إرقاء الجرح البزلي وإعداد العينات لتحليل المجهر الإلكتروني واسع النطاق

Summary

يتم تقديم إجراء الجرح البزل لتشكيل الجلطة المرقئة هنا. الجلطات المشكلة كبيرة وقطرها مئات الميكرون. ومن ثم ، فإن طرق التصوير الحجمي مناسبة. نقترح الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال على نطاق واسع كنهج عالي الدقة متاح للكثيرين وتفصيل بروتوكول تحضيري.

Abstract

الإرقاء ، عملية التحكم الفسيولوجي الطبيعي لتلف الأوعية الدموية ، أمر أساسي لحياة الإنسان. نعاني جميعا من جروح طفيفة وجروح ثقب من وقت لآخر. في الإرقاء ، يؤدي تراكم الصفائح الدموية ذاتية الحد إلى تكوين جلطة منظم يأتي فيها توقف النزيف من تغطية الثقب من الخارج. يمكن أن يؤدي التوصيف التفصيلي لهذا الهيكل إلى التمييز بين الإرقاء والتخثر ، وهي حالة من التراكم المفرط للصفائح الدموية مما يؤدي إلى تخثر انسدادي. يتم تقديم نهج قائم على التصوير لهيكل الجلطة الجرحية الثقب هنا يعتمد على قدرة المجهر الإلكتروني الرقيق على تصور الجزء الداخلي من الجلطات المرقئة. الخطوة الأساسية في أي بروتوكول تجريبي قائم على التصوير هي إعداد العينة بشكل جيد. يوفر البروتوكول إجراءات مفصلة لإعداد الجروح الثقبية والجلطات الغنية بالصفائح الدموية في الفئران للفحص المجهري الإلكتروني اللاحق. يتم إعطاء إجراء مفصل للتثبيت في الموقع لجلطة الجرح المكونة ومعالجتها اللاحقة للتلوين والتضمين للفحص المجهري الإلكتروني. يتم تقديم المجهر الإلكتروني كتقنية تصوير نهائية نظرا لقدرته ، عند دمجه مع التقسيم المتسلسل ، على تصور تفاصيل الجلطة الداخلية بدقة عالية. كطريقة تصوير ، يعطي المجهر الإلكتروني أخذ عينات غير متحيزة ومخرجات تجريبية تمتد من نانومتر إلى ملليمترات في 2 أو 3 أبعاد. تم الاستشهاد ببرنامج المجهر الإلكتروني المجاني المناسب الذي سيدعم الفحص المجهري الإلكتروني واسع النطاق حيث يمكن مزج مئات الإطارات لإعطاء تصوير بمقياس نانومتر للمقاطع العرضية للجلطة الجرحية الثقب بالكامل. وبالتالي ، يمكن وضع أي منطقة فرعية من ملف الصورة بسهولة في سياق المقطع العرضي الكامل.

Introduction

يعد تكوين جلطة الجرح الثقب الذي يؤدي إلى توقف النزيف أحد أهم الأحداث في الحياة¹. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الضرورة ، فإن معرفة ما يحدث هيكليا أثناء تكوين الجلطة ، سواء كان ذلك في الوريد أو الشريان أو حدث تصلب الشرايين أو جلطة انسدادية ، كانت محدودة بالدقة وعمق التصوير. الفحص المجهري الضوئي التقليدي محدود في العمق عند مقارنته بخثرة الجرح المكتملة التكوين ، 200 إلى 300 ميكرومتر في Z¹ ، وفي مستوى الدقة عند مقارنتها بحجم عضيات الصفائح الدموية وتباعدها ، غالبا أقل من 30 نانومتر². يمكن أن ينتج عن الفحص المجهري الضوئي ثنائي الفوتون العمق المطلوب للتصوير ولكنه لا يحسن ال....

Protocol

تمت مراجعة التجارب والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة أركنساس للعلوم الطبية. هنا ، تم استخدام الفئران من الذكور والإناث C57BL / 6 من النوع البري من 8 إلى 12 أسبوعا. هذه الفئران هي شباب يعانون من تراكم قليل من الدهون. تنطبق نفس الإجراءات على طفرات الفئران لمختلف البروتينات المهمة للإرقاء ، مثل عامل فون ويلبراند أو البروتين السكري الصفائح الدموية السادس (GPVI) ^5،6. يتم عرض جميع المعدات والأدوات الجراحية والكواشف والمواد الأخرى المستخدمة في الشكل 1 ومدرجة في جدول المواد.

النتائج

التقدير الكمي لتأثيرات الدواء على وقت نزيف الجرح البزلي
توفر أوقات نزيف الجرح البزل نموذجا فسيولوجيا لخطر الدواء الذي يمكن إجراؤه بسهولة في الفئران. النتائج التي تأتي من تجربة الجرح البزل تنبؤية. هنا ، نعرض منحنى نزيف الجرعة والاستجابة dabigatran. يستخدم دابيغاتر.......

Discussion

نقدم إجراء مفصل للجرح البزل لإنتاج تجلط الدم في الأوردة الوداجية والشرايين الفخذية ، وتثبيت التروية في الموقع ، ومعالجة العينات للفحص المجهري الإلكتروني للنقل على نطاق واسع. الإجراءات العامة مفيدة لتوليد الجلطات المرقئة لتحليل البنية التحتية ومقارنة أوقات النزي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000