Umwandlung von statischen Barrieregewebemodellen in dynamische mikrophysiologische Systeme

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine rekonfigurierbare membranbasierte Zellkulturplattform, die das Open-Well-Format mit Flüssigkeitsflussfunktionen integriert. Diese Plattform ist mit Standardprotokollen kompatibel und ermöglicht reversible Übergänge zwischen Open-Well- und mikrofluidischen Kulturmodi, um den Anforderungen von Ingenieur- und Biowissenschaftslabors gerecht zu werden.

Zusammenfassung

Mikrophysiologische Systeme sind miniaturisierte Zellkulturplattformen, die verwendet werden, um die Struktur und Funktion menschlicher Gewebe in einer Laborumgebung nachzuahmen. Diese Plattformen haben jedoch keine breite Akzeptanz in biowissenschaftlichen Labors gefunden, wo membranbasierte Ansätze mit offenen Bohrlöchern als Goldstandard für die Nachahmung von Gewebebarrieren dienen, obwohl sie keine Flüssigkeitsflussfähigkeiten haben. Dieses Problem kann in erster Linie auf die Inkompatibilität bestehender mikrophysiologischer Systeme mit Standardprotokollen und -werkzeugen zurückgeführt werden, die für Open-Well-Systeme entwickelt wurden.

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung einer rekonfigurierbaren membranbasierten Plattform mit einer Open-Well-Struktur, Durchflussverbesserungsfähigkeit und Kompatibilität mit herkömmlichen Protokollen vor. Dieses System verwendet einen magnetischen Montageansatz, der ein reversibles Umschalten zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus ermöglicht. Mit diesem Ansatz haben Benutzer die Flexibilität, ein Experiment im Open-Well-Format mit Standardprotokollen zu beginnen und bei Bedarf Durchflussfunktionen hinzuzufügen oder zu entfernen. Um die praktische Anwendung dieses Systems und seine Kompatibilität mit Standardtechniken zu demonstrieren, wurde eine Endothelzell-Monoschicht in einem Open-Well-Format etabliert. Das System wurde neu konfiguriert, um einen Flüssigkeitsfluss einzuführen, und dann auf das Open-Well-Format umgestellt, um Immunfärbung und RNA-Extraktion durchzuführen. Aufgrund seiner Kompatibilität mit herkömmlichen Open-Well-Protokollen und der Fähigkeit zur Flussverbesserung wird erwartet, dass dieses rekonfigurierbare Design sowohl von technischen als auch von biowissenschaftlichen Labors übernommen wird.

Einleitung

Gefäßbarrieren dienen als kritische Schnittstelle, die das Blutkompartiment vom umgebenden Gewebe trennt. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Homöostase, indem sie Immunzellen anziehen, die molekulare Permeabilität kontrollieren und das Eindringen von Krankheitserregern in das Gewebe verhindern ^1,2. In-vitro-Kulturmodelle wurden entwickelt, um die In-vivo-Mikroumgebung nachzuahmen und systematische Untersuchungen der Faktoren und Bedingungen zu ermöglichen, die die Barriereeigenschaften sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand beeinflussen ^3,4.

Der am weitesten verbreitete Ansatz für solche Kulturmodelle ist die Transwell-ähnliche "Open-Well"-Konfiguration⁵, bei der eine poröse, spurgeätzte Kulturmembran mediengefüllte Kompartimente trennt (Abbildung 1A). In diesem Format können Zellen auf beiden Seiten der Membran ausgesät werden, und es wurde eine breite Palette von experimentellen Protokollen entwickelt. Diese Systeme sind jedoch nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Flüssigkeitsströme bereitzustellen, die für die Unterstützung der Barrierereifung und die Nachahmung der Immunzellzirkulation in vivo unerlässlich sind ^5,6. Folglich können sie nicht für Studien verwendet werden, die dynamische Strömungen erfordern, die Arzneimitteldosen, mechanische Stimulation oder flüssigkeitsinduzierte Scherspannungen einführen ^6,7,8.

Um die Einschränkungen von Open-Well-Systemen zu überwinden, wurden mikrofluidische Plattformen entwickelt, die poröse Kulturmembranen mit individuell adressierbaren fluidischen Kanälen kombinieren⁹. Diese Plattformen bieten eine präzise Kontrolle über das Routing von Flüssigkeiten, die Perfusion und das Einbringen chemischer Verbindungen, eine kontrollierte Scherstimulation und dynamische Zelladditionsfunktionen 7,10,11,12,13. Trotz der fortschrittlichen Fähigkeiten, die mikrofluidische Plattformen bieten, haben sie aufgrund komplexer mikrofluidischer Protokolle und ihrer Inkompatibilität mit etablierten experimentellen Arbeitsabläufen keine weit verbreitete Akzeptanz in biowissenschaftlichen Labors^{gefunden 4,10,14}.

Um die Lücke zwischen diesen Technologien zu schließen, stellen wir ein Protokoll vor, das ein magnetisch rekonfigurierbares, modulbasiertes System verwendet. Dieses System kann je nach den spezifischen Anforderungen des Experiments einfach zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus umgeschaltet werden. Die Plattform verfügt über ein Open-Well-Gerät, bekannt als m-μSiM (modulares mikrophysiologisches System, das durch eine Siliziummembran ermöglicht wird), mit einer 100 nm dicken Kulturmembran (Nanomembran). Diese Nanomembran besitzt eine hohe Porosität (15 %) und glasartige Transparenz, wie in Abbildung 1B dargestellt. Es trennt physikalisch das obere Kompartiment von einem unteren Kanal und ermöglicht so den molekularen Transport über physiologische Längenskalen¹⁵. Im Gegensatz zu herkömmlichen spurgeätzten Membranen, die bekannte Herausforderungen bei der Bildgebung lebender Zellen mit Hellfeld-Bildgebung haben, ermöglichen die günstigen optischen und physikalischen Eigenschaften der Nanomembran eine klare Visualisierung von Zellen auf beiden Seiten der Membranoberfläche 15,16,17.

Das vorliegende Protokoll skizziert die Herstellung von spezialisierten Seeding- und Flow-Modulen und erklärt die magnetische Rekonfiguration der Plattform. Es zeigt, wie die Plattform eingesetzt werden kann, um Endothelbarrieren sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen zu etablieren. Diese Demonstration zeigt, dass sich Endothelzellen entlang der Flussrichtung ausrichten, wobei die scherempfindlichen Genziele unter Scherstimulation hochreguliert werden.

Protokoll

Dieses Design kann in verschiedenen Modi verwendet werden, basierend auf experimentellen Anforderungen und den Vorlieben des Endbenutzers. Konsultieren Sie vor jedem Experiment das in Abbildung 2 dargestellte Entscheidungsflussdiagramm, um die erforderlichen Schritte und Module für das Protokoll zu bestimmen. Wenn der Benutzer beispielsweise beabsichtigt, das Open-Well-Format während eines Experiments beizubehalten, um es direkt mit dem Transwell-System zu vergleichen, ist die Strukturierungsschablone für die Zellaussaat nicht erforderlich. Das Kernmodul ist im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle), und die ultradünne Nanomembran kann aus einer Bibliothek von Materialien mit unterschiedlicher Porosität und Porengröße ausgewählt werden, um den experimentellen Anforderungen gerecht zu werden.

1. Herstellung der Musterschablone

HINWEIS: Die Strukturierungsschablone dient dazu, Zellen ausschließlich auf dem porösen Bereich des Membranchips zu positionieren und zu verhindern, dass sich Zellen auf der umgebenden Siliziumschicht absetzen, wo sie möglicherweise beschädigt werden könnten, nachdem das Durchflussmodul^{hinzugefügt wurde 16} (siehe Abbildung 3). Eine Beschädigung der Monoschicht kann die Integrität der Barriere beeinträchtigen und die Versuchsergebnisse beeinträchtigen. Die Schablone ist in einer offenen, statischen Kultur unnötig, da keine Gefahr einer Beschädigung besteht.

1. Kaufen, bearbeiten oder drucken Sie eine Form in 3D mit dem Design in der ergänzenden Codierungsdatei 1 (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Die Schablonenwände sind verjüngt, um die Medienkapazität zu erhöhen und Blaseneinschlüsse im Vergleich zu geraden Elementen mit hohem Seitenverhältnis zu minimieren.
2. Befestigen Sie eine 130 μm Haftklebefolie (PSA) mit einer Kaltwalze auf einer 3,2 mm Acrylplatte (siehe Materialtabelle).
3. Laserschneiden Sie die Acrylplatte gemäß dem Design in der ergänzenden Codierungsdatei 2 , um eine Reihe von Hohlräumen zu erstellen (Abbildung 4B).
4. Ziehen Sie die Schutzschicht von der PSA-Folie ab und befestigen Sie die Acrylplatte an der Form.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das lasergeschnittene Blech mit der Form ausgerichtet ist, sodass die Formmerkmale in der Kavität zentriert sind (Abbildung 4C). Die Genauigkeit der Zellpositionierung auf der Membran hängt von diesem Schritt ab.
5. Mischen Sie das PDMS-Prepolymer gründlich (mit einem Base-Katalysator-Verhältnis von 10:1) (siehe Materialtabelle) und entgasen Sie es in einer Vakuumkammer, bis keine sichtbaren Blasen mehr vorhanden sind (5-15 min).
6. Gießen Sie das PDMS langsam in die Formhohlräume und richten Sie es mit einer flachen Kante aus.
   HINWEIS: Um Blaseneinschlüsse zu vermeiden, gießen Sie das PDMS langsam in jeden Hohlraum. Wenn nach dem Gießen Blasen vorhanden sind, stellen Sie die Form in die Vakuumkammer und entgasen Sie sie erneut.
7. Das PDMS auf einer Kochplatte bei 70 °C 1 h aushärten und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
8. Ziehen Sie die Schablonen mit einer Pinzette mit flacher Spitze aus den Formhohlräumen.

2. Herstellung des Strömungsmoduls

HINWEIS: Das Durchflussmodul hat eine ähnliche Grundfläche wie die kleeförmige Vertiefung des Kernmoduls und enthält einen geformten Mikrokanal (Breite = 1,5 mm, Höhe = 0,2 mm, Länge = 5 mm). Die Kleeform hilft bei der Ausrichtung des Kanals über dem porösen Kulturbereich (Abbildung 5).

1. Verwenden Sie Standard-Softlithographietechniken¹⁸ , um eine Silikonform mit Merkmalen zu erstellen, die durch die in der ergänzenden Codierungsdatei 3 (Figur 4D) bereitgestellte Konstruktion definiert sind.
2. Befestigen Sie eine 130 μm PSA-Folie auf einer 3,2 mm dicken Acrylplatte.
3. Laserschneiden Sie die Acrylplatte basierend auf dem in der ergänzenden Codierungsdatei 4 angegebenen Design, um eine Reihe kleeförmiger Hohlräume zu erstellen (Abbildung 4E).
   HINWEIS: Die Höhe des Hohlraums bestimmt die Höhe des Durchflussmoduls, das etwas höher (um 0-0,1 mm) als die Höhe des Kernmodulschachts sein muss, um eine ordnungsgemäße Abdichtung zu gewährleisten.
4. Entfernen Sie die Schutzschicht von der PSA-Folie und befestigen Sie dann das lasergeschnittene Blech an der Silikonform, indem Sie die dreieckigen Ausrichtungsmarkierungen auf der Silikonform mit denen auf dem lasergeschnittenen Blech ausrichten.
   HINWEIS: Stellen Sie ähnlich wie in Schritt 1.4 sicher, dass die lasergeschnittene Acrylplatte mit der Silikonform ausgerichtet ist, sodass die Formmerkmale in jedem Hohlraum zentriert sind (Abbildung 4F). Dieser Schritt bestimmt die Position des Mikrokanals relativ zum Footprint.
5. Gießen Sie das entgaste PDMS langsam auf die Formhohlräume und richten Sie es mit einer flachen Kante aus.
   Anmerkungen: Wenn nach dem Gießen Blasen vorhanden sind, entgasen Sie die Form, bis die Blasen entfernt sind.
6. Stellen Sie die Form auf eine Kochplatte und backen Sie das PDMS bei 70 °C für 1 h, dann lassen Sie die Form auf Raumtemperatur abkühlen.
7. Entfernen Sie die Strömungsmodule vorsichtig mit einer Pinzette mit flacher Spitze aus den Formhohlräumen.
8. Richten Sie das Durchflussmodul so aus, dass die Mikrokanalmerkmale nach oben zeigen, und positionieren Sie die Kerneinlass- und -auslassöffnungen mit einem Biopsiestempel am Ende des Kanals (siehe Materialtabelle).

3. Herstellung von unteren und oberen Acrylgehäusen

HINWEIS: Das Kernmodul passt in das untere Gehäuse. Die Anziehung zwischen eingebetteten Magneten in den Gehäusen komprimiert und dichtet das Strömungsmodul zum Kernmodul ab (Abbildung 6).

1. Laserschneiden Sie eine 2 mm dicke Acrylplatte mit dem in der ergänzenden Codierungsdatei 5 bereitgestellten Design, um das obere Gehäuse mit Löchern für den Magneteinsatz zu erstellen.
2. Befestigen Sie eine 130 μm PSA-Folie auf einer 3,5 mm Acrylplatte.
3. Laserschneiden Sie die Acrylplatte basierend auf dem in der ergänzenden Codierungsdatei 6 angegebenen Design, um das untere Gehäuse mit Löchern für den Magneteinsatz zu erstellen.
   HINWEIS: Die Dicke des unteren Gehäuses ist ein kritischer Parameter und muss mit der Gesamtdicke des Kernmoduls übereinstimmen, um Leckagen während des Durchflusses zu vermeiden.
4. Entfernen Sie die PSA-Schutzschicht und befestigen Sie das untere Gehäuse an einem Glasdeckglas.
5. 4,75 mm vernickelte Neodym-Magnete (siehe Materialtabelle) in die lasergeschnittenen Löcher der Gehäuse einpressen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Magnete im unteren und oberen Gehäuse mit entgegengesetzter Polarität platziert sind, um die magnetische Anziehung zu gewährleisten (Abbildung 6).

4. Herstellung des Strömungskreislaufs

HINWEIS: Der geschlossene Durchflusskreislauf enthält zwei Probensammelfläschchen als Reservoire (Abbildung 7). Das Einlassreservoir verfügt über einen Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Filter, damit sich die Zellmedien mit der CO_{2 -} Konzentration im Inkubator ausgleichen können.

1. Verwenden Sie einen 1-mm-Biopsiestanzer, um zwei Löcher in die Kappe eines Probenentnahmefläschchens zu bohren.
2. Verwenden Sie Biopsiestempel, um zwei Löcher (1 mm und 4 mm) in die Kappe eines separaten Probenentnahmefläschchens zu bohren, und erzeugen Sie ein 1 mm großes Loch im unteren Teil dieses Fläschchens.
3. In jedes der 1 mm Löcher 20 G Dosierspitzen stecken und mit Heißkleber verschließen.
4. Setzen Sie einen 0,22 μm PVDF-Filter (siehe Materialtabelle) in das 4 mm Loch ein und verschließen Sie ihn mit Heißkleber.
5. Laserschneiden Sie eine 1,5 mm dicke Acrylplatte mit dem in der ergänzenden Codierungsdatei 7 bereitgestellten Design, um eine Probenhaltebühne zu erstellen.
6. Positionieren Sie die Behälter auf der Acrylbühne.
7. Verbinden Sie die Dosierspitzen mit Mikro-Durchflussschläuchen (siehe Materialtabelle).
8. Verbinden Sie die Röhrchen mit 21-G-Dosierspitzen mit dem Einlass und Auslass des Durchflussmoduls.
9. Verwenden Sie eine Schlauchpumpe (siehe Materialtabelle) für die Durchflusszirkulation.
   HINWEIS: Auf Wunsch können auch Spritzen- oder Pneumatikpumpen verwendet werden, um den Durchfluss einzuführen. Die Durchflussrate sollte auf der Grundlage der experimentellen Anforderungen bestimmt werden. Eine umfassende Tabelle, die von einem experimentell validierten COMSOL-Modell abgeleitet wurde, ist in der ergänzenden Tabelle 1 enthalten, um die Benutzer bei der Auswahl der erforderlichen Durchflussrate zu unterstützen, um die gewünschte Scherspannung an der Zellmonoschicht¹⁶ zu erreichen.

5. Zellaussaat

HINWEIS: Ähnlich wie bei herkömmlichen Membraneinsätzen können auf der Nanomembran verschiedene Zelltypen kultiviert werden. Ein sekundärer Zelltyp kann auch auf der anderen Seite der Membran im unteren Kanal¹⁵ cokultiviert werden.

1. Beschichten Sie die Membran 1 h lang mit 5 μg/^cm2 Fibronektin (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur, um die Zelladhäsion zu verbessern.
   HINWEIS: Der gewählte Zelltyp kann die erforderliche Beschichtung und Zelldichte beeinflussen. Das hier beschriebene Verfahren gilt für humane Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs, siehe Materialtabelle).
2. Saugen Sie die Beschichtungslösung mit einer P200-Pipette an und legen Sie eine Musterschablone in die Vertiefung des Kernmoduls.
3. Fügen Sie dem Well und dem unteren Kanal des Geräts Zellmedien hinzu.
4. HUVECs mit einer Dichte von 40.000 Zellen/^cm2 in die Vertiefung säen.
   HINWEIS: HUVECs mit dieser Dichte bilden typischerweise nach 24 Stunden Inkubation eine konfluente Monoschicht^16,19.
5. Stellen Sie das Gerät in eine Petrischale. Geben Sie eine konische 15-ml-Röhrchenkappe mit DI-Wasser in die Petrischale, um die lokale Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
6. Übertragen Sie die Petrischale in den Inkubator.
   HINWEIS: Die Zellmedien im oberen und unteren Kanal des Geräts sollten alle 24 Stunden gewechselt werden. Um das Medium im unteren Kanal zu wechseln, spritzen Sie vorsichtig frisches Medium in einen der Anschlüsse, um das alte Medium vom anderen Port zu verdrängen.

6. Rekonfiguration in den mikrofluidischen Modus

1. Sterilisieren Sie das obere Gehäuse, das untere Gehäuse, das Durchflussmodul, die Reservoirs, die Röhrchen und die Dosierspitzen, indem Sie sie vor der Montage 30 Minuten lang in eine UV-Sterilisationskammer legen. 70% Ethanol umwälzen und dann steriles PBS im Durchflusskreislauf sterilisieren.
2. Füllen Sie die Reservoirs und Röhrchen mit Endothelzellwachstumsmedien (siehe Materialtabelle).
3. Setzen Sie das untere Gehäuse auf den Probentisch. Setzen Sie das Open-Well-Core-Modul in das untere Gehäuse ein.
4. Saugen Sie Zellmedien aus der Vertiefung des Moduls an. Setzen Sie das Durchflussmodul in die Vertiefung ein.
5. Platzieren Sie das obere Gehäuse, um das Durchflussmodul abzudichten, in der Vertiefung des Kernmoduls. Schließen Sie die Einlass- und Auslassdosierspitzen an die Anschlüsse des Durchflussmoduls an.
6. Starten Sie die Schlauchpumpe, um den Flüssigkeitsfluss in das System einzuleiten.

7. Durchführung von Downstream-Analysen im Open-Well-Format nach der Durchflusseinführung

HINWEIS: Die Kulturzeit hängt hier von den experimentellen Zielen ab. Benutzer können nachgelagerte Analysen (z. B. Immunzytochemie, RNA-Extraktion) je nach Wunsch entweder im Open-Well- oder im Mikrofluidik-Format durchführen. Wenn beispielsweise ein Open-Well-Format bevorzugt wird, sollte das System neu konfiguriert werden, um Assays auf der Grundlage von Standardprotokollen^{durchzuführen 16,19}.

1. Stoppen Sie die Pumpe, wenn die gewünschte Zeit für die Scherflussexposition erreicht ist. Entfernen Sie die Einlass- und Auslassdosierspitzen.
2. Entfernen Sie das obere Gehäuse. Entfernen Sie das Durchflussmodul vorsichtig mit einer Pinzette aus der Vertiefung.
3. Geben Sie 100 μl Zellmedien in die Vertiefung. Führen Sie die gewünschten Assays auf der Grundlage von Standardprotokollen durch.

Ergebnisse

Das Open-Well-Core-Modul wird zunächst in einem bestimmten Hohlraum positioniert, der durch ein niedrigeres Gehäuse und ein Deckglas entsteht, wie in Abbildung 6A dargestellt. Anschließend wird das Durchflussmodul, das einen Mikrokanal und Zugangsöffnungen umfasst, in die Vertiefung des Kernmoduls eingesetzt. Das Strömungsmodul ist aufgrund der magnetischen Anziehungskraft zwischen Magneten, die in das untere und obere Gehäuse eingebettet sind, wie in Abbildung 6B<...

Diskussion

Ziel dieses Protokolls ist es, eine praktische Methode zu entwickeln, um Durchflussfähigkeiten in eine Open-Well-Plattform mit einer ultradünnen Nanomembran zu integrieren. Bei diesem Design wird ein magnetischer Verriegelungsansatz verwendet, der es ermöglicht, während der Experimente zwischen Open-Well- und Fluidic-Modus zu wechseln und die Vorteile beider Ansätze zu kombinieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen dauerhaft verklebten Plattformen ermöglicht die magnetische Verriegelung die Demontage der Plattform an ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA