Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

Riepilogo

Qui viene presentata una procedura di puntura per la formazione di trombi emostatici. I trombi formati sono grandi e hanno un diametro di centinaia di micron. Pertanto, gli approcci di imaging volumetrico sono appropriati. Suggeriamo la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata come approccio ad alta risoluzione disponibile per molti e dettagliamo un protocollo preparativo.

Abstract

L'emostasi, il processo di normale controllo fisiologico del danno vascolare, è fondamentale per la vita umana. Tutti noi subiamo piccoli tagli e ferite da puntura di tanto in tanto. Nell'emostasi, l'aggregazione piastrinica autolimitante porta alla formazione di un trombo strutturato in cui la cessazione del sanguinamento deriva dalla tappatura del foro dall'esterno. La caratterizzazione dettagliata di questa struttura potrebbe portare a distinzioni tra emostasi e trombosi, un caso di eccessiva aggregazione piastrinica che porta alla coagulazione occlusiva. Qui viene presentato un approccio basato sull'imaging alla struttura del trombo della ferita da puntura che si basa sulla capacità della microscopia elettronica a sezione sottile di visualizzare l'interno dei trombi emostatici. Il passaggio più fondamentale in qualsiasi protocollo sperimentale basato sull'imaging è una buona preparazione del campione. Il protocollo fornisce procedure dettagliate per la preparazione di ferite da puntura e trombi ricchi di piastrine nei topi per la successiva microscopia elettronica. Viene fornita una procedura dettagliata per la fissazione in situ del trombo della ferita da puntura in formazione e la sua successiva elaborazione per la colorazione e l'inclusione per la microscopia elettronica. La microscopia elettronica è presentata come la tecnica di imaging finale a causa della sua capacità, se combinata con il sezionamento sequenziale, di visualizzare i dettagli dell'interno del trombo ad alta risoluzione. Come metodo di imaging, la microscopia elettronica fornisce un campionamento imparziale e un output sperimentale che scala da nanometri a millimetri in 2 o 3 dimensioni. Viene citato un software di microscopia elettronica freeware appropriato che supporterà la microscopia elettronica ad ampia area in cui centinaia di fotogrammi possono essere miscelati per fornire immagini su scala nanometrica di intere sezioni trasversali di trombi di ferite da puntura. Pertanto, qualsiasi sottoregione del file immagine può essere facilmente inserita nel contesto dell'intera sezione trasversale.

Introduzione

La formazione di un trombo da puntura che porta alla cessazione dell'emorragia è uno degli eventi più essenziali nella vita¹. Eppure, nonostante questa essenzialità, la conoscenza di ciò che accade strutturalmente durante la formazione di trombi, che si tratti di una vena, di un'arteria, di un evento aterosclerotico o di un coagulo occlusivo, è stata limitata dalla risoluzione e dalla profondità dell'imaging. La microscopia ottica convenzionale è limitata in profondità rispetto a un trombo di una ferita da puntura completamente formato, da 200 a 300 μm in Z¹, e in livello di risoluzione rispetto alle dimensioni degli organelli piastrinici e alla loro spaziatura, spesso inferiore a 30 nm². La microscopia ottica a due fotoni può fornire la profondità di imaging necessaria, ma non migliora significativamente la risoluzione. I più recenti progressi nella microscopia ottica, ad esempio le tecniche di super-risoluzione, sono ancora limitati alla risoluzione, in pratica ~20 nm in XY e il doppio in Z, e alla profondità limitata, non più della microscopia ottica convenzionale. Inoltre, la microscopia ottica a super-risoluzione, come gran parte della microscopia ottica di ricerca, si basa sulla microscopia a fluorescenza, una tecnica che è intrinsecamente orientata verso un piccolo insieme di proteine candidate per le quali esistono buoni anticorpi o buoni costrutti marcati³. In conclusione, la microscopia elettronica a scansione convenzionale può, al massimo, visualizzare la superficie del trombo ricco di piastrine in formazione.

Per superare questi limiti tecnici alla caratterizzazione della struttura del trombo, avevamo tre obiettivi. In primo luogo, produrre in modo riproducibile una ferita da puntura definita in una vena o arteria di topo che potrebbe quindi essere prontamente stabilizzata in situ mediante fissazione chimica. In secondo luogo, applicare una procedura preparativa che enfatizzi la conservazione della membrana, un obiettivo coerente con l'obiettivo di definire la posizione delle singole piastrine all'interno del trombo in formazione. In terzo luogo, utilizzare una tecnica di visualizzazione imparziale che, in una singola immagine, potrebbe essere scalata da nanometri a quasi millimetri.

La microscopia elettronica montata su larga area è stata scelta come principale tecnica di visualizzazione finale per un unico importante motivo: nell'imaging al microscopio elettronico, si vede una vasta gamma di caratteristiche all'interno di una cellula che delinea i suoi organelli e le caratteristiche all'interno degli organelli. Piccoli oggetti come i ribosomi possono essere riconosciuti. Questa gamma di caratteristiche è dovuta al fatto che i coloranti di metalli pesanti densi di elettroni, uranile, piombo e osmio, che vengono utilizzati per la microscopia elettronica per produrre contrasto, si legano a un'ampia gamma di molecole. In un'immagine al microscopio elettronico, si vede molto di ciò che c'è, mentre con gli approcci di immunofluorescenza e marcatura delle proteine, si vede solo ciò che si illumina. Ciò significa, ad esempio, i siti antigenici presenti su una data singola specie proteica. Nel caso di una molecola marcata, spesso una proteina, è il sito o i siti in cui si trova quella proteina. Tutte le altre molecole sono scure e non illuminate. Tuttavia, questa scelta della microscopia elettronica è pratica? Un trombo da puntura ha una dimensione di 300 x 500 μm e, con una dimensione dei pixel di 3 nm, si tratta di un'immagine di 100.000 x 167.000 pixel. Una fotocamera per microscopio elettronico di alta qualità ha 4000 x 4000 pixel. Ciò significa che circa 1000 fotogrammi devono essere uniti/fusi per dare un'unica immagine. Questa è una possibilità che è stata presente nella maggior parte dei microscopi elettronici prodotti negli ultimi 15 anni. Il tavolino del microscopio è computerizzato e le immagini possono essere unite insieme con un computer. Questa è la logica che ha portato alle scelte alla base della formulazione del protocollo presentato.

In conclusione, presentiamo di seguito una serie di passaggi che forniscono una ferita riproducibile nella vena o nell'arteria dei topi che poi, seguendo le fasi di fissazione in situ e le successive fasi di inclusione, possono essere visualizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata su scala nm e nell'immagine cucita visualizzata su scala vicina ai mm, la scala dell'effettiva trombo fisso. Una scalabilità di questo tipo è necessaria per comprendere la formazione di trombi sia come un problema in ematologia/salute che come un sistema di biologia dello sviluppo in cui le piastrine sono il principale tipo di cellula. Questi progressi offrono una delle principali virtù della microscopia elettronica, vale a dire che si vede ciò che c'è, non solo ciò che si illumina. Per un protocollo dettagliato sulla preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM), il lettore è indirizzato a un recente articolo di Joshi et ^al.4.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Arkansas per le scienze mediche. Qui sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 8 e 12 settimane. Questi topi sono giovani adulti con scarso accumulo di grasso. Le stesse procedure sono applicabili ai mutanti dei topi per varie proteine importanti per l'emostasi, come il fattore di von Willebrand o la glicoproteina piastrinica VI (GPVI)^5,6. Tutte le attrezzature, gli strumenti chirurgici, i reagenti e gli altri materiali utilizzati sono mostrati nella Figura 1 ed elencati nella Tabella dei materiali.

1. Ferita da puntura della vena giugulare/arteria femorale ^1,7

1. Anestetizzazione del topo
   1. Posiziona il mouse nella camera di induzione e accendi il vaporizzatore di isoflurano su un'impostazione di portata elevata (500 ml/min, 3% di isoflurano). L'isoflurano viene scelto perché ha scarso effetto sul diametro dei vasi sanguigni.
      ATTENZIONE: L'esposizione a lungo termine all'isoflurano può causare effetti negativi sulla salute. L'uso di un vaporizzatore a basso flusso, di bombolette per la cattura dei gas per anestesia e di una buona ventilazione della stanza possono ridurre notevolmente l'esposizione.
   2. Quando il mouse sembra addormentato, pizzica una delle dita dei piedi del mouse per vedere se il mouse reagisce. In tal caso, riposizionare il mouse nella camera di induzione per alcuni minuti e poi riprovare il test di pizzicamento. Se il mouse non reagisce, posizionarlo in posizione supina sulla piastra riscaldante (precedentemente coperta con un foglio di alluminio).
   3. Abbassa il vaporizzatore a una portata bassa (100 ml/min, 1,75% di isoflurano). Posiziona il naso del mouse nell'ono del naso. Estendi ogni arto e fissa con del nastro adesivo dei piccoli pezzi.
   4. Inserire la sonda di temperatura rettale e impostare la temperatura a 37 °C sul termoregolatore. Fissare con nastro adesivo il cavo della sonda di temperatura per evitare che la sonda venga estratta accidentalmente.
2. Incisione del topo
   1. Usando il tagliaunghie, radere il collo e il torace del topo (per la vena giugulare) o l'interno della gamba destra (per l'arteria femorale). Pulisci i ritagli di pelo con un tampone imbevuto di alcol. Se necessario, ripassare l'area con le tosatrici per rimuovere il pelo rimasto.
   2. Pulisci nuovamente l'area con un tampone imbevuto di alcol fresco per eliminare tutti i ritagli. È molto importante che l'area sia il più pulita possibile. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia tramite un pizzico di punta.
   3. Usando le forbici e una pinza smussata, sollevare e tagliare la pelle sopra la vena giugulare destra. Taglia una finestra rotonda nella pelle abbastanza grande da esporre la vena giugulare e parte del tessuto circostante.
3. Pulizia della vena giugulare (gli stessi principi si applicano all'arteria femorale)
   1. Utilizzando la tecnica della dissezione smussata, spingere delicatamente da parte i linfonodi adiposi e il tessuto connettivo.
      NOTA: In questa fase viene eseguita una pulizia generale intorno al recipiente; Tuttavia, un'attenta e accurata pulizia avverrà al microscopio dopo che la vena giugulare è stata fissata in paraformaldeide per 24 ore.
   2. Riempire una siringa da 20 ml con soluzione fisiologica riscaldata a 37 °C. Caricare la siringa nella pompa di infusione della siringa. Collegare l'ago a farfalla da 27 G e il tubo associato alla siringa.
   3. Impostare la pompa a siringa su una portata di 0,5 ml/min. Il delicato flusso di soluzione salina laverà via il sangue dalla vena/arteria perforata. Posizionare il getto di soluzione salina a pochi mm dal lato del sito di puntura, non direttamente sopra di esso.
4. Perforazione della vena giugulare/arteria femorale
   1. Avvia il timer. Procurarsi un ago ipodermico da 30 G (diametro nominale 300 μm) per la vena giugulare e un ago ipodermico da 33 G (diametro 200 μm) per l'arteria femorale. L'uso di un ago più piccolo offre solo un tempo di sanguinamento leggermente più lungo per la situazione arteriosa ad alta pressione.
   2. Girare lo smusso rivolto verso l'alto. Posizionare l'ago con un angolo di 25° sopra la vena giugulare/arteria femorale. Prendi nota dell'ora.
   3. Forare rapidamente il recipiente, assicurandosi di perforare solo la parte superiore del recipiente. Fare attenzione a non forare anche il fondo del recipiente. Notare il momento in cui l'emorragia si ferma completamente.
   4. Attendere il tempo appropriato per ottenere la formazione di trombi (Figura 2A) prima di iniziare la fissazione della perfusione (cioè 1, 5, 10 o 20 minuti per ottenere diversi stadi di sviluppo del trombo). Sopprimere l'animale mediante dissanguamento o seguire le linee guida istituzionali locali per l'eutanasia.
5. Esecuzione della fissazione transcardica della perfusione
   1. Impostare la pompa peristaltica prima dell'inizio dell'intervento. Posizionare due provette coniche da 50 mL in un rack per provette. Riempire una provetta con una soluzione fissativa di paraformaldeide al 4% preparata in soluzione tampone di cacodilato di sodio (cacodilato di sodio 0,2 M, cloruro di sodio 0,15 M a pH 7,4) per studi di puntura giugulare e riempire l'altra provetta con una soluzione tampone di cacodilato di sodio.
      NOTA: Le condizioni qui descritte sono sufficienti per il caso di bassa pressione della giugulare e vengono quindi modificate per il caso di pressione più elevata di un'arteria. Per gli studi sui sistemi ad alta pressione con le arterie, cioè l'arteria femorale, il fissativo paraformaldeide è integrato con glutaraldeide allo 0,1% e la fissazione a goccia esterna è combinata con la fissazione per perfusione.
   2. Posizionare l'estremità di aspirazione del tubo della pompa nel tubo contenente la soluzione tampone. Collegare un ago a farfalla da 27 G con il tubo associato all'estremità di uscita del tubo della pompa e posizionare l'ago in un becher pulito.
   3. Impostare la pompa peristaltica su una portata di 10 mL/min. Accendere la pompa di perfusione.
   4. Quando la soluzione tampone inizia a fluire dall'ago nel becher, spegnere la pompa. Il tubo e l'ago sono ora pronti per la perfusione transcardica.
   5. Esporre la cavità toracica praticando un taglio sulla linea mediana della pelle dalla parte superiore dello sterno fino a pochi millimetri oltre la parte inferiore dello sterno utilizzando forbici da dissezione e pinze smussate. Praticare incisioni trasversali lungo la base della gabbia toracica, partendo dalla linea mediana e tagliando da mediale a laterale su ciascun lato.
   6. Immediatamente prima di iniziare la perfusione transcardiaca, aprire rapidamente la gabbia toracica e riflettere ogni lato per esporre il cuore.
   7. Accendere la pompa peristaltica. Posiziona la punta dell'ago a farfalla 27G alla base del ventricolo sinistro.
   8. Tenendo saldamente l'ago nel ventricolo sinistro, tagliare una fessura nel padiglione auricolare destro usando forbici da dissezione affilate per consentire al sangue e al liquido di perfusione di defluire. Annotare l'ora sul timer.
   9. Perfondere con una soluzione tampone per 3 minuti per espellere il sangue dal sistema circolatorio. Tenendo ancora fermo l'ago nel ventricolo sinistro, spegnere la pompa peristaltica e spostare l'estremità di aspirazione del tubo della pompa peristaltica sul tubo da 50 ml contenente la soluzione fissativa.
   10. Annotare l'ora sul timer. Riaccendere la pompa peristaltica e perfondere con la soluzione fissativa per 7 minuti. Spegnere la pompa peristaltica.
   11. Estrarre l'ago dal ventricolo sinistro e metterlo in un becher di scarto. Posizionare l'estremità di aspirazione del tubo della pompa in un becher di acqua distillata.
   12. Accendere la pompa peristaltica e far fluire circa 20 ml di acqua attraverso il tubo e far uscire l'ago da 27G nel becher di scarico per pulire il tubo. Assicurarsi di far uscire tutta l'acqua dal tubo e dall'ago prima di spegnere la pompa.

2. Raccolta di campioni per microscopia elettronica

1. Dopo la fissazione per perfusione integrata con un fissativo esterno iniziale di 2 minuti nel caso di ferite da puntura dell'arteria femorale, sezionare attentamente la porzione della vena giugulare/arteria femorale contenente il sito di puntura e il trombo (Figura 2A). Con le forbici affilate, eseguire un taglio diagonale attraverso l'estremità distale del segmento del vaso e praticare un taglio dritto attraverso l'estremità prossimale del segmento del vaso.
   NOTA: Eseguire tagli in questo modo aiuta a orientare il vaso in un secondo momento e a identificare la direzione del flusso sanguigno nel vaso.
2. Immergere il segmento del vaso in paraformaldeide fresca al 4% a temperatura ambiente in una soluzione tampone di cacodilato di sodio (cacodilato di sodio 0,2 M, cloruro di sodio 0,15 M a pH 7,4) e porre a temperatura ambiente per 1 ora.
3. Trasferire il tessuto fissato a 4 °C per 24 ore. Il giorno successivo, prendi una piastra di coltura da 35 mm contenente un tappetino in silicone spesso ~5 mm (preparato in anticipo secondo le istruzioni del produttore). Versare una quantità sufficiente di soluzione tampone di cacodilato di sodio nel piatto per immergere il segmento della vena fissa.
4. Durante l'osservazione al microscopio ottico (ingrandimento ~15x), trasferire con cura il tessuto nel piatto da 35 mm contenente la soluzione tampone e fissare ciascuna estremità del recipiente al tappetino in silicone utilizzando perni per minuzie in acciaio inossidabile e pinze sottili.
5. Pulire accuratamente la vena giugulare/segmento dell'arteria femorale utilizzando un paio di micro forbici e una pinza molto sottile.
   1. Solo per la vena giugulare: rimuovere uno dei perni e, utilizzando le micro forbici, tagliare longitudinalmente la parete del vaso opposta al sito della puntura/trombo. Aprire delicatamente il recipiente e, utilizzando 4-5 spilli (ciascuno tagliato a metà con tronchesi), fissarlo al tappetino in silicone con il lato intraluminale rivolto verso l'alto.
6. Aspirare la soluzione tampone, sostituirla rapidamente con una soluzione di paraformaldeide all'1% in soluzione tampone di cacodilato di sodio e posizionare il coperchio sul piatto. Non lasciare che il fazzoletto si asciughi in nessun momento. Tienilo sempre immerso nel liquido.
7. Conservare il tessuto a 4 °C fino al momento di lavorarlo per la microscopia elettronica (Figura 2B). Processare alcuni campioni di ferita da puntura della vena giugulare/arteria femorale per l'imaging mediante SBF-SEM⁴ e altri per l'imaging mediante WA-TEM ^8,9. I passaggi WA-TEM sono descritti in dettaglio di seguito.
   ATTENZIONE: Eseguire tutti i lavori che coinvolgono formaldeide, ossido di propilene, OsO₄ e 2,4,6-Tris(dimetilamminometil)fenolo (DMP-30) in una cappa chimica. Si tratta di sostanze chimiche pericolose. L'esposizione a OsO₄ può causare cecità e morte.
   NOTA: Tutti i volumi di risciacquo e colorazione sono almeno 2 volte il volume del campione. La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x può essere sostituita dal tampone cacodilato di sodio 0,1 M. Durante la procedura di fissaggio, è molto importante non lasciare mai che i campioni si secchino, poiché ciò influenzerebbe in modo significativo l'ultrastruttura. Utilizzare tubi in polipropilene.

3. Preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione ad ampio raggio (WA-TEM)

NOTA: Questa fase rappresenta un punto decisionale in cui lo sperimentatore si impegna a prepararsi per il WA-TEM. Questa procedura preparativa non supporta SBF-SEM. Per SBF-SEM volume EM, tutte le colorazioni devono essere eseguite prima dell'inclusione nella plastica. Si prega di consultare^{il punto 4} per un protocollo di preparazione SBF-SEM.

1. Lavare il campione di tessuto nella piastra da 35 mm 2 volte con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) o PBS a temperatura ambiente (RT). Mantenere il campione bloccato, in modo da poter tracciare l'orientamento del campione attraverso queste fasi preparatorie.
2. Fissare con 0,8 mL di verde malachite 0,05% / 2,5% glutaraldeide / 0,1 M di cacodilato di sodio (pH 6,7 - 7,0) per 20 minuti su ghiaccio.
3. Rimuovere il fissativo e lavare il campione 4 volte per 5 minuti ciascuno con cacodilato di sodio 0,1 M. Rimuovere il cacodilato di sodio 0,1 M.
4. Postfix con 0,8 mL di K₃Fe(CN)₆ allo 0,8% o K₄Fe(CN)₆ / 1,0% OsO₄ K₃Fe(CN)₆ in cacodilato di sodio 0,1 M. Metti un coperchio sul piatto per tenere fuori la luce (OsO₄ è sensibile alla luce). Macchiare per 20 minuti a 1 ora a RT.
5. Rimuovere l'OsO₄ e risciacquare 4 volte per 5 minuti ciascuno con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M. Rimuovere il tampone di cacodilato di sodio e colorare con acido tannico all'1% per 20 minuti con ghiaccio.
6. Rimuovere l'acido tannico e lavare per 5 minuti con tampone di cacodilato di sodio 0,1 M 1 volta e 2 volte per 5 minuti ciascuno con acqua distillata di grado molecolare (DI).
7. Colorare con acetato di uranile (UA) allo 0,5% per 1 ora RT o durante la notte a 4 °C al buio.
8. Rimuovere l'acetato di uranile e risciacquare 5 volte per 5 minuti ciascuno con acqua distillata di grado molecolare. Prima dell'ultimo lavaggio e mentre il campione è ancora immerso in acqua deionizzata, tagliare il tappetino in silicone attorno al campione appuntato con una lama di rasoio. Solleva questo piccolo pezzo di tappetino in silicone dalla piastra e inseriscilo in un tubo di polipropilene.
   NOTA: È importante che il campione rimanga appuntato al pezzo di silicone mentre è nel tubo. Il passaggio ai tubi in polipropilene in questa fase è necessario perché l'ossido di propilene utilizzato nelle fasi successive degraderà il polistirene delle lastre da 35 mm.
9. Dopo aver rimosso l'ultimo tampone, sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 25%. Scartare l'etanolo al 25% e incubare con etanolo al 25% per 3 minuti con ghiaccio.
10. Rimuovere l'etanolo al 25%. Sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 50%. Scartare l'etanolo al 50% e incubare con etanolo al 50% per 3 minuti con ghiaccio.
11. Rimuovere l'etanolo al 50% e sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 75%. Scartare l'etanolo al 75% e incubare con etanolo al 75% per 3 minuti con ghiaccio.
12. Rimuovere l'etanolo al 75% e sciacquare brevemente 1 volta con etanolo al 95%. Scartare l'etanolo al 95% e incubare con etanolo al 95% per 3 minuti con ghiaccio.
13. Rimuovere l'etanolo al 95% e lavare 3 volte, almeno 10 minuti ogni volta, con etanolo al 100% (200 proof). Rimuovere l'etanolo al 100% e aggiungere l'ossido di propilene (PO). Risciacquare 3 volte almeno 10 minuti ciascuno, con PO.
14. Preparare la miscela di resina come descritto di seguito.
    1. Riscaldare i componenti della resina a 60 °C per liquefare completamente. Miscelare accuratamente 12,5 mL di Embed-218, 7,5 mL di Araldite 502 e 27,5 mL di DDSA in una provetta da 50 mL a 60 °C. Questa miscela può essere conservata per 6 mesi a 4 °C. Scaldarlo a 60 °C prima dell'uso. Aliquotare la quantità richiesta prima dell'uso.
15. Incorporare gli esempi come descritto di seguito.
    1. Mettere un'aliquota della miscela di resina in una provetta e aggiungere 20 μL/mL di attivatore DMP-30. Mescolare accuratamente ruotando a 60 °C; Il colore dovrebbe scurirsi.
    2. Diluire questa aliquota di resina attivata del 50% in PO e lasciare che la resina e il PO si mescolino completamente.
    3. Rimuovere l'ultimo risciacquo PO dalla provetta contenente il campione e sostituirla con la miscela di resina/PO al 50%, riempiendo quasi completamente la provetta. Ruotare il campione per una notte a temperatura ambiente.
    4. Il giorno seguente, miscelare una nuova aliquota di resina (1 mL per campione) con 20 μL/mL di DMP-30.
16. Posizionare il campione in una capsula di polipropilene con un piccolo volume di miscela di resina/PO al 50% dalla provetta del campione sotto un microscopio da dissezione (ingrandimento ~6x) e rimuovere con cautela i perni dal tessuto. Trasferire solo il tessuto in un'altra capsula in polipropilene contenente una piccola quantità di resina al 100% con un attivatore DMP-30.
17. Riempi uno stampo per inclusione in silicone con la resina al 100% con l'attivatore DMP-30 e posiziona con cura il campione nello stampo. Mettere lo stampo in forno e cuocere a 60 °C per almeno 48 h. Il campione preparato è mostrato nella Figura 2B.
18. Eseguire l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione ad ampio raggio (WA-TEM) come descritto in^10,11. Vedere la Figura 3 per una rappresentazione del processo che va da una puntura iniziale a un trombo di 1 minuto reso in 3 dimensioni. L'inclusione di un protocollo dettagliato per l'imaging al microscopio elettronico WA-TEM montato non è inclusa qui e va oltre lo scopo dei presenti protocolli sulla preparazione del campione.
    NOTA: WA-TEM è una capacità sottovalutata della maggior parte dei moderni microscopi elettronici a trasmissione con tavolino computerizzato. Il software shareware che supporta queste funzioni^10,11 è disponibile presso il gruppo del Dr. David Mastronarde, Università del Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Risultati

Quantificazione degli effetti dei farmaci sul tempo di sanguinamento della ferita da puntura
I tempi di sanguinamento della ferita da puntura forniscono un modello fisiologico di un rischio farmacologico che può essere facilmente eseguito nei topi. I risultati che derivano da un esperimento su una ferita da puntura sono predittivi. Qui, mostriamo una curva di sanguinamento dose-risposta di dabigatran. Il dabigatran, un inibitore della trombina, è usato come anticoag...

Discussione

Presentiamo una procedura dettagliata per la produzione di trombi emostatici nelle vene giugulari e nelle arterie femorali, la loro fissazione di perfusione in situ e l'elaborazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata. Le procedure complessive sono utili per generare trombi emostatici per l'analisi ultrastrutturale e per confrontare i tempi di sanguinamento in topi sperimentali, ad esempio topi trattati con diversi tipi e dosaggi di f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000