Transformer des modèles de tissus de barrière statique en systèmes microphysiologiques dynamiques

Résumé

Ce protocole décrit une plate-forme de culture cellulaire reconfigurable à base de membranes qui intègre le format à puits ouvert avec des capacités d’écoulement de fluide. Cette plateforme est compatible avec les protocoles standard et permet des transitions réversibles entre les modes de culture à puits ouvert et microfluidique, répondant aux besoins des laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Résumé

Les systèmes microphysiologiques sont des plateformes de culture cellulaire miniaturisées utilisées pour imiter la structure et la fonction des tissus humains en laboratoire. Cependant, ces plateformes n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences où les approches membranaires à puits ouverts servent de référence pour imiter les barrières tissulaires, malgré l’absence de capacités d’écoulement des fluides. Ce problème peut être principalement attribué à l’incompatibilité des systèmes microphysiologiques existants avec les protocoles et outils standard développés pour les systèmes à puits ouverts.

Ici, nous présentons un protocole pour créer une plate-forme membranaire reconfigurable avec une structure à puits ouverts, une capacité d’amélioration de l’écoulement et une compatibilité avec les protocoles conventionnels. Ce système utilise une approche d’assemblage magnétique qui permet une commutation réversible entre les modes puits ouverts et microfluidique. Grâce à cette approche, les utilisateurs ont la possibilité de commencer une expérience dans le format de puits ouvert en utilisant des protocoles standard et d’ajouter ou de supprimer des capacités d’écoulement selon les besoins. Pour démontrer l’utilisation pratique de ce système et sa compatibilité avec les techniques standard, une monocouche de cellules endothéliales a été établie dans un format à puits ouvert. Le système a été reconfiguré pour introduire un flux de fluide, puis est passé au format à puits ouvert pour effectuer l’immunomarquage et l’extraction de l’ARN. En raison de sa compatibilité avec les protocoles conventionnels à puits ouverts et de sa capacité d’amélioration de l’écoulement, cette conception reconfigurable devrait être adoptée par les laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Introduction

Les barrières vasculaires servent d’interface critique qui sépare le compartiment sanguin des tissus environnants. Ils jouent un rôle essentiel dans la préservation de l’homéostasie en attirant les cellules immunitaires, en contrôlant la perméabilité moléculaire et en protégeant contre l’intrusion d’agents pathogènes dans les tissus ^1,2. Des modèles de culture in vitro ont été développés pour imiter le microenvironnement in vivo, permettant des études systématiques sur les facteurs et les conditions qui ont un impact sur les propriétés de barrière à l’état sain et malade ^3....

Protocole

Cette conception peut être utilisée dans différents modes en fonction des exigences expérimentales et des préférences de l’utilisateur final. Avant chaque expérience, consultez l’organigramme de décision présenté à la figure 2 pour déterminer les étapes et les modules nécessaires au protocole. Par exemple, si l’utilisateur a l’intention de conserver le format à puits ouvert tout au long d’une expérience pour le comparer directement avec le système de type Transwell, le gabarit de motif n’est pas nécessaire pour l’ensemencement cellulaire. Le module de base est disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux), et l....

Discussion

L’objectif de ce protocole est de développer une méthode pratique pour intégrer les capacités d’écoulement dans une plate-forme à puits ouvert dotée d’une nanomembrane ultrafine. Dans cette conception, une approche de verrouillage magnétique est utilisée, permettant de basculer entre les modes puits ouvert et fluidique pendant les expériences et combinant les avantages des deux approches. Contrairement aux plates-formes conventionnelles à liaison permanente, le verrouillage magnétique permet de démonte.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA