Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлена процедура колотой раны при образовании гемостатического тромба. Образующиеся тромбы имеют большие размеры и достигают сотен микрон в диаметре. Следовательно, подходят подходы к объемной визуализации. Мы предлагаем смонтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию в качестве подхода с высоким разрешением, доступного многим, и детализируемого препаративного протокола.

Аннотация

Гемостаз, процесс нормального физиологического контроля повреждения сосудов, имеет основополагающее значение для жизни человека. Все мы время от времени получаем небольшие порезы и колотые раны. При гемостазе самоограничивающаяся агрегация тромбоцитов приводит к образованию структурированного тромба, при котором остановка кровотечения происходит за счет закрытия отверстия снаружи. Детальная характеристика этой структуры может привести к различиям между гемостазом и тромбозом, случаем чрезмерной агрегации тромбоцитов, приводящей к окклюзионному свертыванию. Здесь представлен подход к структуре тромба колотой раны, основанный на визуализации, который основан на способности тонкой электронной микроскопии визуализировать внутреннюю часть гемостатического тромба. Самым основным шагом в любом экспериментальном протоколе, основанном на визуализации, является хорошая подготовка образцов. В протоколе подробно описаны процедуры подготовки колотых ран и тромбов, обогащенных тромбоцитами, у мышей к последующей электронной микроскопии. Подробно описана методика фиксации in situ образовавшегося тромба пункционной раны и его последующей обработки для окрашивания и встраивания в электронную микроскопию. Электронная микроскопия представлена в качестве метода конечной визуализации из-за ее способности в сочетании с последовательным срезом визуализировать детали внутренней части тромба с высоким разрешением. Как метод визуализации, электронная микроскопия дает несмещенную выборку и экспериментальный результат, который масштабируется от нанометра до миллиметра в 2 или 3 измерениях. Упоминается соответствующее бесплатное программное обеспечение для электронной микроскопии, которое будет поддерживать широкозонную электронную микроскопию, в которой сотни кадров могут быть объединены для получения нанометровой визуализации целых поперечных сечений тромбов проколотой раны. Следовательно, любая подобласть файла изображения может быть легко помещена в контекст полного поперечного сечения.

Введение

Образование тромба колотой раны, приводящего к остановке кровотечения, является одним из самых важных событий в жизни1. Тем не менее, несмотря на эту важность, знание того, что происходит структурно во время формирования тромба, будь то в вене, артерии, атеросклеротическом событии или окклюзионном сгустке, было ограничено разрешением и глубиной визуализации. Традиционная световая микроскопия ограничена по глубине по сравнению с полностью сформированным тромбом колокольной раны, от 200 до 300 мкм вZ1, и по уровню разрешения по сравнению с размером тромбоцитарных органелл и расстоянием меж....

протокол

Эксперименты были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете медицинских наук Арканзаса. Здесь были использованы самцы и самки C57BL/6 дикого типа в возрасте от 8 до 12 недель. Эти мыши являются молодыми взрослыми особями с небольшим накоплением жира. Те же процедуры применимы к мышам-мутантам в отношении различных белков, важных для гемостаза, таких как фактор фон Виллебранда или тромбоцитарный гликопротеин VI (GPVI)5,6. Все используемое оборудование, хирургические инструменты, реагенты и другие материа....

Результаты

Количественная оценка влияния препарата на время кровотечения из колотой раны
Время кровотечения из колотой раны обеспечивает физиологическую модель риска приема лекарственного препарата, которая может быть легко проведена на мышах. Результаты, получен?.......

Обсуждение

Подробно описана методика производства гемостатических тромбов в яремных венах и бедренных артериях, их перфузионной фиксации in situ , а также обработки образцов для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии. Общие процедуры полезны для гене.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, связанного с данным исследованием.

Благодарности

Авторы выражают благодарность коллегам из Университета медицинских наук Арканзаса (Джерри Уэр и Сунг В. Ри), Университета Пенсильвании (Тим Сталкер и Лоуренс Брасс), Университета Кентукки (Сидни В. Уайтхарт и Смита Джоши) и Национального института биовизуализации и биоинженерии Национальных институтов здравоохранения (Ричард Д. Липман и Мария А. Аронова), у которых мы многому научились. Авторы выражают признательность Американской кардиологической ассоциации и Национальному институту сердца, легких и крови Национальных институтов здоровья (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 до BS и субгранты от NIH R01 HL146373 и R35 HL150818) за ....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal Saline SolutionMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein setMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needlesMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needlesMedlineNDA26393
50 mL Conical TubesFisher Scientific06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)MedlineMDS090670Z
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-100
Animal Heating PlatePhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Electron Microscopy Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy CameraCarl Zeiss Microscopy426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mLMedlineB-D303310Z
Calcium ChlorideFisher ScientificC79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mmCorning Inc.430165
Cotton Tipped ApplicatorsMedlineMDS202055H
DMP-30 ActivatorElectron Microscopy Sciences13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSAElectron Microscopy Sciences13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tippedIntegra Miltex6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serratedIntegra Miltex6-6
EMBED 812 ResinElectron Microscopy Sciences14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proofElectron Microscopy Sciences15055
Fisherbrand 4-Way Tube RackFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand Digital TimerFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion PumpFisher Scientific7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 PlyMedlineNON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)Electron Microscopy Sciences16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mLMedline66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5FIntegra Miltex17-305Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 FtVWRMFLX96410-15
L-Aspartic AcidFisher ScientificBP374-100
Lead NitrateFisher ScientificL-62
Malachite Green 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump HeadVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital DriveVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire CuttersFisher Scientific50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences19150
Paraformaldehyde (16% Solution)Electron Microscopy Sciences15710
Physitemp Temperature ControllerPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP-8131
Propylene Oxide, ACS ReagentElectron Microscopy Sciences20401
Pyrex Glass BeakersFisher Scientific02-555-25B
Rectal Temperature Probe for MicePhysitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"3M Company305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences11623
SomnoFlo Low Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01
SomnoFlo Starter Kit for MiceKent ScientificSF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopy495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone ElastomerWorld Precision InstrumentsSYLG184silicone mat
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21700
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma-Aldrich88535
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, SerratedIntegra Miltex18-818Need 2 pairs.
Wagner ScissorsFine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura Animal TrimmerBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopy410135-1001-000

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены