穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備

要約

止血血栓形成のための穿刺創傷手順がここで紹介されています。形成された血栓は大きく、直径は数百ミクロンです。したがって、ボリュームイメージングアプローチが適切です。私たちは、多くの人が利用できる高解像度のアプローチとして、モンタージュされた広域透過型電子顕微鏡法を提案し、準備プロトコルを詳述します。

要約

止血は、血管の損傷を正常な生理学的に制御するプロセスであり、人間の生活の基本です。私たちは皆、時々小さな切り傷や刺し傷に苦しんでいます。止血では、自己制限的な血小板凝集により、構造的な血栓が形成され、外部から穴を塞ぐことで出血が止まります。この構造を詳細に特徴づけることで、止血と血栓症の区別が生まれる可能性があり、血小板が過剰に凝集して閉塞性凝固を引き起こすケースです。ここでは、止血栓の内部を視覚化する薄切片電子顕微鏡の能力を利用した、穿刺創血血血構造へのイメージングベースのアプローチを紹介します。イメージングベースの実験プロトコルの最も基本的なステップは、良好なサンプル調製です。このプロトコルは、その後の電子顕微鏡検査のためにマウスの穿刺創と多血小板血栓を準備するための詳細な手順を提供します。形成穿刺創血栓の in situ 固定と、その後の電子顕微鏡法のための染色および埋め込みのための処理について、詳細な手順が示されています。電子顕微鏡は、シーケンシャルセクショニングと組み合わせることで、血栓内部の詳細を高解像度で視覚化できるため、エンドイメージング技術として紹介されています。イメージング法として、電子顕微鏡は偏りのないサンプリングと、2次元または3次元でナノメートルからミリメートルにスケーリングする実験出力を提供します。穿刺創血栓断面全体のナノメートルスケールのイメージングを提供するために数百のフレームをブレンドできる広域電子顕微鏡をサポートする適切なフリーウェア電子顕微鏡ソフトウェアが引用されています。したがって、画像ファイルの任意のサブ領域を、完全な断面のコンテキストに簡単に配置できます。

概要

出血停止につながる穿刺創血栓の形成は^、人生で最も重要なイベントの1つです1。しかし、その本質にもかかわらず、血栓形成中に構造的に何が起こるかについての知識は、それが静脈、動脈、アテローム性動脈硬化症、または閉塞性血栓のいずれであっても、解像度とイメージングの深さによって制限されてきました。従来の光学顕微鏡は、^Z1で200〜300μmの完全に形成された穿刺創血栓と比較すると深さが限られており、血小板オルガネラのサイズとその間隔と比較すると分解能レベルは^30nm2未満であることが多いです。2光子光学顕微鏡は、必要な深度のイメージングを得ることができますが、解像度は大幅に向上しません。光学顕微鏡法の最新の進歩、例えば超解像技術は、実際にはXYで~20nm、Zで2倍と分解能に限界があり、深さも従来の光学顕微鏡と変わらない程度です。さらに、超解像光学顕微鏡は、多くの研究用光学顕微鏡と同様に、蛍光顕微鏡法に基づいており、この技術は、良好な抗体が存在するか、または良好なタグ付き構築物3の候補タンパク質の小さなセットに本質的に偏^{っています。}結論として、従来の走査型電子顕微鏡は、せいぜい形成中の多血小板血栓の表面を視覚化することができます。

プロトコル

実験は、アーカンソー医科学大学の動物管理・使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されました。ここでは、8〜12週齢の野生型オスとメスのC57BL/6マウスを使用しました。これらのマウスは、脂肪の蓄積がほとんどない若年成人です。同じ手順が、フォン・ヴィレブランド因子や血小板糖タンパク質VI(GPVI^)5,6など、止血に重要なさまざまなタンパク質のマウス変異体にも適用できます。使用されるすべての機器、手術器具、試薬、およびその他の材料は、図1に示され、材料表に記載されています。

1. 頸静脈・大腿動脈穿刺創 ^1,7

1. マウスの麻酔
   1. マウスを誘導チャンバーに置き、イソフルラン気化器を高流量設定(500 mL/分、3%イソフルラン)に回します。イソフルランが選択されるのは、血管の直径にほとんど影響を与えないためです。
      注意:イソフルランに長期間さらされると、健康に悪影響を与える可能....

ディスカッション

頸静脈および大腿動脈で止血血栓を産生するための詳細な穿刺創傷手順、それらの in situ 灌流固定、およびモンタージュされた広域透過型電子顕微鏡法のサンプル処理について紹介します。全体的な手順は、超微細構造分析のための止血血栓の生成や、実験マウス、たとえば、異なる種類と投与量の医薬品で治療されたマウスの出血時間の比較に役立ちます。.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000