconfiguró para introducir el flujo de fluidos y luego se cambió al formato de pozo abierto para realizar la inmunotinción y la extracción de ARN. Debido a su compatibilidad con los protocolos convencionales de pozos abiertos y su capacidad de mejora del flujo, se espera que este diseño reconfigurable sea adoptado tanto por los laboratorios de ingeniería como por los de biociencias.

Introducción

Las barreras vasculares sirven como una interfaz crítica que separa el compartimento sanguíneo del tejido circundante. Desempeñan un papel fundamental en la preservación de la homeostasis al atraer células inmunitarias, controlar la permeabilidad molecular y proteger contra la intrusión de patógenos en el tejido ^1,2. Se han desarrollado modelos de cultivo in vitro para imitar el microambiente in vivo, lo que permite realizar investigaciones sistemáticas sobre los factores y condiciones que afectan las propiedades de barrera tanto en estados sanos como enfermos ^3,4.

El enfoque más utilizado para estos modelos de cultivo es la configuración de "pozo abierto"⁵ similar a Transwell, en la que una membrana de cultivo porosa y grabada separa los compartimentos llenos de medios (Figura 1A). En este formato, las células se pueden sembrar a ambos lados de la membrana, y se ha desarrollado una amplia gama de protocolos experimentales. Sin embargo, estos sistemas tienen una capacidad limitada para proporcionar los flujos de fluidos esenciales para apoyar la maduración de la barrera e imitar la circulación de las células inmunitarias observadas in vivo ^5,6. En consecuencia, no pueden ser utilizados para estudios que requieran flujos dinámicos que introduzcan dosis de fármacos, estimulación mecánica o tensiones de cizallamiento inducidas por fluidos ^6,7,8.

Para superar las limitaciones de los sistemas de pozos abiertos, se han desarrollado plataformas microfluídicas que combinan membranas de cultivo porosas con canales fluídicos direccionables individualmente⁹. Estas plataformas ofrecen un control preciso sobre el enrutamiento de fluidos, la perfusión y la introducción de compuestos químicos, estimulación de cizallamiento controlada y capacidades de adición celular dinámica 7,10,11,12,13. A pesar de las capacidades avanzadas proporcionadas por las plataformas microfluídicas, no han sido ampliamente adoptadas en los laboratorios de biociencias debido a los complejos protocolos microfluídicos y su incompatibilidad con los flujos de trabajo experimentales establecidos ^4,10,14.

Para cerrar la brecha entre estas tecnologías, presentamos un protocolo que emplea un sistema basado en módulos reconfigurable magnéticamente. Este sistema se puede cambiar fácilmente entre los modos de pozo abierto y microfluídico en función de las necesidades específicas del experimento. La plataforma cuenta con un dispositivo de pozo abierto, conocido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por una membrana de silicio), con una membrana de cultivo de 100 nm de espesor (nanomembrana). Esta nanomembrana posee una alta porosidad (15%) y una transparencia similar a la del vidrio, como se ilustra en la Figura 1B. Separa físicamente el compartimento superior de un canal inferior, lo que permite el transporte molecular a través de escalas de longitud fisiológicas¹⁵. A diferencia de las membranas convencionales grabadas con trazas, que tienen desafíos conocidos en la obtención de imágenes de células vivas con imágenes de campo claro, las propiedades ópticas y físicas favorables de la nanomembrana permiten una visualización clara de las células a ambos lados de la superficie de la membrana 15,16,17.

El presente protocolo describe la fabricación de módulos especializados de siembra y flujo y explica la reconfiguración magnética de la plataforma. Demuestra cómo se puede emplear la plataforma para establecer barreras endoteliales tanto en condiciones estáticas como dinámicas. Esta demostración revela que las células endoteliales se alinean a lo largo de la dirección del flujo, con una regulación positiva de las dianas genéticas sensibles al cizallamiento bajo la estimulación del cizallamiento.

Protocolo

Este diseño se puede utilizar en varios modos en función de los requisitos experimentales y las preferencias del usuario final. Antes de cada experimento, consulte el diagrama de flujo de decisión presentado en la Figura 2 para determinar los pasos y módulos necesarios para el protocolo. Por ejemplo, si el usuario tiene la intención de mantener el formato de pocillo abierto a lo largo de un experimento para compararlo directamente con el sistema de tipo Transwell, la galería de símbolos de patrón no es necesaria para la siembra de células. El módulo central está disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), y la nanomembrana ultrafina se puede seleccionar de una biblioteca de materiales con diferentes porosidad y tamaños de poro para adaptarse a las necesidades experimentales.

1. Fabricación de la plantilla de patrón

NOTA: La plantilla de patrones sirve para colocar las células exclusivamente en la región porosa del chip de membrana, evitando que las células se asienten en la capa de silicio circundante donde podrían experimentar daños después de agregar el módulo de flujo¹⁶ (consulte la Figura 3). El daño a la monocapa puede afectar negativamente la integridad de la barrera y comprometer los resultados experimentales. La plantilla no es necesaria en un cultivo abierto y estático, ya que no hay riesgo de daños.

1. Compre, mecanize o imprima en 3D un molde utilizando el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 1 (Figura 4A).
   NOTA: Las paredes de la galería de símbolos son cónicas para aumentar la capacidad de los medios y minimizar el atrapamiento de burbujas en comparación con las características de paredes rectas de alta relación de aspecto.
2. Fije una película adhesiva sensible a la presión (PSA) de 130 μm a una lámina acrílica de 3,2 mm con un rodillo frío (consulte la tabla de materiales).
3. Corte con láser la lámina acrílica de acuerdo con el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 2 para crear una matriz de cavidades (Figura 4B).
4. Retire la capa protectora de la película PSA y adhiera la lámina acrílica al molde.
   NOTA: Asegúrese de que la lámina cortada con láser esté alineada con el molde de modo que las características del molde estén centradas dentro de la cavidad (Figura 4C). La precisión del posicionamiento de las células en la membrana depende de este paso.
5. Mezcle bien el prepolímero PDMS (usando una proporción de base a catalizador de 10:1) (consulte la Tabla de materiales) y desgasifique en una cámara de vacío hasta que no queden burbujas visibles (5-15 min).
6. Vierta lentamente el PDMS en las cavidades del molde, nivelándolo con un borde plano.
   NOTA: Para evitar que las burbujas queden atrapadas, vierta el PDMS en cada cavidad lentamente. Si hay burbujas después de verter, coloque el molde en la cámara de vacío y desgasifique nuevamente.
7. Cura el PDMS en una placa calefactora a 70 °C durante 1 h y, a continuación, deja que se enfríe a temperatura ambiente.
8. Extrae las plantillas de las cavidades del molde con unas pinzas de punta plana.

2. Fabricación del módulo de flujo

NOTA: El módulo de flujo comparte una huella similar con el pozo en forma de trébol del módulo central e incluye un microcanal moldeado (ancho = 1,5 mm, alto = 0,2 mm, largo = 5 mm). La forma de trébol ayuda a alinear el canal sobre la región de cultivo porosa (Figura 5).

1. Utilice las técnicas estándar de litografía blanda¹⁸ para crear un molde de silicio con características definidas por el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 3 (Figura 4D).
2. Coloque una película de PSA de 130 μm en una lámina acrílica de 3,2 mm de grosor.
3. Corte con láser la lámina acrílica según el diseño dado en el Archivo de codificación suplementario 4 para crear una matriz de cavidades en forma de trébol (Figura 4E).
   NOTA: La altura de la cavidad determina la altura del módulo de flujo, que debe ser ligeramente más alta (0-0,1 mm) que la altura del pozo del módulo central para garantizar un sellado adecuado.
4. Retire la capa protectora de la película PSA y luego adhiera la lámina cortada con láser al molde de silicona alineando las marcas de alineación triangulares en el molde de silicona con las de la lámina cortada con láser.
   NOTA: Al igual que en el paso 1.4, asegúrese de que la lámina acrílica cortada con láser esté alineada con el molde de silicona para que las características del molde estén centradas dentro de cada cavidad (Figura 4F). Este paso determina la posición del microcanal en relación con la huella.
5. Vierta lentamente el PDMS desgasificado en las cavidades del molde y nivele con un borde plano.
   NOTA: Si hay burbujas después de verter, desgasifique el molde hasta que se eliminen las burbujas.
6. Coloque el molde en una placa calefactora y hornee el PDMS a 70 °C durante 1 h, luego deje que el molde se enfríe a temperatura ambiente.
7. Retire con cuidado los módulos de flujo de las cavidades del molde con unas pinzas de punta plana.
8. Oriente el módulo de flujo con las características del microcanal hacia arriba y coloque los puertos de entrada y salida del núcleo al final del canal con un punzón de biopsia (consulte la Tabla de materiales).

3. Fabricación de carcasas acrílicas inferiores y superiores

NOTA: El módulo central encaja en la carcasa inferior. La atracción entre los imanes incrustados en las carcasas comprime y sella el módulo de flujo al módulo central (Figura 6).

1. Corte con láser una lámina acrílica de 2 mm utilizando el diseño proporcionado en el Archivo de codificación suplementario 5 para crear la carcasa superior con orificios para la inserción del imán.
2. Coloque una película de PSA de 130 μm en una lámina acrílica de 3,5 mm.
3. Corte con láser la lámina acrílica según el diseño dado en el Archivo de codificación suplementario 6 para crear la carcasa inferior con orificios para la inserción del imán.
   NOTA: El grosor de la carcasa inferior es un parámetro crítico y debe coincidir con el grosor total del módulo central para evitar fugas durante el flujo.
4. Retire la capa protectora PSA y fije la carcasa inferior a un cubreobjetos de vidrio.
5. Encaje a presión imanes de neodimio niquelado de 4,75 mm (consulte la tabla de materiales) en los orificios cortados con láser de las carcasas.
   NOTA: Asegúrese de que los imanes en las carcasas inferior y superior estén colocados con polaridad opuesta para garantizar la atracción magnética (Figura 6).

4. Fabricación del circuito de flujo

NOTA: El circuito de flujo de circuito cerrado contiene dos viales de recolección de muestras como depósitos (Figura 7). El depósito de entrada tiene un filtro de difluoruro de polivinilideno (PVDF) para permitir que el medio celular se equilibre con la concentración de_CO2 en la incubadora.

1. Utilice un punzón de biopsia de 1 mm para crear dos orificios en la tapa de un vial de recolección de muestras.
2. Utilice punzones de biopsia para crear dos orificios (1 mm y 4 mm) en la tapa de un vial de recolección de muestras separado y cree un orificio de 1 mm en la parte inferior de este vial.
3. Inserte puntas dispensadoras de 20 G en cada uno de los orificios de 1 mm y séllelos con pegamento caliente.
4. Coloque un filtro de PVDF de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) en el orificio de 4 mm y séllelo con pegamento caliente.
5. Corte con láser una lámina acrílica de 1,5 mm utilizando el diseño proporcionado en el archivo de codificación suplementario 7 para crear una etapa de retención de muestras.
6. Coloque los depósitos en la platina acrílica.
7. Conecte las puntas dispensadoras con tubos de microflujo (consulte la Tabla de materiales).
8. Conecte los tubos a la entrada y salida del módulo de flujo utilizando puntas dispensadoras de 21 G.
9. Utilice una bomba peristáltica (consulte la Tabla de materiales) para la circulación del flujo.
   NOTA: También se pueden usar jeringas o bombas neumáticas para introducir flujo si se desea. El caudal debe determinarse en función de las necesidades experimentales. En la Tabla Suplementaria 1 se proporciona una tabla completa, derivada de un modelo COMSOL validado experimentalmente, para ayudar a los usuarios a seleccionar el caudal necesario para lograr el esfuerzo cortante deseado en la monocapa de celda¹⁶.

5. Siembra celular

NOTA: Al igual que los insertos de membrana convencionales, se pueden cultivar diferentes tipos de células en la nanomembrana. Un tipo de célula secundaria también puede ser co-cultivado en el otro lado de la membrana en el canal inferior¹⁵.

1. Recubrir la membrana con 5 μg/^cm2 de fibronectina (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 1 h para mejorar la adhesión celular.
   NOTA: El tipo de celda elegido puede influir en el recubrimiento requerido y la densidad de celda. El procedimiento descrito aquí es para células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, ver Tabla de Materiales).
2. Aspire la solución de recubrimiento con una pipeta P200 y coloque una plantilla de patrones en el pozo del módulo central.
3. Agregue medios celulares al pocillo y al canal inferior del dispositivo.
4. Siembre HUVECs a una densidad de 40.000 células/^cm2 en el pozo.
   NOTA: Los HUVECs a esta densidad suelen formar una monocapa confluente después de 24 h de incubación ^16,19.
5. Coloque el dispositivo en una placa de Petri. Agregue una tapa de tubo cónico de 15 ml con agua desionizada a la placa de Petri para mantener la humedad local.
6. Transfiera la placa de Petri a la incubadora.
   NOTA: Los medios celulares en el pocillo superior y el canal inferior del dispositivo deben cambiarse cada 24 horas. Para cambiar el medio en el canal inferior, inyecte suavemente el medio nuevo en uno de los puertos para desplazar el medio antiguo del otro puerto.

6. Reconfiguración al modo microfluídico

1. Esterilice la carcasa superior, la carcasa inferior, el módulo de flujo, los depósitos, los tubos y las puntas dispensadoras colocándolos en una cámara de esterilización UV durante 30 minutos antes del montaje. Haga circular etanol al 70% y luego PBS estéril en el circuito de flujo.
2. Llene los depósitos y tubos con medios de crecimiento de células endoteliales (consulte la tabla de materiales).
3. Coloque la carcasa inferior en la platina de muestra. Inserte el módulo de núcleo de pozo abierto en la carcasa inferior.
4. Aspire los medios celulares del pocillo del módulo. Coloque el módulo de flujo en el pozo.
5. Coloque la carcasa superior para sellar el módulo de flujo en el pozo del módulo central. Conecte las puntas dispensadoras de entrada y salida a los puertos del módulo de flujo.
6. Ponga en marcha la bomba peristáltica para introducir el flujo de fluido en el sistema.

7. Realización de análisis aguas abajo en formato de pozo abierto después de la introducción del flujo

NOTA: El tiempo de cultivo aquí depende de los objetivos experimentales. Los usuarios pueden realizar análisis posteriores (por ejemplo, inmunocitoquímica, extracción de ARN) en los formatos de pozo abierto o microfluídicos según sus preferencias. Por ejemplo, si se prefiere un formato de pocillo abierto, el sistema debe reconfigurarse para realizar ensayos basados en protocolos estándar^16,19.

1. Detenga la bomba cuando se alcance el tiempo deseado para la exposición al flujo de cizallamiento. Retire las puntas dispensadoras de entrada y salida.
2. Retire la carcasa superior. Retire suavemente el módulo de flujo del pozo con unas pinzas.
3. Agregue 100 μL de medio celular al pocillo. Realice los ensayos deseados basados en protocolos estándar.

Resultados

El módulo de núcleo de pozo abierto se coloca inicialmente dentro de una cavidad específica creada por una carcasa inferior y un cubreobjetos, como se ilustra en la Figura 6A. Posteriormente, el módulo de flujo, que incluye un microcanal y puertos de acceso, se inserta en el pozo del módulo central. El módulo de flujo está sellado de forma segura contra la capa de soporte de silicio de la membrana debido a la fuerza de atracción magnética entre los imanes incrustados en las carcasas...

Discusión

El objetivo de este protocolo es desarrollar un método práctico para incorporar capacidades de flujo en una plataforma de pozo abierto con una nanomembrana ultrafina. En este diseño, se utiliza un enfoque de enclavamiento magnético, lo que permite cambiar entre los modos de pozo abierto y fluídico durante los experimentos y combinar las ventajas de ambos enfoques. A diferencia de las plataformas convencionales unidas permanentemente, el cierre magnético permite desmontar la plataforma en puntos convenientes durante...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA