Гемостаз пункционной раны и подготовка образцов для анализа методом широкоугольной электронной микроскопии

Резюме

Здесь представлена процедура колотой раны при образовании гемостатического тромба. Образующиеся тромбы имеют большие размеры и достигают сотен микрон в диаметре. Следовательно, подходят подходы к объемной визуализации. Мы предлагаем смонтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию в качестве подхода с высоким разрешением, доступного многим, и детализируемого препаративного протокола.

Аннотация

Гемостаз, процесс нормального физиологического контроля повреждения сосудов, имеет основополагающее значение для жизни человека. Все мы время от времени получаем небольшие порезы и колотые раны. При гемостазе самоограничивающаяся агрегация тромбоцитов приводит к образованию структурированного тромба, при котором остановка кровотечения происходит за счет закрытия отверстия снаружи. Детальная характеристика этой структуры может привести к различиям между гемостазом и тромбозом, случаем чрезмерной агрегации тромбоцитов, приводящей к окклюзионному свертыванию. Здесь представлен подход к структуре тромба колотой раны, основанный на визуализации, который основан на способности тонкой электронной микроскопии визуализировать внутреннюю часть гемостатического тромба. Самым основным шагом в любом экспериментальном протоколе, основанном на визуализации, является хорошая подготовка образцов. В протоколе подробно описаны процедуры подготовки колотых ран и тромбов, обогащенных тромбоцитами, у мышей к последующей электронной микроскопии. Подробно описана методика фиксации in situ образовавшегося тромба пункционной раны и его последующей обработки для окрашивания и встраивания в электронную микроскопию. Электронная микроскопия представлена в качестве метода конечной визуализации из-за ее способности в сочетании с последовательным срезом визуализировать детали внутренней части тромба с высоким разрешением. Как метод визуализации, электронная микроскопия дает несмещенную выборку и экспериментальный результат, который масштабируется от нанометра до миллиметра в 2 или 3 измерениях. Упоминается соответствующее бесплатное программное обеспечение для электронной микроскопии, которое будет поддерживать широкозонную электронную микроскопию, в которой сотни кадров могут быть объединены для получения нанометровой визуализации целых поперечных сечений тромбов проколотой раны. Следовательно, любая подобласть файла изображения может быть легко помещена в контекст полного поперечного сечения.

Введение

Образование тромба колотой раны, приводящего к остановке кровотечения, является одним из самых важных событий в жизни¹. Тем не менее, несмотря на эту важность, знание того, что происходит структурно во время формирования тромба, будь то в вене, артерии, атеросклеротическом событии или окклюзионном сгустке, было ограничено разрешением и глубиной визуализации. Традиционная световая микроскопия ограничена по глубине по сравнению с полностью сформированным тромбом колокольной раны, от 200 до 300 мкм в^Z1, и по уровню разрешения по сравнению с размером тромбоцитарных органелл и расстоянием меж....

протокол

Эксперименты были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете медицинских наук Арканзаса. Здесь были использованы самцы и самки C57BL/6 дикого типа в возрасте от 8 до 12 недель. Эти мыши являются молодыми взрослыми особями с небольшим накоплением жира. Те же процедуры применимы к мышам-мутантам в отношении различных белков, важных для гемостаза, таких как фактор фон Виллебранда или тромбоцитарный гликопротеин VI (GPVI)^5,6. Все используемое оборудование, хирургические инструменты, реагенты и другие материа....

Результаты

Количественная оценка влияния препарата на время кровотечения из колотой раны
Время кровотечения из колотой раны обеспечивает физиологическую модель риска приема лекарственного препарата, которая может быть легко проведена на мышах. Результаты, получен?.......

Обсуждение

Подробно описана методика производства гемостатических тромбов в яремных венах и бедренных артериях, их перфузионной фиксации in situ , а также обработки образцов для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии. Общие процедуры полезны для гене.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000