静的バリア組織モデルを動的微生理学的システムに変換する

要約

このプロトコルは、オープンウェルフォーマットと流体フロー機能を統合する再構成可能なメンブレンベースの細胞培養プラットフォームについて説明しています。このプラットフォームは標準プロトコルと互換性があり、オープンウェル培養モードとマイクロ流体培養モード間の可逆的な移行を可能にし、工学とバイオサイエンスの両方のラボのニーズに対応します。

要約

マイクロ生理学的システムは、実験室でヒト組織の構造と機能を模倣するために使用される小型化された細胞培養プラットフォームです。しかし、これらのプラットフォームは、流体フロー機能がないにもかかわらず、オープンウェルのメンブレンベースのアプローチが組織バリアを模倣するためのゴールドスタンダードとして機能するバイオサイエンスラボでは広く採用されていません。この問題は、主に、既存の微生理学的システムと、オープンウェルシステム用に開発された標準的なプロトコルおよびツールとの非互換性に起因している可能性があります。

ここでは、オープンウェル構造、フローエンハンスメント機能、および従来のプロトコルとの互換性を備えた再構成可能なメンブレンベースのプラットフォームを作成するためのプロトコルを紹介します。このシステムは、オープンウェルモードとマイクロ流体モードの可逆的な切り替えを可能にする磁気アセンブリアプローチを利用しています。このアプローチにより、ユーザーは標準プロトコルを使用してオープンウェルフォーマットで実験を開始し、必要に応じてフロー機能を追加または削除できる柔軟性が得られます。このシステムの実用的使用法および標準技術との適合性を実証するために、内皮細胞単層をオープンウェルフォーマットで確立した。流体の流れを導入するようにシステムを再構成し、その後、免疫染色とRNA抽出を行うためにオープンウェルフォーマットに切り替えました。従来のオープンウェルプロトコルとの互換性と流量増強機能により、この再構成可能な設計は、工学とバイオサイエンスの両方の研究室で採用されることが期待されています。

概要

血管バリアは、血液区画を周囲の組織から分離する重要なインターフェースとして機能します。それらは、免疫細胞を引き付け、分子透過性を制御し、組織への病原体の侵入を防ぐことにより、恒常性を維持する上で重要な役割を果たします^1,2。in vitro培養モデルは、in vivo微小環境を模倣して開発されており、健康な状態と病気の状態の両方でバリア特性に影響を与える要因と条件の体系的な調査を可能にしています^3,4。

このような培養モデルに最も広く用いられているアプローチは、多孔質のトラックエッチングされた培養膜が培地で満たされた区画を分離する、トランズウェルのような「オープンウェル」構成⁵である(図1A)。このフォーマットでは、膜の両側に細胞を播種することができ、幅広い実験プロトコルが開発されています。しかし、これらのシステムは、バリアの成熟をサポートし、in vivoで見られる免疫細胞の循環を模倣するために不可欠な流体の流れを提供する能力に限界があります^5....

プロトコル

このデザインは、実験要件やエンド・ユーザーの好みに応じて、さまざまなモードで使用できます。各実験の前に、 図 2 に示す決定フローチャートを参照して、プロトコルに必要な手順とモジュールを決定してください。例えば、ユーザーが実験全体を通してオープンウェルフォーマットを維持し、トランズウェルタイプのシステムと直接比較しようとする場合、細胞播種にパターニングステンシルは必要ありません。コアモジュールは市販されており( 材料表を参照)、極薄ナノメンブレンは、実験のニーズに合わせて、空隙率と細孔径の異なる材料のライブラリから選択できます。

1. パターニングステンシルの作製

注:パターニングステンシルは、メンブレンチップの多孔質領域にのみ細胞を配置し、フローモジュールを追加した後に細胞が損傷を受ける可能性のある周囲のシリコン層に細胞が沈殿するのを防ぎます¹⁶ ( 図3を参照)。単分子膜の損傷は、バリアの完全性に悪影響を及ぼし、実験結果を損なう可能性があります。ステンシルは、損傷のリスクがないため、オープンで静的な培養では不要です。

1. Supplementary Co....

結果

オープンウェルコアモジュールは、図6Aに示すように、下部ハウジングとカバーガラスによって作成された特定のキャビティ内に最初に配置されます。続いて、マイクロチャネルとアクセスポートを含むフローモジュールがコアモジュールのウェルに挿入されます。フローモジュールは、図6Bに示すように、下部ハウジングと上部ハウジングに埋め.......

ディスカッション

このプロトコルの目的は、超薄膜ナノメンブレンを特徴とするオープンウェルプラットフォームにフロー機能を組み込むための実用的な方法を開発することです。この設計では、磁気ラッチング方式を採用しており、実験中にオープンウェルモードと流路モードを切り替えて、両方のアプローチの利点を組み合わせることができます。従来の恒久的に接着されたプラットフォームとは異なり?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes	Langer Instruments	WX10-14 & DG Series
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex	VWR	95039-090
1x PBS 7.4 pH	ThermoFisher Scientific	10010023
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP	Jensen Global	JG20-1.5X
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP	Jensen Global	JG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9726-ND
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)	DigiKey	3M9720-ND
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin	ThermoFisher Scientific	A12379
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444556
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g	VWR	AAJ64100-09
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K171	12" x 12" x 1/16"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8589K31	12" x 12" x 3/32"
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet	McMaster-Carr	8560K191	12" x 12" x 7.64"
Corning Fibronectin, Human, 1 mg	Corning	47743-728
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm	VWR	10118-677
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT	Ellsworth Adhesives	4019862
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fixture A1&A2	SiMPore Inc.	NA
Fixture B1&B2	SiMPore Inc.	NA
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	4374966
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	ThermoFisher Scientific	C0035C
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo Fisher Scientific	R37601
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)	K&J Magnetics	D31	3/16" dia. x 1/16" thick
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar	Fisher Scientific	aa47392-9M
Peristaltic Pump	Langer Instruments	BQ50-1J-A
Photoresist SU-8 developer solution	Fisher Scientific	NC9901158
PVDF syringe filters	PerkinElmer	2542913
Silicon wafer	University wafer,USA	1196
SU-8 3050	Fisher Scientific	NC0702369
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)	ThermoFisher Scientific	4331182
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile	VWR	100500-422
TRI-reagent	ThermoFisher Scientific	AM9738
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip	SiMPore Inc.	NPSN100-1L	The design is  compatible with all of SiMPore membranes
uSiM component 1	SiMPore Inc.	NA
uSiM component 2	SiMPore Inc.	NA