Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

Riepilogo

Qui viene presentata una procedura di puntura per la formazione di trombi emostatici. I trombi formati sono grandi e hanno un diametro di centinaia di micron. Pertanto, gli approcci di imaging volumetrico sono appropriati. Suggeriamo la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata come approccio ad alta risoluzione disponibile per molti e dettagliamo un protocollo preparativo.

Abstract

L'emostasi, il processo di normale controllo fisiologico del danno vascolare, è fondamentale per la vita umana. Tutti noi subiamo piccoli tagli e ferite da puntura di tanto in tanto. Nell'emostasi, l'aggregazione piastrinica autolimitante porta alla formazione di un trombo strutturato in cui la cessazione del sanguinamento deriva dalla tappatura del foro dall'esterno. La caratterizzazione dettagliata di questa struttura potrebbe portare a distinzioni tra emostasi e trombosi, un caso di eccessiva aggregazione piastrinica che porta alla coagulazione occlusiva. Qui viene presentato un approccio basato sull'imaging alla struttura del trombo della ferita da puntura che si basa sulla capacità della microscopia elettronica a sezione sottile di visualizzare l'interno dei trombi emostatici. Il passaggio più fondamentale in qualsiasi protocollo sperimentale basato sull'imaging è una buona preparazione del campione. Il protocollo fornisce procedure dettagliate per la preparazione di ferite da puntura e trombi ricchi di piastrine nei topi per la successiva microscopia elettronica. Viene fornita una procedura dettagliata per la fissazione in situ del trombo della ferita da puntura in formazione e la sua successiva elaborazione per la colorazione e l'inclusione per la microscopia elettronica. La microscopia elettronica è presentata come la tecnica di imaging finale a causa della sua capacità, se combinata con il sezionamento sequenziale, di visualizzare i dettagli dell'interno del trombo ad alta risoluzione. Come metodo di imaging, la microscopia elettronica fornisce un campionamento imparziale e un output sperimentale che scala da nanometri a millimetri in 2 o 3 dimensioni. Viene citato un software di microscopia elettronica freeware appropriato che supporterà la microscopia elettronica ad ampia area in cui centinaia di fotogrammi possono essere miscelati per fornire immagini su scala nanometrica di intere sezioni trasversali di trombi di ferite da puntura. Pertanto, qualsiasi sottoregione del file immagine può essere facilmente inserita nel contesto dell'intera sezione trasversale.

Introduzione

La formazione di un trombo da puntura che porta alla cessazione dell'emorragia è uno degli eventi più essenziali nella vita¹. Eppure, nonostante questa essenzialità, la conoscenza di ciò che accade strutturalmente durante la formazione di trombi, che si tratti di una vena, di un'arteria, di un evento aterosclerotico o di un coagulo occlusivo, è stata limitata dalla risoluzione e dalla profondità dell'imaging. La microscopia ottica convenzionale è limitata in profondità rispetto a un trombo di una ferita da puntura completamente formato, da 200 a 300 μm in Z¹, e in livello di risoluzione ....

Protocollo

Gli esperimenti sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Arkansas per le scienze mediche. Qui sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 8 e 12 settimane. Questi topi sono giovani adulti con scarso accumulo di grasso. Le stesse procedure sono applicabili ai mutanti dei topi per varie proteine importanti per l'emostasi, come il fattore di von Willebrand o la glicoproteina piastrinica VI (GPVI)^5,6. Tutte le attrezzature, gli strumenti chirurgici, i reagenti e gli altri materiali ut....

Discussione

Presentiamo una procedura dettagliata per la produzione di trombi emostatici nelle vene giugulari e nelle arterie femorali, la loro fissazione di perfusione in situ e l'elaborazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata. Le procedure complessive sono utili per generare trombi emostatici per l'analisi ultrastrutturale e per confrontare i tempi di sanguinamento in topi sperimentali, ad esempio topi trattati con diversi tipi e dosaggi di f.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000