Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

요약

지혈 혈전 형성을 위한 천자 상처 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 형성된 혈전은 크며 직경이 수백 미크론입니다. 따라서 볼륨 이미징 접근 방식이 적합합니다. 우리는 많은 사람들이 사용할 수 있는 고해상도 접근 방식으로 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 제안하고 분취 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

초록

혈관 손상의 정상적인 생리적 조절 과정인 지혈은 인간 생활의 기본입니다. 우리 모두는 때때로 경미한 상처와 찔린 상처를 겪습니다. 지혈에서 자기 제한 혈소판 응집은 외부에서 구멍을 막음으로써 출혈 중단이 발생하는 구조적 혈전의 형성으로 이어집니다. 이 구조의 상세한 특성화는 지혈과 혈전증을 구별할 수 있으며, 혈전증은 과도한 혈소판 응집으로 이어지는 폐색성 응고의 경우입니다. 천자 상처 혈전 구조에 대한 이미징 기반 접근 방식이 여기에 제시되어 있으며, 이는 지혈 혈전의 내부를 시각화하는 얇은 단면 전자 현미경의 기능을 활용합니다. 이미징 기반 실험 프로토콜에서 가장 기본적인 단계는 우수한 시료 전처리입니다. 이 프로토콜은 후속 전자 현미경 검사를 위해 마우스의 천자 상처 및 혈소판이 풍부한 혈전을 준비하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 성형 천자 상처 혈전의 현장 고정 및 전자 현미경을 위한 염색 및 매립을 위한 후속 처리에 대한 자세한 절차가 제공됩니다. 전자 현미경은 순차적 절편과 결합될 때 혈전 내부의 세부 사항을 고해상도로 시각화할 수 있는 능력 때문에 말단 이미징 기술로 제시됩니다. 이미징 방법으로서 전자 현미경은 편향되지 않은 샘플링과 2차원 또는 3차원에서 나노미터에서 밀리미터까지 확장되는 실험 결과를 제공합니다. 수백 개의 프레임을 혼합하여 전체 천공 상처 혈전 단면의 나노미터 단위 이미징을 제공할 수 있는 광역 전자 현미경을 지원하는 적절한 프리웨어 전자 현미경 소프트웨어가 인용됩니다. 따라서 이미지 파일의 모든 하위 영역을 전체 횡단면의 컨텍스트에 쉽게 배치할 수 있습니다.

서문

출혈 중단으로 이어지는 천자성 상처 혈전의 형성은 인생에서 가장 중요한 사건 중 하나입니다¹. 그러나 이러한 본질성에도 불구하고 정맥, 동맥, 죽상동맥경화성 사건 또는 폐색혈전 등 혈전 형성 중에 구조적으로 발생하는 것에 대한 지식은 해상도와 이미징 깊이에 의해 제한되어 왔습니다. 기존의 광학 현미경은 완전히 형성된 천공 상처 혈전과 비교할 때 깊이가 제한적이며, Z¹에서 200 - 300 μm이며, 혈소판 소기관의 크기 및 그 간격과 비교할 때 해상도 수준이 30 nm 미만인 경우가 많습니다². 이광자 광학 현미경은 필요한 이미징 깊이를 얻을 수 있지만 해상도를 크게 향상시키지는 않습니다. 예를 들어 초고해상도 기술과 같은 광학 현미경의 가장 최근 발전은 여전히 해상도가 제한되어 있으며, 실제로는 XY에서 ~20nm, Z에서 그 두 배이며 깊이가 제한되어 있어 기존 광학 현미경보다 크지 않습니다. 또한, 초고해상도 광학 현미경은 대부분의 연구용 광학 현미경과 마찬가지로 형광 현미경을 기반으로 하며, 형광 현미경 검사는 본질적으로 우수한 항체가 존재하거나 양호한 태그가 지정된 구조를 가진 작은 후보 단백질....

프로토콜

실험은 아칸소 대학교 의과대학(University of Arkansas for Medical Sciences)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토 및 승인했습니다. 여기서, 8 - 12주령의 야생형 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 이 쥐는 지방이 거의 축적되지 않은 젊은 성인입니다. 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 또는 혈소판 당단백질 VI(GPVI^)5,6와 같은 지혈에 중요한 다양한 단백질에 대한 마우스 돌연변이에도 동일한 절차를 적용할 수 있습니다. 사용된 모든 장비, 수술 기구, 시약 및 기타 재료는 그림 1과 같으며 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 경정맥/대퇴 동맥 천자 상처 ^1,7

1. 마우스의 마....

토론

경정맥 및 대퇴 동맥에서 지혈 혈전을 생성하기 위한 자세한 천자 상처 절차, 현장 관류 고정 및 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 위한 샘플 처리를 제시합니다. 전체 절차는 초구조 분석을 위한 지혈 혈전을 생성하고 실험용 마우스(예: 다양한 유형 및 용량의 약물로 치료된 마우스)에서 출혈 시간을 비교하는 데 유용합니다. 또한 대조군 야생형 마우스의 출혈 시?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000