将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

摘要

该协议描述了一种可重新配置的基于膜的细胞培养平台，该平台将开孔形式与流体流动功能集成在一起。该平台与标准方案兼容，并允许在开孔和微流控培养模式之间进行可逆过渡，以满足工程和生物科学实验室的需求。

摘要

微生理系统是小型化的细胞培养平台，用于在实验室环境中模拟人体组织的结构和功能。然而，这些平台尚未在生物科学实验室中得到广泛采用，尽管缺乏流体流动能力，但基于膜的开放式方法仍是模拟组织屏障的黄金标准。这个问题主要归因于现有的微生理系统与为明井系统开发的标准协议和工具不兼容。

在这里，我们提出了一种协议，用于创建具有开井结构、流量增强能力以及与传统协议兼容的可重构膜平台。该系统采用磁性组装方法，可在开井和微流体模式之间进行可逆切换。通过这种方法，用户可以灵活地使用标准方案以开孔形式开始实验，并根据需要添加或删除流动功能。为了证明该系统的实际用途及其与标准技术的兼容性，以开孔形式建立了内皮细胞单层。该系统被重新配置以引入流体流动，然后切换到开孔形式以进行免疫染色和 RNA 提取。由于其与传统开井方案的兼容性和流量增强能力，这种可重构设计有望被工程和生物科学实验室采用。

引言

血管屏障是将血室与周围组织分开的关键界面。它们通过吸引免疫细胞、控制分子通透性和屏蔽病原体侵入组织，在维持体内平衡方面发挥着关键作用 ^1,2。已经开发了体外培养模型来模拟体内微环境，从而能够系统地研究影响健康和疾病状态下屏障特性的因素和条件^3,4。

对于这种培养模型，最广泛使用的方法是类似Transwell的“开孔”配置⁵，其中多孔的、迹状蚀刻的培养膜将充满培养基的隔室分开（图1A）。在这种形式下，细胞可以接种在膜的任一侧，并且已经开发了广泛的实验方案。然而，这些系统提供支持屏障成熟和模拟体内免疫细胞循环所必需的流体流动的能力有限 ^5,6。因此，它们不能用于需要引入药物剂量、机械刺激或流体诱导剪切应力的动态流动的研究 ^6,7,8

研究方案

该设计可以根据实验要求和最终用户的偏好在各种模式下使用。在每次实验之前，请查阅 图2 所示的决策流程图，以确定方案的必要步骤和模块。例如，如果用户打算在整个实验过程中保持开孔格式，以直接将其与Transwell型系统进行比较，则细胞接种不需要图案模板。核心模块是市售的（见 材料表），超薄纳米膜可以从具有不同孔隙率和孔径的材料库中进行选择，以满足实验需求。

1. 图案模板的制作

注意：图案化模板用于将电池专门放置在膜芯片的多孔区域上，防止电池沉降到周围的硅层上，在添加流量模块后，它们可能会受到损坏¹⁶ （参见 图3）。单层的损坏会对屏障完整性产生不利影响，并影响实验结果。在开放、静态的培养中，模板是不必要的，因为没有损坏的风险。

1. 使用 补充编码文件 1 （图 4A）中提供的设计购买、加工或 3D 打印模具。
   注意：与高纵横比直壁特征相比，模板壁呈锥形，以增加介质容量并最大限度地减少气泡捕获。
2. 使用冷辊将 130 μm 压敏胶 （PSA） 薄膜连接到 3.....

讨论

该协议的目的是开发一种实用的方法，将流动能力整合到具有超薄纳米膜的开孔平台中。在这种设计中，采用了磁闭锁方法，允许在实验期间在开井和流体模式之间切换，并结合了两种方法的优点。与传统的永久粘合平台不同，磁性锁存允许在实验工作流程16,25,26,27的方便点拆卸平台。在这个平台中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA