Гемостаз пункционной раны и подготовка образцов для анализа методом широкоугольной электронной микроскопии

Резюме

Здесь представлена процедура колотой раны при образовании гемостатического тромба. Образующиеся тромбы имеют большие размеры и достигают сотен микрон в диаметре. Следовательно, подходят подходы к объемной визуализации. Мы предлагаем смонтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию в качестве подхода с высоким разрешением, доступного многим, и детализируемого препаративного протокола.

Аннотация

Гемостаз, процесс нормального физиологического контроля повреждения сосудов, имеет основополагающее значение для жизни человека. Все мы время от времени получаем небольшие порезы и колотые раны. При гемостазе самоограничивающаяся агрегация тромбоцитов приводит к образованию структурированного тромба, при котором остановка кровотечения происходит за счет закрытия отверстия снаружи. Детальная характеристика этой структуры может привести к различиям между гемостазом и тромбозом, случаем чрезмерной агрегации тромбоцитов, приводящей к окклюзионному свертыванию. Здесь представлен подход к структуре тромба колотой раны, основанный на визуализации, который основан на способности тонкой электронной микроскопии визуализировать внутреннюю часть гемостатического тромба. Самым основным шагом в любом экспериментальном протоколе, основанном на визуализации, является хорошая подготовка образцов. В протоколе подробно описаны процедуры подготовки колотых ран и тромбов, обогащенных тромбоцитами, у мышей к последующей электронной микроскопии. Подробно описана методика фиксации in situ образовавшегося тромба пункционной раны и его последующей обработки для окрашивания и встраивания в электронную микроскопию. Электронная микроскопия представлена в качестве метода конечной визуализации из-за ее способности в сочетании с последовательным срезом визуализировать детали внутренней части тромба с высоким разрешением. Как метод визуализации, электронная микроскопия дает несмещенную выборку и экспериментальный результат, который масштабируется от нанометра до миллиметра в 2 или 3 измерениях. Упоминается соответствующее бесплатное программное обеспечение для электронной микроскопии, которое будет поддерживать широкозонную электронную микроскопию, в которой сотни кадров могут быть объединены для получения нанометровой визуализации целых поперечных сечений тромбов проколотой раны. Следовательно, любая подобласть файла изображения может быть легко помещена в контекст полного поперечного сечения.

Введение

Образование тромба колотой раны, приводящего к остановке кровотечения, является одним из самых важных событий в жизни¹. Тем не менее, несмотря на эту важность, знание того, что происходит структурно во время формирования тромба, будь то в вене, артерии, атеросклеротическом событии или окклюзионном сгустке, было ограничено разрешением и глубиной визуализации. Традиционная световая микроскопия ограничена по глубине по сравнению с полностью сформированным тромбом колокольной раны, от 200 до 300 мкм в^Z1, и по уровню разрешения по сравнению с размером тромбоцитарных органелл и расстоянием между ними, часто менее 30^нм2. Двухфотонная световая микроскопия может обеспечить необходимую глубину изображения, но не приводит к значительному повышению разрешения. Самые последние достижения в световой микроскопии, например, методы сверхвысокого разрешения, все еще ограничены разрешением, на практике ~20 нм в XY и в два раза больше в Z, и ограничены по глубине, не больше, чем в обычной световой микроскопии. Кроме того, световая микроскопия со сверхвысоким разрешением, как и большая часть исследовательской световой микроскопии, основана на флуоресцентной микроскопии, методе, который по своей сути смещен в сторону небольшого набора белков-кандидатов, для которых существуют хорошие антитела или хорошие меченые^{конструкции.} В заключение следует отметить, что обычная сканирующая электронная микроскопия может в лучшем случае визуализировать поверхность формирующегося тромба, обогащенного тромбоцитами.

Чтобы преодолеть эти технические ограничения в определении характеристики структуры тромба, мы преследовали три цели. Во-первых, воспроизводимо получить определенную колотую рану в вене или артерии мыши, которая затем может быть легко стабилизирована in situ с помощью химической фиксации. Во-вторых, применять препаративную процедуру, которая подчеркивает сохранение мембраны, что согласуется с целью определения положения отдельных тромбоцитов в формирующемся тромбе. В-третьих, используйте метод непредвзятой визуализации, который в одном изображении можно масштабировать от нанометра до почти миллиметра.

Широкоугольная электронная микроскопия была выбрана в качестве основного метода визуализации по одной важной причине: при визуализации с помощью электронного микроскопа можно увидеть огромное количество особенностей внутри клетки, которые очерчивают ее органеллы и особенности внутри органелл. Небольшие объекты, такие как рибосомы, могут быть распознаны. Этот диапазон особенностей виден потому, что электронно-плотные красители тяжелых металлов, уранил, свинец и осмий, которые используются в электронной микроскопии для получения контраста, связываются с широким спектром молекул. На изображении, полученном с помощью электронного микроскопа, можно увидеть многое из того, что есть, в то время как при использовании иммунофлуоресценции и белкового мечения можно увидеть только то, что светится. Это означает, например, сайты антигенов, присутствующие на данном отдельном виде белка. В случае меченой молекулы, часто белка, это место (участки), где находится этот белок. Все остальные молекулы темные и не подсвечиваются. Однако практичен ли такой выбор электронной микроскопии? Тромб колотой раны имеет размеры 300 на 500 мкм, а при размере пикселя 3 нм это изображение 100 000 на 167 000 пикселей. Качественная камера электронного микроскопа имеет размеры 4000 на 4000 пикселей. Это означает, что примерно 1000 кадров должны быть сшиты/смешаны, чтобы получить одно изображение. Именно такая возможность присутствует в большинстве электронных микроскопов, произведенных за последние 15 лет. Предметный столик микроскопа компьютеризирован, а изображения могут быть сшиты с помощью компьютера. Именно это обоснование привело к выбору, лежащему в основе формулирования представленного протокола.

В заключение мы представляем ниже ряд этапов, которые дают воспроизводимую рану в вене или артерии мышей, которая затем, после этапов фиксации in situ и последующих этапов внедрения, может быть визуализирована с помощью монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии в масштабе nm, а в сшитом изображении, визуализированном в масштабе, близком к mm, масштабе фактического in situ неподвижный тромб. Масштабируемость такого рода необходима для понимания образования тромбов как проблемы в гематологии/здоровье и как системы биологии развития, в которой тромбоциты являются основным типом клеток. Эти достижения обеспечивают главное достоинство электронной микроскопии, а именно, человек видит то, что есть, а не только то, что светится. Для ознакомления с подробным протоколом подготовки образцов для последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии лица (SBF-SEM) читатель может ознакомиться с недавней статьей Joshi et ^al.4.

протокол

Эксперименты были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете медицинских наук Арканзаса. Здесь были использованы самцы и самки C57BL/6 дикого типа в возрасте от 8 до 12 недель. Эти мыши являются молодыми взрослыми особями с небольшим накоплением жира. Те же процедуры применимы к мышам-мутантам в отношении различных белков, важных для гемостаза, таких как фактор фон Виллебранда или тромбоцитарный гликопротеин VI (GPVI)^5,6. Все используемое оборудование, хирургические инструменты, реагенты и другие материалы показаны на рисунке 1 и перечислены в таблице материалов.

1. Прокол раны яремной вены/бедренной артерии ^1,7

1. Обезболивание мыши
   1. Поместите мышь в индукционную камеру и поверните испаритель изофлурана на высокую скорость потока (500 мл/мин, 3% изофлуран). Изофлуран выбирают потому, что он мало влияет на диаметр кровеносных сосудов.
      ВНИМАНИЕ: Длительное воздействие изофлурана может вызвать неблагоприятные последствия для здоровья. Использование испарителя с низким расходом, канистр для улавливания газа для анестезии и хорошей вентиляции помещения может значительно снизить воздействие.
   2. Когда мышь будет казаться спящей, зажмите один из пальцев мыши, чтобы проверить, реагирует ли мышь. Если это так, поместите мышь обратно в индукционную камеру на несколько минут, а затем повторите попытку теста на сжатие. Если мышь не реагирует, поместите ее в лежачем положении на нагревательную пластину (предварительно накрытую алюминиевой фольгой).
   3. Убавьте расход вапорайзера до низкого расхода (100 мл/мин, 1,75% изофлуран). Поместите нос мыши в носовой конус. Вытяните каждую конечность и примотайте вниз небольшими кусочками клейкой ленты.
   4. Вставьте ректальный датчик температуры и установите температуру на 37 °C на терморегуляторе. Заклейте шнур датчика температуры скотчем, чтобы предотвратить случайное вытягивание щупа.
2. Разрез мыши
   1. С помощью машинок для стрижки побрейте шею и грудь мыши (для яремной вены) или внутреннюю правую ногу (для бедренной артерии). Сотрите обрезки шерсти спиртовой салфеткой. При необходимости еще раз пройдитесь по участку машинкой для стрижки, чтобы удалить остатки шерсти.
   2. Снова протрите участок свежей спиртовой салфеткой, чтобы удалить все обрезки. Очень важно, чтобы территория была максимально чистой. Подтвердите операционную плоскость анестезии с помощью щипка на пальце ноги.
   3. С помощью ножниц и тупых щипцов приподнимите и разрежьте кожу над правой яремной веной. Вырежьте на коже круглое окошко, достаточно большое, чтобы обнажить яремную вену и часть окружающих тканей.
3. Чистка яремной вены (те же принципы действуют и для бедренной артерии)
   1. Используя технику тупого рассечения, аккуратно отодвигайте в сторону жировые и лимфатические узлы, а также соединительную ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе проводится некоторая генеральная уборка вокруг судна; Тем не менее, тщательная, тщательная чистка будет проведена под микроскопом после того, как яремная вена будет зафиксирована в параформальдегиде в течение 24 часов.
   2. Наполните шприц объемом 20 мл обычным физиологическим раствором, подогретым до 37 °C. Загрузите шприц в шприцевой инфузионный насос. Прикрепите иглу-бабочку 27G и соответствующую трубку к шприцу.
   3. Установите шприцевой насос на расход 0,5 мл/мин. Нежная струя физиологического раствора смоет кровь из проколотой вены/артерии. Расположите струю физиологического раствора на несколько мм сбоку от места прокола, а не прямо над ним.
4. Пункция яремной вены/бедренной артерии
   1. Запустите таймер. Приобретите иглу для подкожных инъекций 30G (номинальный диаметр 300 мкм) для яремной вены и иглу для подкожных инъекций 33G (диаметр 200 мкм) для бедренной артерии. Использование иглы меньшего размера дает лишь немного больше времени кровотечения при артериальной ситуации с высоким давлением.
   2. Поверните фаску лицевой стороной вверх. Расположите иглу под углом 25° над яремной веной/бедренной артерией. Обратите внимание на время.
   3. Быстро проколите сосуд, проткнув только верхнюю часть сосуда. Будьте осторожны, чтобы не проколоть дно сосуда. Обратите внимание на время, когда кровотечение полностью прекращается.
   4. Подождите, пока не произойдет образование тромба (рисунок 2A), прежде чем начинать перфузионную фиксацию (т.е. 1, 5, 10 или 20 минут для получения различных стадий развития тромба). Усыпьте животное путем обескровливания или следуйте местным рекомендациям по эвтаназии.
5. Проведение транскардиальной перфузионной фиксации
   1. Настройте перистальтическую помпу перед началом операции. Поместите две конические пробирки объемом 50 мл в штатив для пробирок. Заполните одну пробирку 4% раствором фиксатора параформальдегида, приготовленным в буферном растворе какодилата натрия (0,2 М какодилата натрия, 0,15 М хлорида натрия при pH 7,4) для исследования яремной пункции, а другую пробирку заполните буферным раствором какодилата натрия.
      Примечание: Описанные здесь условия достаточны для случая низкого давления в яремной кости и затем модифицируются для случая более высокого давления в артерии. При исследовании системы высокого давления с артериями, т.е. бедренной артерией, параформальдегидный фиксатор дополняют 0,1% глутаральдегида, а наружную капельную фиксацию сочетают с перфузионной фиксацией.
   2. Поместите всасывающий конец трубки насоса в трубку, содержащую буферный раствор. Прикрепите иглу-бабочку 27G с соответствующей трубкой к выходному концу трубки насоса и поместите иглу в чистую мензурку.
   3. Установите перистальтический насос на расход 10 мл/мин. Включите перфузионный насос.
   4. Когда буферный раствор начнет вытекать из иглы в стакан, выключите насос. Теперь трубка и игла подготовлены для транскардиальной перфузии.
   5. Обнажите грудную полость, сделав разрез по средней линии кожи от верхней части грудины до нескольких миллиметров за нижней частью грудины с помощью рассекающих ножниц и тупых щипцов. Сделайте поперечные надрезы вдоль основания грудной клетки, начиная от средней линии и разрезая от медиальной к боковой с каждой стороны.
   6. Непосредственно перед началом транскардиальной перфузии быстро разрежьте грудную клетку и отразите каждую сторону, чтобы обнажить сердце.
   7. Включите перистальтическую помпу. Поместите кончик иглы-бабочки 27G в основание левого желудочка.
   8. Надежно удерживая иглу в левом желудочке, вырежьте разрез в правой ушной раковине с помощью острых ножниц, чтобы кровь и перфузионная жидкость вытекли. Обратите внимание на время на таймере.
   9. Перфузируйте буферным раствором в течение 3 мин для вымывания крови из кровеносной системы. Все еще удерживая иглу в левом желудочке, выключите перистальтический насос и переместите всасывающий конец трубки перистальтического насоса к трубке объемом 50 мл, содержащей фиксирующий раствор.
   10. Обратите внимание на время на таймере. Снова включите перистальтический насос и перфузируйте фиксирующим раствором в течение 7 минут. Выключите перистальтический насос.
   11. Извлеките иглу из левого желудочка и поместите ее в стакан для отходов. Поместите всасывающий конец трубки насоса в стакан с дистиллированной водой.
   12. Включите перистальтический насос и дайте примерно 20 мл воды протекать через трубку и выйти из иглы 27G в стакан для отходов для очистки трубки. Перед выключением насоса убедитесь, что вся вода вышла из трубки и иглы.

2. Забор образцов для электронной микроскопии

1. После перфузионной фиксации, дополненной начальным наружным фиксатором в течение 2 мин в случае прокола бедренной артерии, осторожно рассекают участок яремной вены/бедренной артерии, содержащий место пункции и тромб (рис. 2А). Острыми ножницами сделайте диагональный разрез поперек дистального конца сегмента сосуда и сделайте прямой разрез поперек проксимального конца сегмента сосуда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение надрезов таким образом помогает впоследствии сориентировать сосуд и определить направление кровотока в сосуде.
2. Погрузите сегмент сосуда в свежий 4% параформальдегид комнатной температуры в буферный раствор какодилата натрия (0,2 М какодилат натрия, 0,15 М хлорид натрия при pH 7,4) и поместите при комнатной температуре на 1 ч.
3. Перенесите неподвижную ткань при температуре 4 °C на 24 часа. На следующий день возьмите чашку для культивирования 35 мм, содержащую силиконовый коврик толщиной ~5 мм (приготовленный заранее в соответствии с инструкциями производителя). Налейте в чашку достаточное количество буферного раствора какодилата натрия, чтобы погрузить неподвижный сегмент вены.
4. При просмотре под световым микроскопом (~15-кратное увеличение) осторожно перенесите ткань в чашку диаметром 35 мм, содержащую буферный раствор, и прикрепите каждый конец сосуда к силиконовому коврику с помощью мелких булавок из нержавеющей стали и тонких щипцов.
5. Осторожно очистите сегмент яремной вены/бедренной артерии с помощью микроножниц и очень тонких щипцов.
   1. Только для яремной вены: Удалите один из штифтов и с помощью микроножниц разрежьте стенку сосуда напротив места прокола/тромба вдоль. Аккуратно откройте сосуд и, используя от 4 до 5 булавок (каждый из которых разрезается пополам кусачками), приколите его к силиконовому коврику внутрипросветной стороной вверх.
6. Отсадите буферный раствор, быстро замените его 1% раствором параформальдегида в буферном растворе какодилата натрия и накройте посуду крышкой. Ни в коем случае не допускайте пересыхания ткани. Всегда держите его погруженным в жидкость.
7. Храните ткань при температуре 4 °C до тех пор, пока не придет время обрабатывать ее для электронной микроскопии (рис. 2B). Обработайте некоторые образцы проколотой раны яремной вены/бедренной артерии для визуализации с помощью SBF-SEM⁴, а другие для визуализации с помощью WA-TEM ^8,9. Шаги WA-TEM подробно описаны ниже.
   ВНИМАНИЕ: Выполняйте все работы с формальдегидом, оксидом пропилена, OsO₄ и 2,4,6-трис(диметиламинометил)фенолом (DMP-30) в химическом вытяжном шкафу. Это опасные химические вещества. Воздействие OsO₄ может привести к слепоте и смерти.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы полоскания и пятен как минимум в 2 раза превышают объем образца. 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) может быть заменен 0,1 М буфером какодилата натрия. Во время процедуры фиксации очень важно не допускать пересыхания образцов, так как это существенно повлияет на ультраструктуру. Используйте полипропиленовые трубки.

3. Подготовка образца для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии (WA-TEM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой момент принятия решения, в котором исследователь обязуется подготовиться к WA-TEM. Эта препаративная процедура не поддерживает SBF-SEM. Для SBF-SEM volume EM все окрашивания должны быть выполнены перед заделкой в пластик. Протокол подготовки SBF-SEM см.^{в пункте 4} .

1. Промойте образец ткани в чашке диаметром 35 мм 2 раза сбалансированным раствором соли Хэнка (HBSS) или PBS при комнатной температуре (RT). Держите образец закрепленным, чтобы можно было отслеживать его ориентацию с помощью этих подготовительных этапов.
2. Зафиксируйте 0,8 мл 0,05% малахитового зеленого / 2,5% глутаральдегида / 0,1 М какодилата натрия (pH 6,7 - 7,0) на 20 минут на льду.
3. Снимите фиксатор и промойте образец 4 раза в течение 5 мин каждый с 0,1 М какодилата натрия. Удалите 0,1 М какодилата натрия.
4. Постфикс с 0,8 мл 0,8% K₃Fe(CN)₆ или K₄Fe(CN)₆ / 1,0% OsO₄ K₃Fe(CN)₆ в 0,1 М какодилата натрия. Накройте тарелку крышкой, чтобы свет не попадал внутрь (OsO₄ светочувствительна). Окрашивать от 20 минут до 1 часа в режиме RT.
5. Удалите OsO₄ и промойте 4 раза в течение 5 минут каждый 0,1 М буфером какодилата натрия. Удалить буфер какодилата натрия и нанести на лед 1% дубильную кислоту на 20 минут.
6. Удалите дубильную кислоту и мойте в течение 5 минут с 0,1 М буфером какодилата натрия 1x и 2x по 5 минут каждый с молекулярной дистиллированной (DI) водой.
7. Окрашивать 0,5% уранилацетатом (UA) в течение 1 ч RT или на ночь при температуре 4 °C в темноте.
8. Удалите уранилацетат и промойте 5 раз в течение 5 минут каждый молекулярной дистиллированной водой. Перед последней промывкой и пока образец еще погружен в деионизионную воду, разрежьте силиконовый коврик вокруг прикрепленного образца лезвием бритвы. Извлеките этот небольшой кусочек силиконового коврика из пластины и поместите его в полипропиленовую трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы образец оставался прикрепленным к силиконовой части, пока она находится в пробирке. Переход на полипропиленовые трубки на этом этапе необходим, потому что оксид пропилена, используемый на последующих этапах, будет разрушать полистирол пластин диаметром 35 мм.
9. После удаления последнего буфера кратко промойте 1x 25% этанолом. Выбросьте 25% этанол и инкубируйте с 25% этанолом в течение 3 минут на льду.
10. Удалите 25% этанол. Кратко смойте 1x 50% этанолом. Выбросьте 50% этанол и инкубируйте с 50% этанолом в течение 3 минут на льду.
11. Удалите 50% этанол и кратко промойте 1 раз 75% этанолом. Выбросьте 75% этанол и инкубируйте с 75% этанолом в течение 3 минут на льду.
12. Удалите 75% этанол и кратко промойте 1x 95% этанолом. Выбросьте 95% этанол и инкубируйте с 95% этанолом в течение 3 минут на льду.
13. Удалите 95% этанол и промойте 3 раза, не менее 10 минут каждый раз, 100% этанолом (200 proof). Удалите 100% этанол и добавьте оксид пропилена (PO). Смойте 3 раза не менее 10 минут каждый, с пероральным приемом.
14. Приготовьте смоляную смесь, как описано ниже.
    1. Нагрейте компоненты смолы до 60 °C для полного разжижения. Тщательно перемешайте 12,5 мл Embed-218, 7,5 мл Araldite 502 и 27,5 мл DDSA в пробирке объемом 50 мл при температуре 60 °C. Эту смесь можно хранить в течение 6 месяцев при температуре 4 °C. Перед использованием нагрейте его до 60 °C. Перед использованием наберите необходимое количество.
15. Внедрите примеры, как описано ниже.
    1. Поместите аликвоту смоляной смеси в пробирку и добавьте 20 мкл/мл активатора DMP-30. Тщательно перемешать, вращая при температуре 60 °C; Цвет должен потемнеть.
    2. Разбавьте эту аликвоту активированной смолы на 50% в пероральном креме и дайте смоле и ПО полностью смешаться.
    3. Удалите последний ополаскиватель PO из пробирки, содержащей образец, и замените его смесью 50% смолы и PO, почти полностью заполнив пробирку. Поверните образец на ночь при комнатной температуре.
    4. На следующий день смешайте новую аликвоту смолы (1 мл на образец) с 20 мкл/мл DMP-30.
16. Поместите образец в полипропиленовую чашку с небольшим объемом 50% смеси смолы и PO из пробирки для образца под препарирующим микроскопом (~6-кратное увеличение) и осторожно выньте штифты из ткани. Перенесите только ткань в другую полипропиленовую чашку, содержащую небольшое количество 100% смолы с активатором DMP-30.
17. Заполните силиконовую форму для встраивания 100% смолой с помощью активатора DMP-30 и осторожно поместите образец в форму. Поместите форму в духовку и выпекайте при температуре 60 °C не менее 48 часов. Подготовленный образец представлен на рисунке 2В.
18. Выполните монтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию (WA-TEM), как описано в^{пунктах 10,11}. На рисунке 3 показан процесс, идущий от начального прокола до трехмерного тромба за 1 минуту. Включение подробного протокола для монтажной электронной микроскопии WA-TEM здесь не включено и выходит за рамки настоящих протоколов по пробоподготовке.
    Примечание: WA-TEM является недооцененной способностью большинства современных просвечивающих электронных микроскопов с компьютеризированным столиком. Условно-бесплатное программное обеспечение, поддерживающее эти функции^10,11, доступно в группе доктора Дэвида Мастронарда, Университет Колорадо, Боулдер (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Результаты

Количественная оценка влияния препарата на время кровотечения из колотой раны
Время кровотечения из колотой раны обеспечивает физиологическую модель риска приема лекарственного препарата, которая может быть легко проведена на мышах. Результаты, получен?...

Обсуждение

Подробно описана методика производства гемостатических тромбов в яремных венах и бедренных артериях, их перфузионной фиксации in situ , а также обработки образцов для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии. Общие процедуры полезны для гене...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000