إرقاء الجرح البزلي وإعداد العينات لتحليل المجهر الإلكتروني واسع النطاق

Summary

يتم تقديم إجراء الجرح البزل لتشكيل الجلطة المرقئة هنا. الجلطات المشكلة كبيرة وقطرها مئات الميكرون. ومن ثم ، فإن طرق التصوير الحجمي مناسبة. نقترح الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال على نطاق واسع كنهج عالي الدقة متاح للكثيرين وتفصيل بروتوكول تحضيري.

Abstract

الإرقاء ، عملية التحكم الفسيولوجي الطبيعي لتلف الأوعية الدموية ، أمر أساسي لحياة الإنسان. نعاني جميعا من جروح طفيفة وجروح ثقب من وقت لآخر. في الإرقاء ، يؤدي تراكم الصفائح الدموية ذاتية الحد إلى تكوين جلطة منظم يأتي فيها توقف النزيف من تغطية الثقب من الخارج. يمكن أن يؤدي التوصيف التفصيلي لهذا الهيكل إلى التمييز بين الإرقاء والتخثر ، وهي حالة من التراكم المفرط للصفائح الدموية مما يؤدي إلى تخثر انسدادي. يتم تقديم نهج قائم على التصوير لهيكل الجلطة الجرحية الثقب هنا يعتمد على قدرة المجهر الإلكتروني الرقيق على تصور الجزء الداخلي من الجلطات المرقئة. الخطوة الأساسية في أي بروتوكول تجريبي قائم على التصوير هي إعداد العينة بشكل جيد. يوفر البروتوكول إجراءات مفصلة لإعداد الجروح الثقبية والجلطات الغنية بالصفائح الدموية في الفئران للفحص المجهري الإلكتروني اللاحق. يتم إعطاء إجراء مفصل للتثبيت في الموقع لجلطة الجرح المكونة ومعالجتها اللاحقة للتلوين والتضمين للفحص المجهري الإلكتروني. يتم تقديم المجهر الإلكتروني كتقنية تصوير نهائية نظرا لقدرته ، عند دمجه مع التقسيم المتسلسل ، على تصور تفاصيل الجلطة الداخلية بدقة عالية. كطريقة تصوير ، يعطي المجهر الإلكتروني أخذ عينات غير متحيزة ومخرجات تجريبية تمتد من نانومتر إلى ملليمترات في 2 أو 3 أبعاد. تم الاستشهاد ببرنامج المجهر الإلكتروني المجاني المناسب الذي سيدعم الفحص المجهري الإلكتروني واسع النطاق حيث يمكن مزج مئات الإطارات لإعطاء تصوير بمقياس نانومتر للمقاطع العرضية للجلطة الجرحية الثقب بالكامل. وبالتالي ، يمكن وضع أي منطقة فرعية من ملف الصورة بسهولة في سياق المقطع العرضي الكامل.

Introduction

يعد تكوين جلطة الجرح الثقب الذي يؤدي إلى توقف النزيف أحد أهم الأحداث في الحياة¹. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الضرورة ، فإن معرفة ما يحدث هيكليا أثناء تكوين الجلطة ، سواء كان ذلك في الوريد أو الشريان أو حدث تصلب الشرايين أو جلطة انسدادية ، كانت محدودة بالدقة وعمق التصوير. الفحص المجهري الضوئي التقليدي محدود في العمق عند مقارنته بخثرة الجرح المكتملة التكوين ، 200 إلى 300 ميكرومتر في Z¹ ، وفي مستوى الدقة عند مقارنتها بحجم عضيات الصفائح الدموية وتباعدها ، غالبا أقل من 30 نانومتر². يمكن أن ينتج عن الفحص المجهري الضوئي ثنائي الفوتون العمق المطلوب للتصوير ولكنه لا يحسن الدقة بشكل كبير. لا تزال أحدث التطورات في الفحص المجهري الضوئي ، على سبيل المثال ، تقنيات الدقة الفائقة ، محدودة الدقة ، من الناحية العملية ~ 20 نانومتر في XY وضعف ذلك في Z ، والعمق محدود ، ليس أكثر من المجهر الضوئي التقليدي. علاوة على ذلك ، يعتمد الفحص المجهري الضوئي فائق الدقة ، مثل الكثير من الفحص المجهري الضوئي البحثي ، على الفحص المجهري الفلوري ، وهي تقنية متحيزة بطبيعتها لمجموعة صغيرة من البروتينات المرشحة التي توجد لها أجسام مضادة جيدة أو تركيبات جيدة³. في الختام ، يمكن للفحص المجهري الإلكتروني الماسح التقليدي ، على الأكثر ، تصور سطح الجلطة الغنية بالصفائح الدموية.

للتغلب على هذه القيود التقنية لتوصيف بنية الجلطة ، كان لدينا ثلاثة أهداف. أولا ، ينتج بشكل متكرر جرحا محددا في وريد أو شريان الفأر يمكن بعد ذلك تثبيته بسهولة في الموقع عن طريق التثبيت الكيميائي. ثانيا ، قم بتطبيق إجراء تحضيري يؤكد على الحفاظ على الغشاء ، وهو هدف يتفق مع هدف تحديد موضع الصفائح الدموية الفردية داخل الجلطة المكونة. ثالثا ، استخدم تقنية تصور غير متحيزة يمكن ، في صورة واحدة ، تحجيمها بين مقياس نانومتر إلى مقياس قريب من المليمتر.

تم اختيار الفحص المجهري الإلكتروني واسع النطاق كتقنية تصور نهائية رئيسية لسبب واحد مهم: في التصوير بالمجهر الإلكتروني ، يرى المرء مجموعة واسعة من الميزات داخل الخلية التي تحدد عضياتها وميزاتها داخل العضيات. يمكن التعرف على الأشياء الصغيرة مثل الريبوسومات. يظهر هذا النطاق من الميزات لأن بقع المعادن الثقيلة الكثيفة الإلكترون واليورانيل والرصاص والأوزميوم ، والتي تستخدم في المجهر الإلكتروني لإنتاج تباين يرتبط بمجموعة واسعة من الجزيئات. في صورة المجهر الإلكتروني ، يرى المرء الكثير مما هو موجود ، بينما مع أساليب التألق المناعي وعلامات البروتين ، يرى المرء فقط ما يضيء. هذا يعني ، على سبيل المثال ، مواقع المستضد الموجودة في نوع بروتين فردي معين. في حالة الجزيء الموسوم ، غالبا ما يكون بروتينا ، فهو الموقع (المواقع) التي يوجد بها هذا البروتين. جميع الجزيئات الأخرى مظلمة وغير مضاءة. ومع ذلك ، هل هذا الاختيار من المجهر الإلكتروني عملي؟ يبلغ حجم جلطة الجرح البزل 300 × 500 ميكرومتر ، وبحجم بكسل 3 نانومتر ، أي صورة 100,000 × 167,000 بكسل. تحتوي كاميرا المجهر الإلكتروني عالية الجودة على 4000 × 4000 بكسل. هذا يعني أنه يجب خياطة / مزج ما يقرب من 1000 إطار لإعطاء صورة واحدة. هذا هو الاحتمال الذي كان موجودا في معظم المجاهر الإلكترونية المصنعة في السنوات ال 15 الماضية. مرحلة المجهر محوسبة ، ويمكن خياطة الصور مع جهاز كمبيوتر. وهذا هو الأساس المنطقي الذي أدى إلى خيارات تقوم عليها صياغة البروتوكول المقدم.

بشكل قاطع ، نقدم أدناه سلسلة من الخطوات التي تعطي جرحا قابلا للتكرار في الوريد أو الشريان للفئران والذي بعد ذلك ، باتباع خطوات التثبيت في الموقع وخطوات التضمين اللاحقة ، يمكن تصوره عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني للنقل على نطاق واسع على مقياس نانومتر وفي الصورة المخيطة التي يتم تصورها بمقياس قريب من مم ، مقياس الفعلي في الموقع جلطة ثابتة. قابلية التوسع من هذا النوع مطلوبة لفهم تكوين الجلطة كمشكلة في أمراض الدم / الصحة وكنظام بيولوجي تنموي تكون فيه الصفائح الدموية هي نوع الخلايا الرئيسي. تقدم هذه التطورات ميزة رئيسية للفحص المجهري الإلكتروني ، وهي أن المرء يرى ما هو موجود ، وليس فقط ما يضيء. للحصول على بروتوكول مفصل حول تحضير العينات للفحص المجهري الإلكتروني لمسح الوجه التسلسلي (SBF-SEM) ، يتم توجيه القارئ إلى مقال حديث بقلم Joshi et ^al.4.

Protocol

تمت مراجعة التجارب والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة أركنساس للعلوم الطبية. هنا ، تم استخدام الفئران من الذكور والإناث C57BL / 6 من النوع البري من 8 إلى 12 أسبوعا. هذه الفئران هي شباب يعانون من تراكم قليل من الدهون. تنطبق نفس الإجراءات على طفرات الفئران لمختلف البروتينات المهمة للإرقاء ، مثل عامل فون ويلبراند أو البروتين السكري الصفائح الدموية السادس (GPVI) ^5،6. يتم عرض جميع المعدات والأدوات الجراحية والكواشف والمواد الأخرى المستخدمة في الشكل 1 ومدرجة في جدول المواد.

1. جرح ثقب الشريان الفخذي / الوريد الوداجي^1،7

1. تخدير الفأر
   1. ضع الماوس في حجرة الحث وقم بتحويل مبخر الأيزوفلوران إلى إعداد معدل تدفق مرتفع (500 مل / دقيقة ، 3٪ إيزوفلوران). يتم اختيار الأيزوفلوران لأنه له تأثير ضئيل على قطر الأوعية الدموية.
      تنبيه: يمكن أن يسبب التعرض طويل الأمد للأيزوفلوران آثارا صحية ضارة. يمكن أن يؤدي استخدام مبخر منخفض التدفق وعبوات التقاط غاز التخدير والتهوية الجيدة للغرفة إلى تقليل التعرض بشكل كبير.
   2. عندما يظهر الماوس نائما، اضغط على أحد أصابع الماوس لمعرفة ما إذا كان الماوس يتفاعل أم لا. إذا كان الأمر كذلك ، فضع الماوس مرة أخرى في غرفة الحث لبضع دقائق ثم حاول اختبار القرص مرة أخرى. إذا لم يتفاعل الماوس ، ضعه في وضع ضعيف على لوحة التسخين (مغطاة مسبقا بورق الألمنيوم).
   3. اقلب المرذاذ إلى معدل تدفق منخفض (100 مل / دقيقة ، 1.75٪ إيزوفلوران). ضع أنف الفأر في مخروط الأنف. مد كل طرف وشريط لاصق لأسفل بقطع صغيرة من الشريط اللاصق.
   4. أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية على وحدة التحكم في درجة الحرارة. قم بلصق سلك مسبار درجة الحرارة لمنع سحب المسبار عن طريق الخطأ.
2. شق الفأر
   1. باستخدام المقص ، احلق رقبة الفأر وصدره (للوريد الوداجي) أو الساق اليمنى الداخلية (للشريان الفخذي). امسح قصاصات الفراء بقطعة كحول. إذا لزم الأمر ، انتقل إلى المنطقة مرة أخرى باستخدام المقص لإزالة أي فرو متبقي.
   2. امسح المنطقة مرة أخرى بقطعة كحول طازجة لإزالة جميع القصاصات. من المهم جدا أن تكون المنطقة نظيفة قدر الإمكان. تأكد من مستوى التخدير الجراحي عن طريق قرص إصبع القدم.
   3. باستخدام المقص والملقط غير الحاد ، ارفع الجلد واقطعه على الوريد الوداجي الأيمن. اقطع نافذة مستديرة في الجلد كبيرة بما يكفي لكشف الوريد الوداجي وبعض الأنسجة المحيطة.
3. تنظيف الوريد الوداجي (تنطبق نفس المبادئ على الشريان الفخذي)
   1. باستخدام تقنية التشريح الحاد ، ادفع برفق الغدد الدهنية والليمفاوية وكذلك الأنسجة الضامة.
      ملاحظة: يتم إجراء بعض التنظيف العام حول الوعاء في هذه الخطوة ؛ ومع ذلك ، سيتم إجراء تنظيف دقيق وشامل تحت المجهر بعد تثبيت الوريد الوداجي في بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة.
   2. املأ حقنة سعة 20 مل بمحلول ملحي عادي دافئ إلى 37 درجة مئوية. قم بتحميل المحقنة في مضخة التسريب بالحقنة. قم بتوصيل إبرة الفراشة 27G والأنابيب المرتبطة بها بالمحقنة.
   3. اضبط مضخة الحقنة على معدل تدفق يبلغ 0.5 مل / دقيقة. سيغسل التيار اللطيف من المحلول الملحي الدم من الوريد / الشريان المثقوب. ضع تيار المحلول الملحي على بعد بضعة مم على جانب موقع البزل ، وليس فوقه مباشرة.
4. ثقب الوريد الوداجي / الشريان الفخذي
   1. ابدأ المؤقت. احصل على إبرة تحت الجلد 30G (قطرها الاسمي 300 ميكرومتر) للوريد الوداجي وإبرة تحت الجلد 33G (قطر 200 ميكرومتر) للشريان الفخذي. لا يمنح استخدام إبرة أصغر سوى وقت نزيف أطول قليلا للحالة الشريانية ذات الضغط العالي.
   2. اقلب الشطبة متجها لأعلى. ضع الإبرة بزاوية 25 درجة فوق الوريد الوداجي / الشريان الفخذي. لاحظ الوقت.
   3. ثقب الوعاء بسرعة ، مع التأكد من ثقب الجزء العلوي من الوعاء فقط. احرص على عدم ثقب قاع الوعاء أيضا. لاحظ الوقت الذي يتوقف فيه النزيف تماما.
   4. انتظر القدر المناسب من الوقت للحصول على تكوين الجلطة (الشكل 2 أ) قبل البدء في تثبيت التروية (أي إما 1 أو 5 أو 10 أو 20 دقيقة للحصول على مراحل مختلفة من تطور الجلطة). القتل الرحيم للحيوان عن طريق القتل الرحيم أو اتباع الإرشادات المؤسسية المحلية للقتل الرحيم.
5. إجراء تثبيت نضح عبر القلب
   1. قم بإعداد المضخة التمعجية قبل بدء الجراحة. ضع أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل في رف أنبوب الاختبار. املأ أنبوبا واحدا بمحلول مثبت بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ محضر في محلول عازلة كاكوديلات الصوديوم (0.2 مولار من كاكوديلات الصوديوم ، 0.15 مولار كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4) لدراسات البزل الوداجي واملأ الأنبوب الآخر بمحلول عازلة كاكوديلات الصوديوم.
      ملاحظة: الشروط المفصلة هنا كافية لحالة الضغط المنخفض للوداجي ثم يتم تعديلها لحالة الضغط العالي للشريان. بالنسبة لدراسات نظام الضغط العالي مع الشرايين ، أي الشريان الفخذي ، يتم استكمال مثبت بارافورمالدهيد ب 0.1٪ جلوتارالديهايد ، ويتم الجمع بين تثبيت التنقيط الخارجي مع تثبيت التروية.
   2. ضع طرف امتصاص أنبوب المضخة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول العازلة. قم بتوصيل إبرة فراشة 27G مع الأنابيب المرتبطة بها بنهاية إخراج أنبوب المضخة وضع الإبرة في دورق نظيف.
   3. اضبط المضخة التمعجية على معدل تدفق 10 مل / دقيقة. قم بتشغيل مضخة التروية.
   4. عندما يبدأ محلول العازلة في التدفق من الإبرة إلى الدورق ، قم بإيقاف تشغيل المضخة. يتم الآن تحضير الأنبوب والإبرة للتروية عبر القلب.
   5. قم بتعريض تجويف الصدر عن طريق عمل قطع خط الوسط في الجلد من أعلى القص إلى بضعة ملليمترات بعد الجزء السفلي من القص باستخدام مقص تشريح وملقط حاد. قم بعمل شقوق عرضية على طول قاعدة القفص الصدري ، بدءا من خط الوسط وقطع من الإنسي إلى الجانبي على كل جانب.
   6. مباشرة قبل البدء في نضح القلب ، افتح القفص الصدري بسرعة وعكس كل جانب لكشف القلب.
   7. قم بتشغيل المضخة التمعجية. ضع طرف إبرة الفراشة 27G في قاعدة البطين الأيسر.
   8. أثناء إمساك الإبرة بإحكام في البطين الأيسر ، قم بقطع شق في الأذن اليمنى باستخدام مقص تشريح حاد للسماح بتدفق الدم والسائل النضحي. لاحظ الوقت على المؤقت.
   9. قم بتفريغ محلول عازل لمدة 3 دقائق لطرد الدم من الدورة الدموية. بينما لا تزال تمسك الإبرة بإحكام في البطين الأيسر ، قم بإيقاف تشغيل المضخة التمعجية وحرك طرف امتصاص أنبوب المضخة التمعجية إلى أنبوب 50 مل الذي يحتوي على محلول التثبيت.
   10. لاحظ الوقت على المؤقت. قم بتشغيل المضخة التمعجية مرة أخرى وقم بتسخينها بالمحلول المثبت لمدة 7 دقائق. قم بإيقاف تشغيل المضخة التمعجية.
   11. أخرج الإبرة من البطين الأيسر وضعها في دورق نفايات. ضع طرف امتصاص أنبوب المضخة في دورق من الماء المقطر.
   12. قم بتشغيل المضخة التمعجية واترك ما يقرب من 20 مل من الماء يتدفق عبر الأنبوب ويخرج إبرة 27G إلى دورق النفايات لتنظيف الأنبوب. تأكد من ترك كل الماء يخرج من الأنبوب والإبرة قبل إيقاف تشغيل المضخة.

2. جمع عينات للفحص المجهري الإلكتروني

1. بعد تثبيت التروية المكملة بمثبت خارجي أولي لمدة دقيقتين في حالة جروح ثقب الشريان الفخذي ، قم بتشريح جزء الوريد الوداجي / الشريان الفخذي الذي يحتوي على موقع البزل والجلطة بعناية (الشكل 2 أ). باستخدام مقص حاد ، قم بعمل قطع قطري عبر الطرف البعيد لجزء الوعاء وقم بعمل قطع مستقيم عبر الطرف القريب من جزء الوعاء.
   ملاحظة: يساعد إجراء جروح بهذه الطريقة على توجيه الوعاء الدموي لاحقا وتحديد اتجاه تدفق الدم في الوعاء الدموي.
2. اغمر جزء الوعاء في درجة حرارة الغرفة الطازجة ، 4٪ بارافورمالدهيد في محلول عازلة كاكوديلات الصوديوم (0.2 م كاكوديلات الصوديوم ، 0.15 م كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4) وضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
3. انقل الأنسجة الثابتة إلى 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، خذ طبق ثقافة مقاس 35 مم يحتوي على حصيرة سيليكون بسمك ~ 5 مم (محضرة مسبقا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). صب ما يكفي من محلول عازلة الكاكوديلات الصوديوم في الطبق لغمر جزء الوريد الثابت.
4. أثناء المشاهدة تحت المجهر الضوئي (~ تكبير 15x) ، انقل الأنسجة بعناية إلى طبق 35 مم يحتوي على محلول عازل وقم بتثبيت كل طرف من طرفي الوعاء على حصيرة السيليكون باستخدام دبابيس دقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ وملقط دقيق.
5. نظف الجزء من الوريد الوداجي / الشريان الفخذي بعناية باستخدام مقص دقيق وملقط دقيق جدا.
   1. للوريد الوداجي فقط: قم بإزالة أحد المسامير ، وباستخدام المقص الدقيق ، قم بقص جدار الوعاء الدموي المقابل لموقع البزل / الجلطة بالطول. افتح الوعاء برفق ، وباستخدام 4 إلى 5 دبابيس (كل منها مقطوع إلى نصفين باستخدام قواطع سلكية) ، قم بتثبيته على حصيرة السيليكون بحيث يكون الجانب داخل اللمعة متجها لأعلى.
6. قم بشفط المحلول العازل ، واستبدله بسرعة بمحلول بارافورمالدهيد 1٪ في محلول عازلة كاكوديلات الصوديوم وضع الغطاء على الطبق. لا تدع الأنسجة تجف في أي وقت. احتفظ دائما بغمورها في السوائل.
7. قم بتخزين الأنسجة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يحين وقت معالجتها للفحص المجهري الإلكتروني (الشكل 2 ب). معالجة بعض عينات الجرح من ثقب الوريد الوداجي / الشريان الفخذي للتصوير بواسطة SBF-SEM⁴ والبعض الآخر للتصوير بواسطة WA-TEM^8،9. يتم وصف خطوات WA-TEM بالتفصيل أدناه.
   تنبيه: قم بتنفيذ جميع الأعمال التي تنطوي على الفورمالديهايد وأكسيد البروبيلين و OsO₄ و 2،4،6-Tris(ثنائي ميثيل أمينوميثيل) الفينول (DMP-30) في غطاء دخان كيميائي. هذه مواد كيميائية خطرة. يمكن أن يسبب التعرض ل OsO₄ العمى والوفاة.
   ملاحظة: جميع أحجام الشطف والبقع لا تقل عن 2 أضعاف حجم العينة. يمكن استبدال المحلول الملحي المخزن بالفوسفات 1x (PBS) بمحلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M. أثناء إجراء التثبيت ، من المهم جدا عدم ترك العينات تجف أبدا ، لأن هذا سيؤثر بشكل كبير على البنية الفائقة. استخدم أنابيب البولي بروبلين.

3. تحضير عينة للفحص المجهري الإلكتروني للنقل على نطاق واسع (WA-TEM)

ملاحظة: تمثل هذه الخطوة نقطة قرار يلتزم عندها المحقق بالتحضير ل WA-TEM. لا يدعم هذا الإجراء التحضيري SBF-SEM. بالنسبة لحجم SBF-SEM EM ، يجب أن تتم جميع عمليات التلوين قبل التضمين في البلاستيك. يرجى الاطلاع^{على 4} للحصول على بروتوكول إعداد SBF-SEM.

1. اغسل عينة المناديل في طبق 35 مم 2x بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) أو PBS في درجة حرارة الغرفة (RT). احتفظ بالعينة مثبتة ، مما يسمح بتتبع اتجاه العينة من خلال هذه الخطوات التحضيرية.
2. قم بتثبيته مع 0.8 مل من 0.05٪ أخضر الملكيت / 2.5٪ جلوتارالديهايد / 0.1 م من الكاكوديلات الصوديوم (درجة الحموضة 6.7 - 7.0) لمدة 20 دقيقة على الثلج.
3. قم بإزالة المثبت وغسل العينة 4 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ب 0.1 م من الكاكوديلات الصوديوم. قم بإزالة 0.1 م من كاكوديلات الصوديوم.
4. Postfix مع 0.8 مل من 0.8٪ K₃Fe (CN) ₆ أو K₄Fe (CN) ₆ / 1.0٪ OsO₄ K₃Fe (CN) ₆ في 0.1 M cacodylate الصوديوم. ضع غطاءا فوق الطبق لإبعاد الضوء (OsO₄ حساس للضوء). وصمة عار لمدة 20 دقيقة إلى 1 ساعة في RT.
5. قم بإزالة OsO₄ واشطفه 4 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما بمحلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M. قم بإزالة عازلة كاكوديلات الصوديوم وصمة عار بحمض التانيك بنسبة 1٪ لمدة 20 دقيقة على الثلج.
6. قم بإزالة حمض التانيك واغسله لمدة 5 دقائق بمحلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 متر 1x و 2x لمدة 5 دقائق لكل منهما بالماء المقطر الجزيئي (DI).
7. بقعة مع 0.5٪ أسيتات اليورانيل (UA) لمدة 1 ساعة RT أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية في الظلام.
8. قم بإزالة أسيتات اليورانيل واشطفها 5 مرات لمدة 5 دقائق بالماء المقطر الجزيئي. قبل الغسيل الأخير وبينما لا تزال العينة مغمورة في ماء DI ، قم بقص حصيرة السيليكون حول العينة المثبتة بشفرة حلاقة. ارفع هذه القطعة الصغيرة من حصيرة السيليكون من اللوحة وضعها في أنبوب بولي بروبلين.
   ملاحظة: من المهم أن تظل العينة مثبتة على قطعة السيليكون أثناء وجودها في الأنبوب. يعد التحول إلى أنابيب البولي بروبلين في هذه الخطوة أمرا ضروريا لأن أكسيد البروبيلين المستخدم في الخطوات اللاحقة سيؤدي إلى تحلل البوليسترين في الألواح مقاس 35 مم.
9. بعد إزالة المخزن المؤقت الأخير ، اشطفه لفترة وجيزة 1x مع 25٪ من الإيثانول. تخلص من الإيثانول بنسبة 25٪ واحتضنه بنسبة 25٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق على الثلج.
10. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 25٪. اشطف لفترة وجيزة 1x مع 50٪ إيثانول. تخلص من الإيثانول بنسبة 50٪ واحتضنه بنسبة 50٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق على الثلج.
11. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 50٪ واشطفه لفترة وجيزة 1x مع 75٪ إيثانول. تخلص من الإيثانول بنسبة 75٪ واحتضنه مع 75٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق على الثلج.
12. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 75٪ واشطفها لفترة وجيزة 1x مع 95٪ من الإيثانول. تخلص من الإيثانول بنسبة 95٪ واحتضنه مع 95٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق على الثلج.
13. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 95٪ واغسله 3 مرات ، على الأقل 10 دقائق في كل مرة ، مع 100٪ إيثانول (200 برهان). قم بإزالة الإيثانول بنسبة 100٪ وأضف أكسيد البروبيلين (PO). اشطف 3 مرات لمدة 10 دقائق على الأقل لكل منهما باستخدام الفم.
14. تحضير مزيج الراتنج كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتسخين مكونات الراتنج عند 60 درجة مئوية لتسييل بالكامل. امزج جيدا 12.5 مل من Embed-218 و 7.5 مل من Araldite 502 و 27.5 مل من DDSA معا في أنبوب سعة 50 مل عند 60 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بهذا الخليط لمدة 6 أشهر عند 4 درجات مئوية. قم بتسخينه إلى 60 درجة مئوية قبل الاستخدام. اقتبس الكمية المطلوبة قبل الاستخدام.
15. قم بتضمين العينات كما هو موضح أدناه.
    1. ضع حصة من مزيج الراتنج في أنبوب وأضف 20 ميكرولتر / مل من منشط DMP-30. تخلط جيدا عن طريق الدوران عند 60 درجة مئوية ؛ يجب أن يغمق اللون.
    2. قم بتخفيف هذه الكمية من الراتنج المنشط بنسبة 50٪ في أمر الشري والسماح للراتنج والفوز بالاختلاط تماما.
    3. قم بإزالة آخر شطف PO من الأنبوب المحتوي على العينة واستبدله بخليط الراتنج / PO بنسبة 50٪ ، مع ملء الأنبوب بالكامل تقريبا. قم بتدوير العينة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
    4. في اليوم التالي ، امزج كمية جديدة من الراتنج (1 مل لكل عينة) مع 20 ميكرولتر / مل من DMP-30.
16. ضع العينة في طبق بولي بروبلين بحجم صغير من مزيج الراتنج / PO بنسبة 50٪ من أنبوب العينة تحت مجهر تشريح (~ تكبير 6x) وأخرج المسامير بعناية من الأنسجة. انقل الأنسجة فقط إلى طبق بولي بروبلين آخر يحتوي على كمية صغيرة من الراتنج بنسبة 100٪ باستخدام منشط DMP-30.
17. املأ قالب تضمين السيليكون بالراتنج بنسبة 100٪ باستخدام منشط DMP-30 وضع العينة بعناية في القالب. ضعي القالب في الفرن واخبزيه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. تظهر العينة المعدة في الشكل 2 ب.
18. إجراء التصوير المجهري الإلكتروني للنقل على نطاق واسع (WA-TEM) كما هو موضح في^10،11. انظر الشكل 3 للحصول على تصوير للعملية التي تنتقل من ثقب أولي إلى جلطة ثلاثية الأبعاد مدتها دقيقة واحدة. لم يتم تضمين تضمين بروتوكول مفصل للتصوير المجهري الإلكتروني WA-TEM المونتاج هنا وهو خارج نطاق البروتوكولات الحالية حول إعداد العينة.
    ملاحظة: WA-TEM هي قدرة لا تحظى بالتقدير الكافي لمعظم المجاهر الإلكترونية الحديثة ذات المرحلة المحوسبة. يتوفر برنامج Shareware الذي يدعم هذه الوظائف^10،11 من مجموعة الدكتور ديفيد ماسترنارد ، جامعة كولورادو ، بولدر (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ، http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

النتائج

التقدير الكمي لتأثيرات الدواء على وقت نزيف الجرح البزلي
توفر أوقات نزيف الجرح البزل نموذجا فسيولوجيا لخطر الدواء الذي يمكن إجراؤه بسهولة في الفئران. النتائج التي تأتي من تجربة الجرح البزل تنبؤية. هنا ، نعرض منحنى نزيف الجرعة والاستجابة dabigatran. يستخدم دابيغاتر...

Discussion

نقدم إجراء مفصل للجرح البزل لإنتاج تجلط الدم في الأوردة الوداجية والشرايين الفخذية ، وتثبيت التروية في الموقع ، ومعالجة العينات للفحص المجهري الإلكتروني للنقل على نطاق واسع. الإجراءات العامة مفيدة لتوليد الجلطات المرقئة لتحليل البنية التحتية ومقارنة أوقات النزي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000