מוסטזיס פצע ניקוב והכנת דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח מונטאז'

Summary

הליך פצע ניקוב להיווצרות פקקת המוסטטית מוצג כאן. הטרומבי שנוצר גדול וקוטרו מאות מיקרונים. לפיכך, גישות הדמיית נפח מתאימות. אנו מציעים מונטאז' מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שידור כגישה ברזולוציה גבוהה הזמינה לרבים ומפרטים פרוטוקול הכנה.

Abstract

המוסטאזיס, תהליך של שליטה פיזיולוגית נורמלית של נזק לכלי הדם, הוא בסיסי לחיי אדם. כולנו סובלים מחתכים קלים ומפצעי דקירה מעת לעת. בהמוסטאזיס, צבירת טסיות המגבילה את עצמה מובילה להיווצרות פקקת מובנית שבה הפסקת הדימום נובעת מסגירת החור מבחוץ. אפיון מפורט של מבנה זה עשוי להוביל להבחנות בין המוסטאזיס לפקקת, מקרה של צבירת טסיות יתר המובילה לקרישה חסימתית. מוצגת כאן גישה מבוססת הדמיה למבנה פקקת פצעי ניקוב המתבססת על היכולת של מיקרוסקופ אלקטרונים בחתך דק לדמיין את פנים התרומבי ההמוסטטי. השלב הבסיסי ביותר בכל פרוטוקול ניסויי מבוסס הדמיה הוא הכנת דגימה טובה. הפרוטוקול מספק נהלים מפורטים להכנת פצעי דקירה וטרומבי עשיר בטסיות בעכברים למיקרוסקופ אלקטרונים עוקב. ניתן נוהל מפורט לקיבוע באתרו של פקקת פצע הניקוב היוצרת ועיבודו לאחר מכן לצביעה והטבעה למיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים מוצג כטכניקת הדמיה סופית בגלל יכולתו, בשילוב עם חתך רציף, לדמיין את הפרטים של פנים פקקת ברזולוציה גבוהה. כשיטת הדמיה, מיקרוסקופ אלקטרונים נותן דגימה בלתי משוחדת ופלט ניסיוני המשתנה מננומטר למילימטר ב -2 או 3 ממדים. תוכנה חופשית מתאימה למיקרוסקופ אלקטרונים מצוטטת שתתמוך במיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שבו ניתן למזג מאות מסגרות כדי לתת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של חתכי טרומבי פצע ניקוב שלמים. לפיכך, כל אזור משנה של קובץ התמונה יכול להיות ממוקם בקלות לתוך ההקשר של חתך מלא.

Introduction

היווצרות פקקת פצע לנקב שמובילה להפסקת דימום היא אחד האירועים החיוניים ביותר בחיים¹. עם זאת, למרות חיוניות זו, הידע על מה שקורה מבחינה מבנית במהלך היווצרות פקקת, בין אם זה בווריד, עורק, אירוע טרשתי, או קריש חסימתי, הוגבל על ידי רזולוציה ועומק הדמיה. מיקרוסקופ אור קונבנציונלי מוגבל בעומקו בהשוואה לפקקת פצע ניקוב מלא, 200 עד 300 מיקרומטר ב-Z¹, וברמת הרזולוציה בהשוואה לגודל אברוני טסיות הדם והמרווח ביניהם, לעתים קרובות פחות מ-30 ננומטר². מיקרוסקופ אור דו-פוטוני יכול להפיק את עומק ההדמיה הדרוש אך אינו משפר את הרזולוציה באופן משמעותי. ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אור, למ....

Protocol

הניסויים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה. כאן נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בני 8 - 12 שבועות. עכברים אלה הם מבוגרים צעירים עם הצטברות קטנה של שומן. אותם הליכים חלים על עכברים מוטנטים עבור חלבונים שונים החשובים hemostasis, כגון גורם פון Willebrand או טסיות גליקופרוטאין VI (GPVI)^5,6. כל הציוד, כלי הניתוח, הריאגנטים והחומרים האחרים שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים.

1. פצע ניקוב וריד ג'וגולרי/עורק הירך

תוצאות

כימות השפעות התרופה על זמן דימום פצע דקירה
זמני דימום פצעי ניקוב מספקים מודל פיזיולוגי של סיכון תרופתי שניתן לבצע בקלות בעכברים. תוצאות שמגיעות מניסוי פצע דקירה הן ניבוי. כאן, אנו מראים עקומת דימום של מנה-תגובה dabigatran. Dabigatran, מעכב טרומבין, משמש כנוגד קרישה פומי ?.......

Discussion

אנו מציגים הליך פצע ניקוב מפורט לייצור תרומבי המוסטטי בוורידים הצוואריים ובעורקי הירך, קיבוע זילוח באתרם , ועיבוד דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים של שידור שטח רחב מונטאז'. ההליכים הכוללים שימושיים ליצירת תרומבי המוסטטי לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי ולהשוואת זמני דימום בעכ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000