Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Здесь представлена процедура колотой раны при образовании гемостатического тромба. Образующиеся тромбы имеют большие размеры и достигают сотен микрон в диаметре. Следовательно, подходят подходы к объемной визуализации. Мы предлагаем смонтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию в качестве подхода с высоким разрешением, доступного многим, и детализируемого препаративного протокола.
Гемостаз, процесс нормального физиологического контроля повреждения сосудов, имеет основополагающее значение для жизни человека. Все мы время от времени получаем небольшие порезы и колотые раны. При гемостазе самоограничивающаяся агрегация тромбоцитов приводит к образованию структурированного тромба, при котором остановка кровотечения происходит за счет закрытия отверстия снаружи. Детальная характеристика этой структуры может привести к различиям между гемостазом и тромбозом, случаем чрезмерной агрегации тромбоцитов, приводящей к окклюзионному свертыванию. Здесь представлен подход к структуре тромба колотой раны, основанный на визуализации, который основан на способности тонкой электронной микроскопии визуализировать внутреннюю часть гемостатического тромба. Самым основным шагом в любом экспериментальном протоколе, основанном на визуализации, является хорошая подготовка образцов. В протоколе подробно описаны процедуры подготовки колотых ран и тромбов, обогащенных тромбоцитами, у мышей к последующей электронной микроскопии. Подробно описана методика фиксации in situ образовавшегося тромба пункционной раны и его последующей обработки для окрашивания и встраивания в электронную микроскопию. Электронная микроскопия представлена в качестве метода конечной визуализации из-за ее способности в сочетании с последовательным срезом визуализировать детали внутренней части тромба с высоким разрешением. Как метод визуализации, электронная микроскопия дает несмещенную выборку и экспериментальный результат, который масштабируется от нанометра до миллиметра в 2 или 3 измерениях. Упоминается соответствующее бесплатное программное обеспечение для электронной микроскопии, которое будет поддерживать широкозонную электронную микроскопию, в которой сотни кадров могут быть объединены для получения нанометровой визуализации целых поперечных сечений тромбов проколотой раны. Следовательно, любая подобласть файла изображения может быть легко помещена в контекст полного поперечного сечения.
Образование тромба колотой раны, приводящего к остановке кровотечения, является одним из самых важных событий в жизни1. Тем не менее, несмотря на эту важность, знание того, что происходит структурно во время формирования тромба, будь то в вене, артерии, атеросклеротическом событии или окклюзионном сгустке, было ограничено разрешением и глубиной визуализации. Традиционная световая микроскопия ограничена по глубине по сравнению с полностью сформированным тромбом колокольной раны, от 200 до 300 мкм вZ1, и по уровню разрешения по сравнению с размером тромбоцитарных органелл и расстоянием меж....
Эксперименты были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете медицинских наук Арканзаса. Здесь были использованы самцы и самки C57BL/6 дикого типа в возрасте от 8 до 12 недель. Эти мыши являются молодыми взрослыми особями с небольшим накоплением жира. Те же процедуры применимы к мышам-мутантам в отношении различных белков, важных для гемостаза, таких как фактор фон Виллебранда или тромбоцитарный гликопротеин VI (GPVI)5,6. Все используемое оборудование, хирургические инструменты, реагенты и другие материа....
Количественная оценка влияния препарата на время кровотечения из колотой раны
Время кровотечения из колотой раны обеспечивает физиологическую модель риска приема лекарственного препарата, которая может быть легко проведена на мышах. Результаты, получен?.......
Подробно описана методика производства гемостатических тромбов в яремных венах и бедренных артериях, их перфузионной фиксации in situ , а также обработки образцов для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии. Общие процедуры полезны для гене.......
У авторов нет конфликта интересов, связанного с данным исследованием.
Авторы выражают благодарность коллегам из Университета медицинских наук Арканзаса (Джерри Уэр и Сунг В. Ри), Университета Пенсильвании (Тим Сталкер и Лоуренс Брасс), Университета Кентукки (Сидни В. Уайтхарт и Смита Джоши) и Национального института биовизуализации и биоинженерии Национальных институтов здравоохранения (Ричард Д. Липман и Мария А. Аронова), у которых мы многому научились. Авторы выражают признательность Американской кардиологической ассоциации и Национальному институту сердца, легких и крови Национальных институтов здоровья (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 до BS и субгранты от NIH R01 HL146373 и R35 HL150818) за ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% Normal Saline Solution | Medline | BHL2F7123HH | |
27G x 3/4 EXELint scalp vein set | Medline | NDA26709 | |
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles | Medline | NDA264372 | |
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles | Medline | NDA26393 | |
50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 06-443-20 | |
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090670Z | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
Animal Heating Plate | Physitemp Instruments | HP-1M | |
Araldite GY 502 | Electron Microscopy Sciences | 10900 | |
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera | Carl Zeiss Microscopy | 426560-9031-000 | |
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL | Medline | B-D303310Z | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm | Corning Inc. | 430165 | |
Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202055H | |
DMP-30 Activator | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron Microscopy Sciences | 13700 | |
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped | Integra Miltex | 6-100 | |
Dressing Forceps, 5", standard, serrated | Integra Miltex | 6-6 | |
EMBED 812 Resin | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron Microscopy Sciences | 15055 | |
Fisherbrand 4-Way Tube Rack | Fisher Scientific | 03-448-17 | |
Fisherbrand Digital Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump | Fisher Scientific | 7801001 | |
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply | Medline | NON26224H | |
Glutaraldehyde (10% Solution) | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL | Medline | 66794-017-10 | |
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F | Integra Miltex | 17-305 | Need 2 pairs. |
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft | VWR | MFLX96410-15 | |
L-Aspartic Acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
Malachite Green 4 | Electron Microscopy Sciences | 18100 | |
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | VWR | MFLX77200-62 | |
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive | VWR | MFLX07528-10 | |
MSC Xcelite 5" Wire Cutters | Fisher Scientific | 50-191-9855 | |
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Paraformaldehyde (16% Solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Physitemp Temperature Controller | Physitemp Instruments | TCAT-2LV | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Propylene Oxide, ACS Reagent | Electron Microscopy Sciences | 20401 | |
Pyrex Glass Beakers | Fisher Scientific | 02-555-25B | |
Rectal Temperature Probe for Mice | Physitemp Instruments | RET-3 | |
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000" | 3M Company | 305289 | |
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 11623 | |
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | |
SomnoFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | SF-MSEKIT | |
Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Stereomicroscope steREO Discovery.V12 | Carl Zeiss Microscopy | 495015-9880-010 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | silicone mat |
Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma-Aldrich | 88535 | |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Vannas Spring Micro Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated | Integra Miltex | 18-818 | Need 2 pairs. |
Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | |
Wahl MiniFigura Animal Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9868 | |
Zen Lite Software | Carl Zeiss Microscopy | 410135-1001-000 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены