Transformer des modèles de tissus de barrière statique en systèmes microphysiologiques dynamiques

Résumé

Ce protocole décrit une plate-forme de culture cellulaire reconfigurable à base de membranes qui intègre le format à puits ouvert avec des capacités d’écoulement de fluide. Cette plateforme est compatible avec les protocoles standard et permet des transitions réversibles entre les modes de culture à puits ouvert et microfluidique, répondant aux besoins des laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Résumé

Les systèmes microphysiologiques sont des plateformes de culture cellulaire miniaturisées utilisées pour imiter la structure et la fonction des tissus humains en laboratoire. Cependant, ces plateformes n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences où les approches membranaires à puits ouverts servent de référence pour imiter les barrières tissulaires, malgré l’absence de capacités d’écoulement des fluides. Ce problème peut être principalement attribué à l’incompatibilité des systèmes microphysiologiques existants avec les protocoles et outils standard développés pour les systèmes à puits ouverts.

Ici, nous présentons un protocole pour créer une plate-forme membranaire reconfigurable avec une structure à puits ouverts, une capacité d’amélioration de l’écoulement et une compatibilité avec les protocoles conventionnels. Ce système utilise une approche d’assemblage magnétique qui permet une commutation réversible entre les modes puits ouverts et microfluidique. Grâce à cette approche, les utilisateurs ont la possibilité de commencer une expérience dans le format de puits ouvert en utilisant des protocoles standard et d’ajouter ou de supprimer des capacités d’écoulement selon les besoins. Pour démontrer l’utilisation pratique de ce système et sa compatibilité avec les techniques standard, une monocouche de cellules endothéliales a été établie dans un format à puits ouvert. Le système a été reconfiguré pour introduire un flux de fluide, puis est passé au format à puits ouvert pour effectuer l’immunomarquage et l’extraction de l’ARN. En raison de sa compatibilité avec les protocoles conventionnels à puits ouverts et de sa capacité d’amélioration de l’écoulement, cette conception reconfigurable devrait être adoptée par les laboratoires d’ingénierie et de biosciences.

Introduction

Les barrières vasculaires servent d’interface critique qui sépare le compartiment sanguin des tissus environnants. Ils jouent un rôle essentiel dans la préservation de l’homéostasie en attirant les cellules immunitaires, en contrôlant la perméabilité moléculaire et en protégeant contre l’intrusion d’agents pathogènes dans les tissus ^1,2. Des modèles de culture in vitro ont été développés pour imiter le microenvironnement in vivo, permettant des études systématiques sur les facteurs et les conditions qui ont un impact sur les propriétés de barrière à l’état sain et malade ^3,4.

L’approche la plus largement utilisée pour de tels modèles de culture est la configuration « à puits ouvert »^de type Transwell 5, où une membrane de culture poreuse et gravée sépare les compartiments remplis de milieux (Figure 1A). Dans ce format, les cellules peuvent être ensemencées de chaque côté de la membrane, et un large éventail de protocoles expérimentaux a été développé. Cependant, ces systèmes sont limités dans leur capacité à fournir les flux de fluides essentiels pour soutenir la maturation de la barrière et imiter la circulation des cellules immunitaires observée in vivo ^5,6. Par conséquent, ils ne peuvent pas être utilisés pour des études nécessitant des écoulements dynamiques qui introduisent des doses de médicaments, une stimulation mécanique ou des contraintes de cisaillement induites par un fluide ^6,7,8.

Pour surmonter les limites des systèmes à puits ouverts, des plateformes microfluidiques combinant des membranes de culture poreuses avec des canaux fluidiques adressables individuellement ont été développées⁹. Ces plates-formes offrent un contrôle précis de l’acheminement des fluides, de la perfusion et de l’introduction de composés chimiques, une stimulation contrôlée par cisaillement et des capacités d’ajout dynamique de cellules 7,10,11,12,13. Malgré les capacités avancées fournies par les plateformes microfluidiques, elles n’ont pas été largement adoptées dans les laboratoires de biosciences en raison de protocoles microfluidiques complexes et de leur incompatibilité avec les flux de travail expérimentaux établis ^4,10,14.

Pour combler le fossé entre ces technologies, nous présentons un protocole qui utilise un système modulaire magnétiquement reconfigurable. Ce système peut être facilement commuté entre les modes puits ouvert et microfluidique en fonction des besoins spécifiques de l’expérience. La plateforme comprend un dispositif à puits ouvert, connu sous le nom de m-μSiM (système microphysiologique modulaire activé par une membrane de silicium), avec une membrane de culture de 100 nm d’épaisseur (nanomembrane). Cette nanomembrane possède une porosité élevée (15 %) et une transparence semblable à celle du verre, comme illustré à la figure 1B. Il sépare physiquement le compartiment supérieur d’un canal inférieur, permettant le transport moléculaire à travers des échelles de longueur physiologiques¹⁵. Contrairement aux membranes conventionnelles gravées par trace, qui présentent des défis connus pour l’imagerie des cellules vivantes avec l’imagerie en fond clair, les propriétés optiques et physiques favorables de la nanomembrane permettent une visualisation claire des cellules de chaque côté de la surface de la membrane 15,16,17.

Le présent protocole décrit la fabrication de modules d’ensemencement et d’écoulement spécialisés et explique la reconfiguration magnétique de la plate-forme. Il montre comment la plateforme peut être utilisée pour établir des barrières endothéliales dans des conditions statiques et dynamiques. Cette démonstration révèle que les cellules endothéliales s’alignent dans le sens du flux, avec une régulation à la hausse des cibles génétiques sensibles au cisaillement sous stimulation par cisaillement.

Protocole

Cette conception peut être utilisée dans différents modes en fonction des exigences expérimentales et des préférences de l’utilisateur final. Avant chaque expérience, consultez l’organigramme de décision présenté à la figure 2 pour déterminer les étapes et les modules nécessaires au protocole. Par exemple, si l’utilisateur a l’intention de conserver le format à puits ouvert tout au long d’une expérience pour le comparer directement avec le système de type Transwell, le gabarit de motif n’est pas nécessaire pour l’ensemencement cellulaire. Le module de base est disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux), et la nanomembrane ultramince peut être sélectionnée parmi une bibliothèque de matériaux avec différentes porosités et tailles de pores pour répondre aux besoins expérimentaux.

1. Fabrication du pochoir à motifs

REMARQUE : Le pochoir de motif sert à positionner les cellules exclusivement sur la région poreuse de la puce à membrane, empêchant les cellules de se déposer sur la couche de silicium environnante où elles pourraient potentiellement subir des dommages après l’ajout du module de flux¹⁶ (voir Figure 3). Les dommages à la monocouche peuvent nuire à l’intégrité de la barrière et compromettre les résultats expérimentaux. Le pochoir n’est pas nécessaire dans une culture ouverte et statique, car il n’y a aucun risque de dommages.

1. Achetez, usinez ou imprimez en 3D un moule à l’aide de la conception fournie dans le fichier de codage supplémentaire 1 (Figure 4A).
   REMARQUE : Les parois du pochoir sont effilées pour augmenter la capacité du support et minimiser le piégeage des bulles par rapport aux caractéristiques à paroi droite à rapport d’aspect élevé.
2. Fixez un film adhésif sensible à la pression (PSA) de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,2 mm à l’aide d’un rouleau froid (voir le tableau des matériaux).
3. Découpez la feuille d’acrylique au laser selon le modèle fourni dans le fichier de codage supplémentaire 2 pour créer un ensemble de cavités (figure 4B).
4. Décollez la couche protectrice du film PSA et fixez la feuille acrylique au moule.
   REMARQUE : Assurez-vous que la feuille découpée au laser est alignée avec le moule afin que les caractéristiques du moule soient centrées dans la cavité (Figure 4C). La précision du positionnement des cellules sur la membrane dépend de cette étape.
5. Bien mélanger le prépolymère PDMS (en utilisant un rapport base/catalyseur de 10 :1) (voir tableau des matériaux) et le dégazer dans une chambre à vide jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles visibles (5-15 min).
6. Versez lentement le PDMS dans les cavités du moule, en le nivelant avec un bord plat.
   REMARQUE : Pour éviter le piégeage des bulles, versez lentement le PDMS dans chaque cavité. Si des bulles sont présentes après le versement, placez le moule dans la chambre à vide et dégazez-le à nouveau.
7. Faites durcir le PDMS sur une plaque chauffante à 70 °C pendant 1 h, puis laissez-le refroidir à température ambiante.
8. Extraire les pochoirs des cavités du moule à l’aide d’une pince à épiler à bout plat.

2. Fabrication du module d’écoulement

REMARQUE : Le module d’écoulement partage une empreinte similaire à celle du puits en forme de trèfle du module central et comprend un microcanal moulé (largeur = 1,5 mm, hauteur = 0,2 mm, longueur = 5 mm). La forme du trèfle aide à aligner le canal sur la région de culture poreuse (figure 5).

1. Utiliser des techniques standard de lithographie douce¹⁸ pour créer un moule en silicium avec des caractéristiques définies par la conception fournie dans le fichier de codage supplémentaire 3 (figure 4D).
2. Fixez un film PSA de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,2 mm d’épaisseur.
3. Découpez la feuille d’acrylique au laser en vous basant sur le dessin donné dans le fichier de codage supplémentaire 4 pour créer un ensemble de cavités en forme de trèfle (figure 4E).
   REMARQUE : La hauteur de la cavité détermine la hauteur du module d’écoulement, qui doit être légèrement plus haute (de 0 à 0,1 mm) que la hauteur du puits du module central pour assurer une bonne étanchéité.
4. Retirez la couche protectrice du film PSA, puis fixez la feuille découpée au laser sur le moule en silicone en alignant les marques d’alignement triangulaires sur le moule en silicone avec celles de la feuille découpée au laser.
   REMARQUE : Comme à l’étape 1.4, assurez-vous que la feuille acrylique découpée au laser est alignée avec le moule en silicone afin que les caractéristiques du moule soient centrées dans chaque cavité (Figure 4F). Cette étape détermine la position du microcanal par rapport à l’empreinte.
5. Versez lentement le PDMS dégazé sur les cavités du moule et nivelez-le avec un bord plat.
   REMARQUE : Si des bulles sont présentes après avoir versé, dégazez le moule jusqu’à ce que les bulles soient éliminées.
6. Placez le moule sur une plaque chauffante et faites cuire le PDMS à 70 °C pendant 1 h, puis laissez refroidir le moule à température ambiante.
7. Retirez délicatement les modules d’écoulement des cavités du moule à l’aide d’une pince à épiler à bout plat.
8. Orientez le module d’écoulement avec les caractéristiques du microcanal vers le haut et positionnez les orifices d’entrée et de sortie du noyau à l’extrémité du canal à l’aide d’un poinçon de biopsie (voir le tableau des matériaux).

3. Fabrication de boîtiers acryliques inférieurs et supérieurs

REMARQUE : Le module central s’insère dans le boîtier inférieur. L’attraction entre les aimants intégrés dans les boîtiers comprime et scelle le module d’écoulement au module central (Figure 6).

1. Découper au laser une feuille d’acrylique de 2 mm en utilisant le dessin fourni dans le fichier de codage supplémentaire 5 pour créer le boîtier supérieur avec des trous pour l’insertion de l’aimant.
2. Fixez un film PSA de 130 μm sur une feuille acrylique de 3,5 mm.
3. Découper au laser la feuille acrylique selon le dessin donné dans le fichier de codage supplémentaire 6 pour créer le boîtier inférieur avec des trous pour l’insertion de l’aimant.
   REMARQUE : L’épaisseur du boîtier inférieur est un paramètre critique et doit correspondre à l’épaisseur totale du module central pour éviter les fuites pendant l’écoulement.
4. Retirez la couche protectrice PSA et fixez le boîtier inférieur à une lamelle en verre.
5. Enfoncez à la presse des aimants en néodyme nickelé de 4,75 mm (voir tableau des matériaux) dans les trous découpés au laser des boîtiers.
   REMARQUE : Assurez-vous que les aimants des boîtiers inférieur et supérieur sont placés avec une polarité opposée pour assurer l’attraction magnétique (Figure 6).

4. Fabrication du circuit d’écoulement

REMARQUE : Le circuit d’écoulement en boucle fermée contient deux flacons de prélèvement d’échantillons comme réservoirs (Figure 7). Le réservoir d’entrée est équipé d’un filtre au difluorure de polyvinylidène (PVDF) pour permettre au média cellulaire de s’équilibrer avec la concentration de CO₂ dans l’incubateur.

1. Utilisez un poinçon de biopsie de 1 mm pour créer deux trous dans le bouchon d’un flacon de prélèvement d’échantillon.
2. Utilisez des poinçons de biopsie pour créer deux trous (1 mm et 4 mm) dans le bouchon d’un flacon de prélèvement d’échantillon séparé et créez un trou de 1 mm dans la partie inférieure de ce flacon.
3. Insérez des pointes de distribution de 20 g dans chacun des trous de 1 mm et scellez-les avec de la colle chaude.
4. Placez un filtre PVDF de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) dans le trou de 4 mm et scellez-le avec de la colle chaude.
5. Découper au laser une feuille d’acrylique de 1,5 mm en utilisant le dessin fourni dans le fichier de codage supplémentaire 7 pour créer une étape de maintien de l’échantillon.
6. Positionnez les réservoirs sur la platine acrylique.
7. Connectez les pointes de distribution à l’aide de tubes à micro-flux (voir tableau des matériaux).
8. Reliez les tubes à l’entrée et à la sortie du module de débit à l’aide d’embouts de distribution de 21 G.
9. Utilisez une pompe péristaltique (voir le tableau des matériaux) pour la circulation du débit.
   REMARQUE : Des pompes à seringue ou pneumatiques peuvent également être utilisées pour introduire le débit si vous le souhaitez. Le débit doit être déterminé en fonction des besoins expérimentaux. Un tableau complet, dérivé d’un modèle COMSOL validé expérimentalement, est fourni dans le tableau supplémentaire 1 pour aider les utilisateurs à sélectionner le débit nécessaire pour obtenir la contrainte de cisaillement souhaitée au niveau de la monocouche^{de cellule 16}.

5. Ensemencement cellulaire

REMARQUE : Semblable aux inserts de membrane conventionnels, différents types de cellules peuvent être cultivés sur la nanomembrane. Un type de cellule secondaire peut également être co-cultivé de l’autre côté de la membrane dans le canal inférieur¹⁵.

1. Enduire la membrane de 5 μg/^cm2 de fibronectine (voir le tableau des matériaux) à température ambiante pendant 1 h pour améliorer la fixation des cellules.
   REMARQUE : Le type de cellule choisi peut influencer le revêtement et la densité cellulaire requis. La procédure décrite ici concerne les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC, voir Tableau des matériaux).
2. Aspirez la solution d’enrobage à l’aide d’une pipette P200 et placez un pochoir de motif dans le puits du module central.
3. Ajoutez des supports cellulaires au puits et au canal inférieur de l’appareil.
4. Semez des HUVEC à une densité de 40 000 cellules/^cm2 dans le puits.
   NOTE : Les HUVEC à cette densité forment généralement une monocouche confluente après 24 h d’incubation^16,19.
5. Placez l’appareil dans une boîte de Pétri. Ajouter un bouchon de tube conique de 15 mL avec de l’eau DI dans la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité locale.
6. Transférez la boîte de Pétri dans l’incubateur.
   REMARQUE : Les supports cellulaires dans le puits supérieur et le canal inférieur de l’appareil doivent être changés toutes les 24 heures. Pour changer le support dans le canal inférieur, injectez doucement un nouveau support dans l’un des ports pour déplacer l’ancien support de l’autre port.

6. Reconfiguration en mode microfluidique

1. Stérilisez le boîtier supérieur, le boîtier inférieur, le module de débit, les réservoirs, les tubes et les embouts de distribution en les plaçant dans une chambre de stérilisation UV pendant 30 minutes avant l’assemblage. Faire circuler de l’éthanol à 70% puis du PBS stérile dans le circuit d’écoulement.
2. Remplissez les réservoirs et les tubes avec un milieu de croissance des cellules endothéliales (voir le tableau des matériaux).
3. Placez le boîtier inférieur sur la platine d’échantillonnage. Insérez le module à noyau à puits ouvert dans le boîtier inférieur.
4. Aspirer le milieu cellulaire du puits du module. Placez le module d’écoulement dans le puits.
5. Placez le boîtier supérieur pour bien sceller le module de débit dans le module central. Connectez les pointes de distribution d’entrée et de sortie aux ports du module de débit.
6. Démarrez la pompe péristaltique pour introduire un écoulement de fluide dans le système.

7. Effectuer une analyse en aval sous forme de puits ouvert après l’introduction de l’écoulement

NOTE : Le temps de culture dépend ici des objectifs expérimentaux. Les utilisateurs peuvent effectuer des analyses en aval (par exemple, immunocytochimie, extraction d’ARN) dans des formats à puits ouvert ou microfluidiques selon leurs préférences. Par exemple, si un format à puits ouvert est préféré, le système doit être reconfiguré pour effectuer des analyses basées sur des protocoles standard ^16,19.

1. Arrêtez la pompe lorsque le temps souhaité pour l’exposition au flux de cisaillement est atteint. Retirez les embouts de distribution d’entrée et de sortie.
2. Retirez le boîtier supérieur. Retirez délicatement le module d’écoulement du puits à l’aide d’une pince à épiler.
3. Ajouter 100 μL de milieu cellulaire dans le puits. Effectuer les tests souhaités en fonction des protocoles standard.

Résultats

Le module central à puits ouvert est initialement positionné dans une cavité spécifique créée par un boîtier inférieur et une lamelle, comme illustré à la figure 6A. Ensuite, le module de flux, qui comprend un microcanal et des ports d’accès, est inséré dans le puits du module central. Le module d’écoulement est solidement scellé contre la couche de support en silicium de la membrane en raison de la force d’attraction magnétique entre les aimants intégrés dans les bo?...

Discussion

L’objectif de ce protocole est de développer une méthode pratique pour intégrer les capacités d’écoulement dans une plate-forme à puits ouvert dotée d’une nanomembrane ultrafine. Dans cette conception, une approche de verrouillage magnétique est utilisée, permettant de basculer entre les modes puits ouvert et fluidique pendant les expériences et combinant les avantages des deux approches. Contrairement aux plates-formes conventionnelles à liaison permanente, le verrouillage magnétique permet de démonte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA