Umwandlung von statischen Barrieregewebemodellen in dynamische mikrophysiologische Systeme

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine rekonfigurierbare membranbasierte Zellkulturplattform, die das Open-Well-Format mit Flüssigkeitsflussfunktionen integriert. Diese Plattform ist mit Standardprotokollen kompatibel und ermöglicht reversible Übergänge zwischen Open-Well- und mikrofluidischen Kulturmodi, um den Anforderungen von Ingenieur- und Biowissenschaftslabors gerecht zu werden.

Zusammenfassung

Mikrophysiologische Systeme sind miniaturisierte Zellkulturplattformen, die verwendet werden, um die Struktur und Funktion menschlicher Gewebe in einer Laborumgebung nachzuahmen. Diese Plattformen haben jedoch keine breite Akzeptanz in biowissenschaftlichen Labors gefunden, wo membranbasierte Ansätze mit offenen Bohrlöchern als Goldstandard für die Nachahmung von Gewebebarrieren dienen, obwohl sie keine Flüssigkeitsflussfähigkeiten haben. Dieses Problem kann in erster Linie auf die Inkompatibilität bestehender mikrophysiologischer Systeme mit Standardprotokollen und -werkzeugen zurückgeführt werden, die für Open-Well-Systeme entwickelt wurden.

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung einer rekonfigurierbaren membranbasierten Plattform mit einer Open-Well-Struktur, Durchflussverbesserungsfähigkeit und Kompatibilität mit herkömmlichen Protokollen vor. Dieses System verwendet einen magnetischen Montageansatz, der ein reversibles Umschalten zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus ermöglicht. Mit diesem Ansatz haben Benutzer die Flexibilität, ein Experiment im Open-Well-Format mit Standardprotokollen zu beginnen und bei Bedarf Durchflussfunktionen hinzuzufügen oder zu entfernen. Um die praktische Anwendung dieses Systems und seine Kompatibilität mit Standardtechniken zu demonstrieren, wurde eine Endothelzell-Monoschicht in einem Open-Well-Format etabliert. Das System wurde neu konfiguriert, um einen Flüssigkeitsfluss einzuführen, und dann auf das Open-Well-Format umgestellt, um Immunfärbung und RNA-Extraktion durchzuführen. Aufgrund seiner Kompatibilität mit herkömmlichen Open-Well-Protokollen und der Fähigkeit zur Flussverbesserung wird erwartet, dass dieses rekonfigurierbare Design sowohl von technischen als auch von biowissenschaftlichen Labors übernommen wird.

Einleitung

Gefäßbarrieren dienen als kritische Schnittstelle, die das Blutkompartiment vom umgebenden Gewebe trennt. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Homöostase, indem sie Immunzellen anziehen, die molekulare Permeabilität kontrollieren und das Eindringen von Krankheitserregern in das Gewebe verhindern ^1,2. In-vitro-Kulturmodelle wurden entwickelt, um die In-vivo-Mikroumgebung nachzuahmen und systematische Untersuchungen der Faktoren und Bedingungen zu ermöglichen, die die Barriereeigenschaften sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand beeinflussen ^3,4<....

Protokoll

Dieses Design kann in verschiedenen Modi verwendet werden, basierend auf experimentellen Anforderungen und den Vorlieben des Endbenutzers. Konsultieren Sie vor jedem Experiment das in Abbildung 2 dargestellte Entscheidungsflussdiagramm, um die erforderlichen Schritte und Module für das Protokoll zu bestimmen. Wenn der Benutzer beispielsweise beabsichtigt, das Open-Well-Format während eines Experiments beizubehalten, um es direkt mit dem Transwell-System zu vergleichen, ist die Strukturierungsschablone für die Zellaussaat nicht erforderlich. Das Kernmodul ist im Handel erhältlich (siehe Materialtabelle), und die ultradünne....

Diskussion

Ziel dieses Protokolls ist es, eine praktische Methode zu entwickeln, um Durchflussfähigkeiten in eine Open-Well-Plattform mit einer ultradünnen Nanomembran zu integrieren. Bei diesem Design wird ein magnetischer Verriegelungsansatz verwendet, der es ermöglicht, während der Experimente zwischen Open-Well- und Fluidic-Modus zu wechseln und die Vorteile beider Ansätze zu kombinieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen dauerhaft verklebten Plattformen ermöglicht die magnetische Verriegelung die Demontage der Plattform an .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA