JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הליך פצע ניקוב להיווצרות פקקת המוסטטית מוצג כאן. הטרומבי שנוצר גדול וקוטרו מאות מיקרונים. לפיכך, גישות הדמיית נפח מתאימות. אנו מציעים מונטאז' מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שידור כגישה ברזולוציה גבוהה הזמינה לרבים ומפרטים פרוטוקול הכנה.

Abstract

המוסטאזיס, תהליך של שליטה פיזיולוגית נורמלית של נזק לכלי הדם, הוא בסיסי לחיי אדם. כולנו סובלים מחתכים קלים ומפצעי דקירה מעת לעת. בהמוסטאזיס, צבירת טסיות המגבילה את עצמה מובילה להיווצרות פקקת מובנית שבה הפסקת הדימום נובעת מסגירת החור מבחוץ. אפיון מפורט של מבנה זה עשוי להוביל להבחנות בין המוסטאזיס לפקקת, מקרה של צבירת טסיות יתר המובילה לקרישה חסימתית. מוצגת כאן גישה מבוססת הדמיה למבנה פקקת פצעי ניקוב המתבססת על היכולת של מיקרוסקופ אלקטרונים בחתך דק לדמיין את פנים התרומבי ההמוסטטי. השלב הבסיסי ביותר בכל פרוטוקול ניסויי מבוסס הדמיה הוא הכנת דגימה טובה. הפרוטוקול מספק נהלים מפורטים להכנת פצעי דקירה וטרומבי עשיר בטסיות בעכברים למיקרוסקופ אלקטרונים עוקב. ניתן נוהל מפורט לקיבוע באתרו של פקקת פצע הניקוב היוצרת ועיבודו לאחר מכן לצביעה והטבעה למיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים מוצג כטכניקת הדמיה סופית בגלל יכולתו, בשילוב עם חתך רציף, לדמיין את הפרטים של פנים פקקת ברזולוציה גבוהה. כשיטת הדמיה, מיקרוסקופ אלקטרונים נותן דגימה בלתי משוחדת ופלט ניסיוני המשתנה מננומטר למילימטר ב -2 או 3 ממדים. תוכנה חופשית מתאימה למיקרוסקופ אלקטרונים מצוטטת שתתמוך במיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שבו ניתן למזג מאות מסגרות כדי לתת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של חתכי טרומבי פצע ניקוב שלמים. לפיכך, כל אזור משנה של קובץ התמונה יכול להיות ממוקם בקלות לתוך ההקשר של חתך מלא.

Introduction

היווצרות פקקת פצע לנקב שמובילה להפסקת דימום היא אחד האירועים החיוניים ביותר בחיים1. עם זאת, למרות חיוניות זו, הידע על מה שקורה מבחינה מבנית במהלך היווצרות פקקת, בין אם זה בווריד, עורק, אירוע טרשתי, או קריש חסימתי, הוגבל על ידי רזולוציה ועומק הדמיה. מיקרוסקופ אור קונבנציונלי מוגבל בעומקו בהשוואה לפקקת פצע ניקוב מלא, 200 עד 300 מיקרומטר ב-Z1, וברמת הרזולוציה בהשוואה לגודל אברוני טסיות הדם והמרווח ביניהם, לעתים קרובות פחות מ-30 ננומטר2. מיקרוסקופ אור דו-פוטוני יכול להפיק את עומק ההדמיה הדרוש אך אינו משפר את הרזולוציה באופן משמעותי. ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אור, למשל, טכניקות סופר-רזולוציה, עדיין מוגבלת ברזולוציה, בפועל ~ 20 ננומטר ב- XY וכפול מזה ב- Z, ועומק מוגבל, לא יותר מאשר מיקרוסקופ אור קונבנציונלי. יתר על כן, מיקרוסקופ אור ברזולוציית על, כמו רוב מיקרוסקופ האור המחקרי, מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי, טכניקה המוטה מטבעה לקבוצה קטנה של חלבונים מועמדים שעבורם קיימים נוגדנים טובים או מבנים מתויגים טובים3. לסיכום, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קונבנציונלי יכול, לכל היותר, לדמיין את פני השטח של פקקת עשירה בטסיות דם.

כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה לאפיון מבנה פקקת, היו לנו שלוש מטרות. ראשית, יש לייצר פצע נקב מוגדר בווריד או בעורק של עכבר שניתן לייצב בקלות באתרו על ידי קיבוע כימי. שנית, ליישם הליך הכנה המדגיש את שימור הממברנה, מטרה העולה בקנה אחד עם המטרה של הגדרת המיקום של טסיות בודדות בתוך פקקת יוצרת. שלישית, השתמש בטכניקת הדמיה בלתי משוחדת, שבתמונה אחת ניתן לשנות את קנה המידה שלה מקנה מידה ננומטרי לכמעט מילימטרי.

מיקרוסקופ אלקטרונים מונטגדי ורחב שטח נבחר כטכניקת הדמיה עיקרית מסיבה חשובה אחת: בהדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים רואים מגוון עצום של תכונות בתוך התא המתארות את אברוניו ותכונותיו בתוך האברונים. ניתן לזהות עצמים קטנים כגון ריבוזומים. טווח תכונות זה נראה מכיוון שכתמי המתכות הכבדות צפופות האלקטרונים, אורניל, עופרת ואוסמיום, המשמשים למיקרוסקופ אלקטרונים ליצירת ניגודיות, נקשרים למגוון רחב של מולקולות. בתמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים רואים הרבה ממה שיש שם, בעוד שבגישות של אימונופלואורסנציה ותיוג חלבונים, רואים רק את מה שנדלק. זה אומר, למשל, את אתרי האנטיגן הקיימים על מין חלבון בודד נתון. במקרה של מולקולה מתויגת, לרוב חלבון, זהו האתר(ים) שבו נמצא החלבון. כל שאר המולקולות כהות ואינן מוארות. עם זאת, האם בחירה זו של מיקרוסקופ אלקטרונים מעשית? פקקת פצע ניקוב יש גודל של 300 על 500 מיקרומטר, ובגודל פיקסל של 3 ננומטר, כלומר תמונה של 100,000 על 167,000 פיקסלים. מצלמת מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה יש 4000 על 4000 פיקסלים. משמעות הדבר היא שיש לתפור/למזג כ- 1000 מסגרות כדי ליצור תמונה אחת. זוהי אפשרות שהייתה קיימת ברוב מיקרוסקופ האלקטרונים שיוצרו ב-15 השנים האחרונות. שלב המיקרוסקופ ממוחשב, וניתן לתפור את התמונות יחד עם מחשב. זהו הרציונל שהוביל לבחירות שעמדו בבסיס ניסוח הפרוטוקול המוצג.

לסיכום, אנו מציגים להלן סדרה של צעדים המעניקים פצע הניתן לשחזור בווריד או בעורק של עכברים, שלאחר מכן, בעקבות שלבי קיבוע באתרם ושלבי הטבעה מאוחרים יותר, ניתן לדמיין על ידי מונטאז', מיקרוסקופ אלקטרונים שידור שטח רחב בקנה מידה ננומטר ובתמונה תפורה דמיינו בקנה מידה קרוב למ"מ, קנה המידה של בפועל באתרו פקקת קבועה. סקלביליות מסוג זה נדרשת להבנת היווצרות פקקת הן כבעיה בהמטולוגיה/בריאות והן כמערכת ביולוגית התפתחותית שבה טסיות הדם הן סוג התא העיקרי. פיתוחים אלה מספקים מעלה גדולה של מיקרוסקופ אלקטרונים, כלומר, אדם רואה מה יש שם, לא רק מה נדלק. לקבלת פרוטוקול מפורט על הכנת דגימות עבור מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים בלוק טורי (SBF-SEM), הקורא מופנה למאמר שפורסם לאחרונה על ידי Joshi et al.4.

Protocol

הניסויים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה. כאן נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בני 8 - 12 שבועות. עכברים אלה הם מבוגרים צעירים עם הצטברות קטנה של שומן. אותם הליכים חלים על עכברים מוטנטים עבור חלבונים שונים החשובים hemostasis, כגון גורם פון Willebrand או טסיות גליקופרוטאין VI (GPVI)5,6. כל הציוד, כלי הניתוח, הריאגנטים והחומרים האחרים שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים.

1. פצע ניקוב וריד ג'וגולרי/עורק הירך 1,7

  1. הרדמה של העכבר
    1. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה וסובבו את הוופורייזר האיזופלורן לקביעת קצב זרימה גבוה (500 מ"ל/דקה, 3% איזופלורן). Isoflurane נבחר כי יש לו השפעה קטנה על קוטר כלי הדם.
      אזהרה: חשיפה ארוכת טווח לאיזופלורן עלולה לגרום להשפעות בריאותיות שליליות. השימוש בוופורייזר בזרימה נמוכה, מיכלי לכידת גז הרדמה ואוורור טוב בחדר יכולים להפחית מאוד את החשיפה.
    2. כאשר העכבר נראה במצב שינה, צבוט את אחת מאצבעות רגליו של העכבר כדי לראות אם העכבר מגיב. אם כן, החזיר את העכבר לתא האינדוקציה למשך מספר דקות ולאחר מכן נסה שוב את בדיקת הצביטה. אם העכבר אינו מגיב, הניחו אותו במצב שכיבה על צלחת החימום (מכוסה בעבר ברדיד אלומיניום).
    3. הנמיכו את הוופורייזר לספיקה נמוכה (100 מ"ל/דקה, 1.75% איזופלורן). הניחו את אפו של העכבר בתוך חרוט האף. מרחיבים כל איבר ומדביקים כלפי מטה עם חתיכות קטנות של סרט הדבקה.
    4. הכנס את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית והגדר את הטמפרטורה ל -37 ° C בבקר הטמפרטורה. הדביקו את כבל בדיקת הטמפרטורה כדי למנוע מהגשושית להישלף בטעות.
  2. חתך עכבר
    1. בעזרת הקוצצים יש לגלח את צוואר העכבר וחזהו (עבור וריד הצוואר) או את רגל ימין הפנימית (עבור עורק הירך). נגבו את גזירי הפרווה בעזרת פד אלכוהול. במידת הצורך, עברו שוב על האזור עם הקוצצים כדי להסיר את שאריות הפרווה.
    2. נגבו שוב את האזור עם כרית אלכוהול טרי כדי לנקות את כל הגזירה. חשוב מאוד שהאזור יהיה נקי ככל האפשר. אשר את מישור הניתוח של ההרדמה באמצעות צביטת בוהן.
    3. בעזרת מספריים ומלקחיים קהים, להרים ולחתוך את העור מעל וריד הצוואר הימני. חתכו חלון עגול בעור גדול מספיק כדי לחשוף את הווריד הצווארי וחלק מהרקמה שמסביב.
  3. ניקוי הווריד הצווארי (אותם עקרונות חלים על עורק הירך)
    1. באמצעות טכניקת הדיסקציה הקהה, דחפו בעדינות הצידה את בלוטות השומן והלימפה, כמו גם את רקמת החיבור.
      הערה: ניקוי כללי סביב הספינה מתבצע בשלב זה; עם זאת, ניקוי זהיר ויסודי יתבצע מתחת למיקרוסקופ לאחר שווריד הצוואר מקובע בפרפורמלדהיד למשך 24 שעות.
    2. ממלאים מזרק 20 מ"ל במי מלח רגילים המחוממים ל 37 מעלות צלזיוס. טען את המזרק לתוך משאבת עירוי מזרק. חבר את מחט הפרפר 27G ואת הצינור הקשור למזרק.
    3. כוונו את משאבת המזרק לקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה. זרם המלח העדין ישטוף דם מהווריד/העורק המנוקב. מקמו את זרם המלח כמה מ"מ לצד אתר הניקוב, ולא ישירות מעליו.
  4. ניקוב הווריד הצווארי/עורק הירך
    1. הפעל את הטיימר. קבל מחט היפודרמית 30G (קוטר נומינלי 300 מיקרומטר) עבור הווריד הצווארי ומחט היפודרמית 33G (קוטר 200 מיקרומטר) עבור עורק הירך. השימוש במחט קטנה יותר נותן רק זמן דימום מעט ארוך יותר למצב עורקי בלחץ גבוה יותר.
    2. סובב את השיקוע כלפי מעלה. מקמו את המחט בזווית של 25° מעל הווריד הצווארי/עורק הירך. שימו לב לשעה.
    3. נקב במהירות את כלי השיט, תוך הקפדה לנקב את החלק העליון של הכלי בלבד. היזהרו לא לנקב גם את תחתית הכלי. שימו לב לזמן שבו הדימום נפסק לחלוטין.
    4. המתינו לפרק הזמן המתאים לקבלת היווצרות פקקת (איור 2A) לפני שתתחילו בקיבוע זילוח (כלומר, 1, 5, 10 או 20 דקות כדי להשיג שלבים שונים של התפתחות פקקת). יש להרדים את בעל החיים על ידי המתת חסד או לפעול לפי הנחיות מוסדיות מקומיות להמתת חסד.
  5. ביצוע קיבוע זילוח transcardial
    1. הגדר את המשאבה הפריסטלטית לפני תחילת הניתוח. מניחים שתי מבחנות חרוטיות בנפח 50 מ"ל במדף מבחנה. מלאו צינורית אחת בתמיסת קיבוע פרפורמלדהיד 4% שהוכנה בתמיסת חיץ נתרן קקודילט (0.2 M נתרן קקודילט, 0.15 M נתרן כלורי ב- pH 7.4) למחקרי ניקוב ג'וגולרי ומלאו את הצינור השני בתמיסת חיץ נתרן קקודילט.
      הערה: התנאים המפורטים כאן מספיקים למקרה בלחץ נמוך של הצוואר ולאחר מכן משתנים עבור מקרה לחץ גבוה יותר של עורק. במחקרי מערכת לחץ גבוה יותר עם עורקים, כלומר עורק הירך, מקבע הפרפורמלדהיד מתווסף עם 0.1% גלוטראלדהיד, וקיבוע טפטוף חיצוני משולב עם קיבוע זילוח.
    2. הניחו את קצה הספיגה של צינור המשאבה לתוך הצינור המכיל את תמיסת החיץ. חברו מחט פרפר 27G עם צינורות נלווים לקצה היציאה של צינור המשאבה והניחו את המחט בכד נקי.
    3. כוונו את המשאבה הפריסטלטית לקצב זרימה של 10 מ"ל/דקה. הפעל את משאבת הזילוח.
    4. כאשר תמיסת החיץ מתחילה לזרום מהמחט לתוך הכד, כבה את המשאבה. הצינור והמחט מוכנים כעת לזילוח הטרנסקרדיאלי.
    5. חשוף את חלל החזה על ידי ביצוע חתך קו אמצע בעור מראש עצם החזה ועד כמה מילימטרים מעבר לתחתית עצם החזה באמצעות מספריים מנתחים ומלקחיים קהים. בצע חתכים רוחביים לאורך בסיס כלוב הצלעות, החל מקו האמצע וחיתוך מהמדיאלי לצדדי בכל צד.
    6. מיד לפני תחילת זילוח קרום הלב, לפתוח במהירות את כלוב הצלעות ולשקף כל צד כדי לחשוף את הלב.
    7. הפעל את המשאבה הפריסטלטית. מניחים את קצה מחט הפרפר 27G בבסיס החדר השמאלי.
    8. תוך כדי החזקת המחט מאובטחת בחדר השמאלי, חותכים חריץ באוריק הימני באמצעות מספריים חדים לניתוח כדי לאפשר לדם ולנוזל הזלוף לזרום החוצה. שים לב לשעה בטיימר.
    9. יש לערבב עם תמיסת חיץ למשך 3 דקות כדי לשטוף את הדם ממערכת הדם. בעודכם עדיין מחזיקים את המחט מאובטחת בחדר השמאלי, כבו את המשאבה הפריסטלטית והעבירו את קצה הספיגה של צינור המשאבה הפריסטלטית אל צינור 50 מ"ל המכיל את התמיסה המקבעת.
    10. שים לב לשעה בטיימר. הפעל שוב את המשאבה הפריסטלטית ונקב עם התמיסה המקבעת למשך 7 דקות. כבו את המשאבה הפריסטלטית.
    11. מוציאים את המחט מהחדר השמאלי ומניחים אותה בכוס פסולת. הניחו את קצה הספיגה של צינור המשאבה לתוך מים מזוקקים.
    12. הפעל את המשאבה הפריסטלטית ותן לכ -20 מ"ל מים לזרום דרך הצינור ולהוציא את מחט 27G לתוך הפסולת כדי לנקות את הצינור. הקפד לתת לכל המים לצאת מהצינור והמחט לפני כיבוי המשאבה.

2. איסוף דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים

  1. לאחר קיבוע זילוח בתוספת קיבוע חיצוני ראשוני של 2 דקות במקרה של פצעי ניקוב בעורק הירך, יש לנתח בזהירות את החלק של וריד הצוואר/עורק הירך המכיל את אתר הניקוב והפקקת (איור 2A). בעזרת מספריים חדים, בצע חיתוך אלכסוני לרוחב הקצה הדיסטלי של קטע הכלי ובצע חיתוך ישר לרוחב הקצה הפרוקסימלי של קטע הכלי.
    הערה: ביצוע חתכים באופן זה מסייע לכוון את כלי הדם מאוחר יותר ולזהות את כיוון זרימת הדם בכלי השיט.
  2. יש לטבול את מקטע כלי הדם בטמפרטורת חדר טרייה, 4% פרפורמלדהיד בתמיסת חיץ נתרן קקודיל (0.2 M נתרן קקודילט, 0.15 M נתרן כלורי ב- pH 7.4) ולהניח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  3. מעבירים את הרקמה הקבועה ל-4°C למשך 24 שעות. למחרת, קח צלחת תרבית 35 מ"מ המכילה משטח סיליקון בעובי ~ 5 מ"מ (שהוכן מראש על פי הוראות היצרן). יוצקים מספיק נתרן cacodylate תמיסת חיץ לתוך צלחת כדי לטבול את קטע הווריד קבוע.
  4. תוך כדי צפייה תחת מיקרוסקופ אור (~ 15x הגדלה), העבירו בזהירות את הרקמה לצלחת 35 מ"מ המכילה תמיסת חיץ והצמידו כל קצה של הכלי לשטיח הסיליקון באמצעות סיכות מינוטין מנירוסטה ומלקחיים עדינים.
  5. נקו בזהירות את מקטע הווריד הצווארי/עורק הירך באמצעות זוג מספריים זעירים ומלקחיים עדינים מאוד.
    1. לווריד הצוואר בלבד: מוציאים את אחת הפיכות ובעזרת המספריים חותכים את דופן כלי הדם מול אתר הניקוב/פקקת לאורך. פתחו את הכלי בעדינות, ובעזרת 4 עד 5 פינים (כל אחד מהם נחתך לשניים עם חותכי חוטים), הצמידו אותו לשטיחון הסיליקון כשהצד האינטרלומינלי פונה כלפי מעלה.
  6. שאפו את תמיסת החיץ, החליפו אותה במהירות בתמיסת 1% פרפורמלדהיד בתמיסת חיץ נתרן קקודילט והניחו את המכסה על המנה. אין לתת לרקמה להתייבש בכל עת. תמיד לשמור אותו שקוע בנוזל.
  7. אחסנו את הרקמה בטמפרטורה של 4°C עד שיגיע הזמן לעבד אותה למיקרוסקופ אלקטרונים (איור 2B). עיבוד חלק מדגימות פצע ניקוב הווריד הצווארי/עורק הירך להדמיה על ידי SBF-SEM4 ואחרות להדמיה על ידי WA-TEM 8,9. שלבי WA-TEM מתוארים בפירוט להלן.
    התראה: יש לבצע את כל העבודות הכוללות פורמלדהיד, פרופילן אוקסיד, OsO4 ו-2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) במכסה אדים כימי. אלה כימיקלים מסוכנים. חשיפה ל-OsO4 עלולה לגרום לעיוורון ולמוות.
    הערה: כל נפחי השטיפה והכתמים גדולים לפחות פי 2 מנפח הדגימה. ניתן להחליף את 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) עבור 0.1 M נתרן cacodylate buffer. במהלך הליך הקיבוע, חשוב מאוד לא לתת את הדגימות להתייבש, כמו זה ישפיע באופן משמעותי על מבנה אולטרה. השתמש צינורות פוליפרופילן.

3. הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח (WA-TEM)

הערה: שלב זה מייצג נקודת החלטה שבה החוקר מתחייב להתכונן ל- WA-TEM. הליך הכנה זה אינו תומך ב- SBF-SEM. עבור נפח SBF-SEM EM, כל הצביעה חייבת להיעשות לפני הטבעה בפלסטיק. ראה4 לקבלת פרוטוקול הכנה SBF-SEM.

  1. שטפו את דגימת הרקמה בצלחת 35 מ"מ 2x עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) או PBS בטמפרטורת החדר (RT). שמור את הדגימה מוצמדת, המאפשרת מעקב אחר כיוון הדגימה באמצעות שלבי הכנה אלה.
  2. תקן עם 0.8 מ"ל של 0.05% מלכיט ירוק / 2.5% גלוטראלדהיד / 0.1 M נתרן cacodylate (pH 6.7 - 7.0) במשך 20 דקות על קרח.
  3. הסר את הקיבוע ושטוף את הדגימה 4x במשך 5 דקות כל אחד עם 0.1 M נתרן cacodylate. יש להסיר 0.1 M נתרן cacodylate.
  4. Postfix עם 0.8 מ"ל של 0.8% K3Fe(CN)6 או K4Fe(CN)6 / 1.0% OsO4 K3Fe(CN)6 ב 0.1 M נתרן cacodylate. הניחו כיסוי מעל הצלחת כדי להרחיק את האור (OsO4 רגיש לאור). מכתים למשך 20 דקות עד שעה ב-RT.
  5. הסר את OsO4 ושטוף 4x במשך 5 דקות כל אחד עם מאגר נתרן cacodylate 0.1 M. יש להסיר את מאגר הנתרן הקקודילט ואת הכתם עם 1% חומצה טאנית למשך 20 דקות על קרח.
  6. יש להסיר חומצה טאנית ולשטוף במשך 5 דקות עם חיץ נתרן קקודילט באורך 0.1 מ', 1x ו-2x למשך 5 דקות כל אחד במים מזוקקים (DI) באיכות מולקולרית.
  7. יש להכתים עם 0.5% אורניל אצטט (UA) למשך שעה RT או למשך הלילה ב-4°C (75°F) בחושך.
  8. מוציאים את האורניל אצטט ושוטפים 5x במשך 5 דקות כל אחד במים מזוקקים ברמה מולקולרית. לפני השטיפה האחרונה ובזמן שהדגימה עדיין שקועה במי DI, חתכו את משטח הסיליקון סביב הדגימה המוצמדת בעזרת סכין גילוח. הרימו את פיסת משטח הסיליקון הקטנה הזו מהצלחת והכניסו אותה לצינור פוליפרופילן.
    הערה: חשוב שהדגימה תישאר מוצמדת לחתיכת הסיליקון כשהיא בתוך הצינור. מעבר לצינורות פוליפרופילן בשלב זה הוא הכרחי מכיוון שתחמוצת הפרופילן המשמשת בשלבים הבאים תפגע בפוליסטירן של לוחות 35 מ"מ.
  9. לאחר הסרת החיץ האחרון, יש לשטוף בקצרה 1x עם 25% אתנול. השליכו את 25% האתנול ודגרו עם 25% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  10. הסר את 25% אתנול. יש לשטוף בקצרה 1 פעמים באתנול 50%. השליכו את 50% האתנול ודגרו עם 50% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  11. הסירו את 50% האתנול ושטפו בקצרה 1x עם 75% אתנול. השליכו את האתנול 75% ודגרו עם 75% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  12. הסירו את האתנול 75% ושטפו בקצרה 1x עם 95% אתנול. השליכו את האתנול 95% ודגרו עם 95% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  13. הסירו את האתנול 95% ושטפו 3x, לפחות 10 דקות בכל פעם, עם 100% אתנול (הוכחה 200). הסר 100% אתנול והוסף פרופילן אוקסיד (PO). יש לשטוף 3 פעמים לפחות 10 דקות כל אחת, עם PO.
  14. הכינו את תערובת השרף כמתואר להלן.
    1. חממו את רכיבי השרף ב-60°C לנזילה מלאה. ערבבו היטב 12.5 מ"ל של Embed-218, 7.5 מ"ל של Araldite 502 ו-27.5 מ"ל של DDSA יחד בצינור של 50 מ"ל ב-60°C. תערובת זו יכולה להישמר במשך 6 חודשים ב 4 °C. יש לחמם ל-60°C לפני השימוש. Aliquot את הסכום הנדרש לפני השימוש.
  15. הטמע את הדגימות כמתואר להלן.
    1. מניחים aliquot של תערובת שרף בצינור ולהוסיף 20 μL / מ"ל של מפעיל DMP-30. מערבבים היטב על ידי סיבוב ב 60 °C; הצבע צריך להתכהות.
    2. יש לדלל את האליציטוט הזה של שרף פעיל ב-50% ב-PO ולאפשר לשרף ול-PO להתערבב לחלוטין.
    3. הסר את שטיפת PO האחרונה מהצינורית המכילה את הדגימה והחלף אותה בתערובת 50% שרף/PO, כמעט מלא את הצינורית לחלוטין. סובבו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    4. למחרת, לערבב aliquot חדש של שרף (1 מ"ל לדגימה) עם 20 μL / מ"ל של DMP-30.
  16. הניחו את הדגימה בכלי פוליפרופילן עם נפח קטן של תערובת שרף/PO 50% מצינור הדגימה תחת מיקרוסקופ מנתח (~ הגדלה פי 6) והוציאו בזהירות את הפינים מהרקמה. העבר רק את הרקמה לצלחת פוליפרופילן אחרת המכילה כמות קטנה של 100% שרף עם מפעיל DMP-30.
  17. ממלאים תבנית הטבעה סיליקון בשרף 100% עם מפעיל DMP-30 ומניחים בזהירות את הדגימה בתבנית. מניחים תבנית בתנור ואופים ב 60 מעלות צלזיוס לפחות 48 שעות. הדגימה שהוכנה מוצגת באיור 2B.
  18. בצע הדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח (WA-TEM) כמתואר בסעיף10,11. ראו איור 3 לתיאור התהליך העובר מנקב ראשוני לפקקת תלת-ממדית בת דקה אחת. הכללת פרוטוקול מפורט להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים WA-TEM אינה כלולה כאן והיא חורגת מהיקף הפרוטוקולים הנוכחיים על הכנת הדגימה.
    הערה: WA-TEM היא יכולת לא מוערכת מספיק של רוב מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מודרני עם שלב ממוחשב. תוכנת Shareware התומכת בפונקציות אלה10,11 זמינה מקבוצתו של ד"ר דיוויד מסטרונרד, אוניברסיטת קולורדו, בולדר (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

תוצאות

כימות השפעות התרופה על זמן דימום פצע דקירה
זמני דימום פצעי ניקוב מספקים מודל פיזיולוגי של סיכון תרופתי שניתן לבצע בקלות בעכברים. תוצאות שמגיעות מניסוי פצע דקירה הן ניבוי. כאן, אנו מראים עקומת דימום של מנה-תגובה dabigatran. Dabigatran, מעכב טרומבין, משמש כנוגד קרישה פומי ?...

Discussion

אנו מציגים הליך פצע ניקוב מפורט לייצור תרומבי המוסטטי בוורידים הצוואריים ובעורקי הירך, קיבוע זילוח באתרם , ועיבוד דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים של שידור שטח רחב מונטאז'. ההליכים הכוללים שימושיים ליצירת תרומבי המוסטטי לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי ולהשוואת זמני דימום בעכ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.

Acknowledgements

המחברים מודים לעמיתיהם באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (ג'רי וור וסונג ו' רי), באוניברסיטת פנסילבניה (טים סטאלקר ולורנס בראס), באוניברסיטת קנטקי (סידני ו' וייטהארט וסמיטה ג'ושי), ובמכון הלאומי לדימות ביולוגי וביו-הנדסה של המכונים הלאומיים לבריאות (ריצ'רד ד' ליפמן ומריה א' ארונובה) שמהם למדנו רבות. המחברים מביעים הערכה לאיגוד הלב האמריקאי ולמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 ל-BS ופרסי משנה ממענקי ה-NIH R01 HL146373 ו-R35 HL150818) על תמיכה כספית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal Saline SolutionMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein setMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needlesMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needlesMedlineNDA26393
50 mL Conical TubesFisher Scientific06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)MedlineMDS090670Z
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-100
Animal Heating PlatePhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Electron Microscopy Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy CameraCarl Zeiss Microscopy426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mLMedlineB-D303310Z
Calcium ChlorideFisher ScientificC79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mmCorning Inc.430165
Cotton Tipped ApplicatorsMedlineMDS202055H
DMP-30 ActivatorElectron Microscopy Sciences13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSAElectron Microscopy Sciences13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tippedIntegra Miltex6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serratedIntegra Miltex6-6
EMBED 812 ResinElectron Microscopy Sciences14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proofElectron Microscopy Sciences15055
Fisherbrand 4-Way Tube RackFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand Digital TimerFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion PumpFisher Scientific7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 PlyMedlineNON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)Electron Microscopy Sciences16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mLMedline66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5FIntegra Miltex17-305Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 FtVWRMFLX96410-15
L-Aspartic AcidFisher ScientificBP374-100
Lead NitrateFisher ScientificL-62
Malachite Green 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump HeadVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital DriveVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire CuttersFisher Scientific50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences19150
Paraformaldehyde (16% Solution)Electron Microscopy Sciences15710
Physitemp Temperature ControllerPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP-8131
Propylene Oxide, ACS ReagentElectron Microscopy Sciences20401
Pyrex Glass BeakersFisher Scientific02-555-25B
Rectal Temperature Probe for MicePhysitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"3M Company305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences11623
SomnoFlo Low Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01
SomnoFlo Starter Kit for MiceKent ScientificSF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopy495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone ElastomerWorld Precision InstrumentsSYLG184silicone mat
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21700
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma-Aldrich88535
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, SerratedIntegra Miltex18-818Need 2 pairs.
Wagner ScissorsFine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura Animal TrimmerBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopy410135-1001-000

References

  1. Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090 (2021).
  2. Pokrovskaya, I. D., et al. Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058 (2023).
  3. Yadav, S., Storrie, B. The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships. Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).
  4. Joshi, S., et al. Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis. J Vis Exp. (193), e64985 (2023).
  5. Guerrero, J. A., et al. Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation. Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).
  6. Kato, K., et al. The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion. Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).
  7. Tomaiuolo, M., et al. Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury. Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).
  8. Cocchiaro, J. L., et al. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  9. Pokrovskaya, I. D., et al. Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway. Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).
  10. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  11. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  12. Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants. Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).
  13. Kiernan, J. A. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do. Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).
  14. Storrie, B., Attardi, G. Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation. J CellBiol. 56, 819-831 (1973).
  15. Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking. Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).
  16. Klarhofer, M., et al. High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger. Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).
  17. Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. Physiology, cardiovascular. StatPearls. , (2022).
  18. Pokrovskaya, I. D., et al. SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets. Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).
  19. Pokrovskaya, I. D., et al. 3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets. Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved