Delinme Yara Hemostazı ve Montajlı Geniş Alan Elektron Mikroskobu Analizi için Örneklerin Hazırlanması

Özet

Burada hemostatik trombüs oluşumu için bir ponksiyon yarası prosedürü sunulmaktadır. Oluşan trombüsler büyüktür ve yüzlerce mikron çapındadır. Bu nedenle, hacim görüntüleme yaklaşımları uygundur. Geniş alanlı transmisyon elektron mikroskobunun birçok kişi için mevcut olan yüksek çözünürlüklü bir yaklaşım olarak monte edilmesini ve hazırlık protokolünü detaylandırmasını öneriyoruz.

Özet

Vasküler hasarın normal fizyolojik kontrol süreci olan hemostaz, insan yaşamı için temeldir. Hepimiz zaman zaman küçük kesikler ve delinme yaraları alırız. Hemostazda, kendi kendini sınırlayan trombosit agregasyonu, kanamanın durmasının deliğin dışarıdan kapatılmasından kaynaklandığı yapılandırılmış bir trombüs oluşumuna yol açar. Bu yapının ayrıntılı karakterizasyonu, tıkayıcı pıhtılaşmaya yol açan aşırı trombosit agregasyonu vakası olan hemostaz ve tromboz arasında ayrımlara yol açabilir. Burada, ince kesitli elektron mikroskobunun hemostatik trombüsün içini görselleştirme yeteneğinden yararlanan, ponksiyon yaralı trombüs yapısına yönelik görüntülemeye dayalı bir yaklaşım sunulmaktadır. Herhangi bir görüntülemeye dayalı deney protokolündeki en temel adım, iyi bir numune hazırlamadır. Protokol, sonraki elektron mikroskobu için farelerde delinme yaraları ve trombositten zengin trombüslerin hazırlanması için ayrıntılı prosedürler sağlar. Oluşan delinme yara trombüsünün yerinde fiksasyonu ve daha sonra elektron mikroskobu için boyama ve gömme için işlenmesi için ayrıntılı bir prosedür verilmiştir. Elektron mikroskobu, ardışık kesitleme ile birleştirildiğinde, trombüs iç kısmının ayrıntılarını yüksek çözünürlükte görselleştirme yeteneği nedeniyle son görüntüleme tekniği olarak sunulmaktadır. Bir görüntüleme yöntemi olarak elektron mikroskobu, tarafsız örnekleme ve 2 veya 3 boyutta nanometreden milimetreye kadar ölçeklenen deneysel bir çıktı verir. Tüm delinme yara trombüsü kesitlerinin nanometre ölçeğinde görüntülemesini sağlamak için yüzlerce çerçevenin harmanlanabileceği geniş alanlı elektron mikroskobunu destekleyecek uygun ücretsiz elektron mikroskobu yazılımından bahsedilmektedir. Bu nedenle, görüntü dosyasının herhangi bir alt bölgesi, tam kesit bağlamına kolayca yerleştirilebilir.

Giriş

Kanamanın durmasına yol açan bir delinme yarası trombüsünün oluşumu hayattaki en önemli olaylardan biridir¹. Ancak bu gerekliliğe rağmen, trombüs oluşumu sırasında yapısal olarak ne olduğu, bir damarda, bir arterde, bir aterosklerotik olayda veya tıkayıcı bir pıhtı olsun, bilgi çözünürlük ve görüntüleme derinliği ile sınırlıdır. Konvansiyonel ışık mikroskobu, Z^1'de 200 ila 300 μm olmak üzere tam formda bir ponksiyon yara trombüsü ile karşılaştırıldığında derinlik açısından ve trombosit organellerinin boyutu ve aralıkları ile karşılaştırıldığında, genellikle 30 nm2'den daha az çözünürlük seviyesinde sınırlıdır. İki fotonlu ışık mikroskobu, gerekli görüntüleme derinliğini sağlayabilir ancak çözünürlüğü önemli ölçüde iyileştirmez. Işık mikroskobundaki en son gelişmeler, örneğin, süper çözünürlük teknikleri, pratikte XY'de ~ 20 nm ve Z'de bunun iki katı ve derinlik sınırlı, geleneksel ışık mikroskobundan daha fazla olmayan çözünürlük sınırlıdır. Ayrıca, süper çözünürlüklü ışık mikroskobu, araştırma ışık mikroskobunun çoğu gibi, iyi antikorların veya iyi etiketlenmiş yapıların bulunduğu küçük bir aday protein setine doğal olarak önyargılı bir teknik olan floresan mikroskobuna dayanmaktadır³. Sonuç olarak, konvansiyonel taramalı elektron mikroskobu, en fazla, trombositten zengin trombüsün yüzeyini görselleştirebilir.

Trombüs yapısını karakterize etmedeki bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için üç hedefimiz vardı. İlk olarak, bir fare damarında veya arterinde tekrarlanabilir bir şekilde tanımlanmış bir delinme yarası üretilir ve bu daha sonra kimyasal fiksasyon ile yerinde kolayca stabilize edilebilir. İkinci olarak, membran korumasını vurgulayan bir hazırlık prosedürü uygulayın, bu hedef oluşturan trombüs içindeki tek tek trombositlerin konumunu tanımlama hedefiyle tutarlı bir hedeftir. Üçüncüsü, tek bir görüntüde nanometre ile milimetre ölçeği arasında ölçeklendirilebilen tarafsız bir görselleştirme tekniği kullanın.

Montajlı, geniş alanlı elektron mikroskobu, tek bir önemli nedenden dolayı ana uç görselleştirme tekniği olarak seçildi: elektron mikroskobu görüntülemede, bir hücrenin organellerini ve organellerin içindeki özelliklerini özetleyen çok çeşitli özellikler görülür. Ribozomlar gibi küçük nesneler tanınabilir. Bu özellik yelpazesi, elektron mikroskobunun kontrast elde etmesi için kullanılan elektron yoğun ağır metal lekeleri, uranil, kurşun ve osmiyumun çok çeşitli moleküllere bağlanması nedeniyle görülür. Bir elektron mikroskobu görüntüsünde, orada olanın çoğu görülürken, immünofloresan ve protein etiketleme yaklaşımlarında sadece yanan şey görülür. Bu, örneğin, belirli bir bireysel protein türünde bulunan antijen bölgeleri anlamına gelir. Etiketli bir molekül, genellikle bir protein söz konusu olduğunda, bu proteinin bulunduğu bölge(ler)dir. Diğer tüm moleküller karanlıktır ve aydınlatılmaz. Ancak, bu elektron mikroskobu seçimi pratik midir? Delinme yaralı trombüsün boyutu 300 x 500 μm'dir ve 3 nm piksel boyutunda, yani 100.000 x 167.000 piksellik bir görüntüdür. Yüksek kaliteli bir elektron mikroskobu kamerası 4000 x 4000 piksele sahiptir. Bu, tek bir görüntü elde etmek için yaklaşık 1000 karenin dikilmesi/karıştırılması gerektiği anlamına gelir. Bu, son 15 yılda üretilen çoğu elektron mikroskobunda mevcut olan bir olasılıktır. Mikroskop aşaması bilgisayarlıdır ve görüntüler bir bilgisayarla birleştirilebilir. Sunulan protokolün formülasyonunun altında yatan seçimlere yol açan mantık budur.

Sonuç olarak, farelerin damarında veya arterinde tekrarlanabilir bir yara veren ve daha sonra yerinde fiksasyon adımlarını ve daha sonra gömme adımlarını takip eden, nm ölçeğinde montajlı, geniş alanlı transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirilebilen bir dizi adımı sunuyoruz ve gerçek in situ ölçeği olan mm'ye yakın ölçekte görselleştirilen dikişli görüntüde sabit trombüs. Bu tür bir ölçeklenebilirlik, trombüs oluşumunu hem hematoloji/sağlıkta bir sorun olarak hem de trombositlerin ana hücre tipi olduğu gelişimsel bir biyoloji sistemi olarak anlamak için gereklidir. Bu ilerlemeler, elektron mikroskobunun önemli bir erdemini sağlar, yani kişi sadece yanan şeyi değil, orada olanı görür. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) için numunelerin hazırlanmasına ilişkin ayrıntılı bir protokol için, okuyucu Joshi ve ^ark.4'ün yakın tarihli bir makalesine yönlendirilir.

Protokol

Deneyler, Arkansas Tıp Bilimleri Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Burada 8-12 haftalık, vahşi tip erkek ve dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Bu fareler, çok az yağ birikimi olan genç yetişkinlerdir. Aynı prosedürler, von Willebrand faktörü veya trombosit glikoprotein VI (GPVI) gibi hemostaz için önemli olan çeşitli proteinler için fare mutantları için de ^{geçerlidir5,6}. Kullanılan tüm ekipman, cerrahi aletler, reaktifler ve diğer malzemeler Şekil 1'de gösterilmiş ve Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Juguler ven/femoral arter ponksiyon yarası ^1,7

1. Farenin uyuşturulması
   1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran buharlaştırıcıyı yüksek akış hızı ayarına getirin (500 mL/dak, %3 izofluran). İzofluran, kan damarı çapı üzerinde çok az etkisi olduğu için seçilmiştir.
      DİKKAT: İzoflurana uzun süreli maruz kalma, olumsuz sağlık etkilerine neden olabilir. Düşük akışlı bir buharlaştırıcı, anestezi gazı yakalama kutuları ve iyi oda havalandırmasının kullanılması, maruziyeti büyük ölçüde azaltabilir.
   2. Fare uyku modunda göründüğünde, farenin tepki verip vermediğini görmek için farenin ayak parmaklarından birini sıkıştırın. Öyleyse, fareyi birkaç dakika indüksiyon odasına geri yerleştirin ve ardından kıstırma testini yeniden deneyin. Fare tepki vermezse, ısıtma plakasının (daha önce alüminyum folyo ile kaplanmış) üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
   3. Buharlaştırıcıyı düşük bir akış hızına (100 mL/dak, %1,75 izofluran) düşürün. Farenin burnunu burun konisine yerleştirin. Her uzvu uzatın ve küçük yapışkan bant parçalarıyla bantlayın.
   4. Rektal sıcaklık probunu takın ve sıcaklık kontrol cihazında sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın. Probun yanlışlıkla dışarı çekilmesini önlemek için sıcaklık probu kablosunu bantlayın.
2. Fare insizyonu
   1. Makası kullanarak farenin boynunu ve göğsünü (şah damarı için) veya sağ iç bacağını (femoral arter için) tıraş edin. Kürk kırpıntılarını alkollü bir bezle silin. Gerekirse, kalan tüyleri çıkarmak için makasla alanın üzerinden tekrar geçin.
   2. Tüm kırpıntıları temizlemek için alanı taze bir alkollü ped ile tekrar silin. Alanın mümkün olduğunca temiz olması çok önemlidir. Anestezi cerrahi düzlemini bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın.
   3. Makas ve künt forseps kullanarak, cildi sağ juguler ven üzerinden kaldırın ve kesin. Deride, şah damarını ve çevresindeki dokuların bir kısmını açığa çıkaracak kadar büyük yuvarlak bir pencere açın.
3. Juguler venin temizlenmesi (aynı prensipler femoral arter için de geçerlidir)
   1. Künt diseksiyon tekniğini kullanarak, yağ ve lenf düğümlerinin yanı sıra bağ dokusunu nazikçe bir kenara itin.
      NOT: Geminin etrafındaki bazı genel temizlik bu adımda gerçekleşir; Bununla birlikte, şah damarı 24 saat boyunca paraformaldehit içinde sabitlendikten sonra mikroskop altında dikkatli ve kapsamlı bir temizlik yapılacaktır.
   2. 20 mL'lik bir şırıngayı 37 °C'ye ısıtılmış normal tuzlu su ile doldurun. Şırıngayı şırınga infüzyon pompasına yükleyin. 27G kelebek iğneyi ve ilgili boruyu şırıngaya takın.
   3. Şırınga pompasını 0,5 mL/dk akış hızına ayarlayın. Nazik tuzlu su akışı, delinmiş damar / arterdeki kanı yıkayacaktır. Salin akışını, doğrudan üzerine değil, delinme bölgesinin yanına birkaç mm yerleştirin.
4. Juguler ven/femoral arterin delinmesi
   1. Zamanlayıcıyı başlatın. Juguler ven için 30G hipodermik iğne (nominal 300 μm çap) ve femoral arter için 33G hipodermik iğne (200 μm çap) alın. Daha küçük bir iğnenin kullanılması, daha yüksek basınçlı arteriyel durum için sadece biraz daha uzun kanama süresi sağlar.
   2. Eğimi yukarı bakacak şekilde çevirin. İğneyi juguler ven/femoral arter üzerine 25°'lik bir açıyla yerleştirin. Saate dikkat edin.
   3. Kabı hızlı bir şekilde delin, sadece kabın üst kısmını deldiğinizden emin olun. Geminin altını da delmemeye dikkat edin. Kanamanın tamamen durduğu zamana dikkat edin.
   4. Perfüzyon fiksasyonuna başlamadan önce trombüs oluşumu elde etmek için uygun süreyi bekleyin (Şekil 2A) (ör., trombüs gelişiminin farklı aşamalarını elde etmek için 1, 5, 10 veya 20 dakika). Hayvanı kan kaybederek ötenazi yapın veya ötenazi için yerel kurumsal yönergeleri izleyin.
5. Transkardiyal perfüzyon fiksasyonu yapılması
   1. Ameliyat başlamadan önce peristaltik pompayı kurun. İki adet 50 mL'lik konik tüpü bir test tüpü rafına yerleştirin. Juguler ponksiyon çalışmaları için bir tüpü sodyum kakodilat tampon çözeltisinde (0.2 M sodyum kakodilat, pH 7.4'te 0.15 M sodyum klorür) hazırlanan% 4 paraformaldehit fiksatif solüsyon ile doldurun ve diğer tüpü sodyum kakodilat tampon çözeltisi ile doldurun.
      NOT: Burada ayrıntıları verilen koşullar, juguler düşük basınç durumu için yeterlidir ve daha sonra bir arterin daha yüksek basınç durumu için modifiye edilmiştir. Arterler, yani femoral arter ile daha yüksek basınçlı sistem çalışmaları için, paraformaldehit fiksatif% 0.1 glutaraldehit ile desteklenir ve harici damla fiksasyonu perfüzyon fiksasyonu ile birleştirilir.
   2. Pompa hortumunun giriş ucunu tampon çözeltisini içeren tüpe yerleştirin. Pompa hortumunun çıkış ucuna ilgili hortumla birlikte 27G'lik bir kelebek iğne takın ve iğneyi temiz bir behere yerleştirin.
   3. Peristaltik pompayı 10 mL/dk akış hızına ayarlayın. Perfüzyon pompasını açın.
   4. Tampon çözeltisi iğneden behere akmaya başladığında, pompayı kapatın. Boru ve iğne şimdi transkardiyal perfüzyon için hazırlanmıştır.
   5. Diseksiyon makası ve künt forseps kullanarak sternumun tepesinden sternumun altından birkaç milimetre sonrasına kadar deride orta hat kesimi yaparak göğüs boşluğunu ortaya çıkarın. Göğüs kafesinin tabanı boyunca, orta hattan başlayarak ve her iki tarafta medialden laterale doğru keserek enine kesiler yapın.
   6. Transkardiyal perfüzyona başlamadan hemen önce, göğüs kafesini hızlı bir şekilde kesin ve kalbi açığa çıkarmak için her iki tarafı yansıtın.
   7. Peristaltik pompayı açın. 27G kelebek iğnenin ucunu sol ventrikülün tabanına yerleştirin.
   8. İğneyi sol ventrikülde güvenli tutarken, kan ve perfüzyon sıvısının dışarı akmasına izin vermek için keskin diseksiyon makası kullanarak sağ kulak kepçesinde bir yarık açın. Zamanlayıcıdaki saati not edin.
   9. Kanı dolaşım sisteminden atmak için 3 dakika boyunca tampon solüsyonu ile perfüz. İğneyi hala sol ventrikülde güvenli tutarken, peristaltik pompayı kapatın ve peristaltik pompa hortumunun alım ucunu fiksatif solüsyonu içeren 50 mL'lik tüpe getirin.
   10. Zamanlayıcıdaki saati not edin. Peristaltik pompayı tekrar açın ve 7 dakika boyunca fiksatif solüsyon ile perfüze edin. Peristaltik pompayı kapatın.
   11. İğneyi sol ventrikülden çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin. Pompa borusunun giriş ucunu bir damıtılmış su kabına yerleştirin.
   12. Peristaltik pompayı açın ve boruyu temizlemek için borudan yaklaşık 20 mL su akmasına ve 27G iğneyi atık kabına çıkarmasına izin verin. Pompayı kapatmadan önce tüm suyun borudan ve iğneden çıkmasına izin verdiğinizden emin olun.

2. Elektron mikroskobu için numunelerin toplanması

1. Femoral arter ponksiyon yaraları durumunda ilk 2 dakikalık eksternal fiksatif ile desteklenen perfüzyon fiksasyonundan sonra, ponksiyon bölgesini ve trombüsü içeren juguler ven / femoral arter kısmını dikkatlice inceleyin (Şekil 2A). Keskin bir makasla, damar segmentinin distal ucu boyunca çapraz bir kesim yapın ve damar segmentinin proksimal ucu boyunca düz bir kesim yapın.
   NOT: Bu şekilde kesikler yapmak, damarın daha sonra yönlendirilmesine ve damardaki kan akışının yönünün belirlenmesine yardımcı olur.
2. Kap segmentini taze, oda sıcaklığında,% 4 paraformaldehiti sodyum kakodilat tampon çözeltisine (0.2 M sodyum kakodilat, pH 7.4'te 0.15 M sodyum klorür) daldırın ve 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
3. Sabit dokuyu 24 saat boyunca 4 ° C'ye aktarın. Ertesi gün, ~5 mm kalınlığında silikon mat içeren 35 mm'lik bir kültür kabı alın (üreticinin talimatlarına göre önceden hazırlanmış). Sabit damar segmentini daldırmak için tabağa yeterince sodyum kakodilat tampon çözeltisi dökün.
4. Işık mikroskobu altında (~ 15x büyütme) görüntülerken, dokuyu dikkatlice tampon solüsyonu içeren 35 mm'lik tabağa aktarın ve kabın her iki ucunu paslanmaz çelik minutien pimler ve ince forseps kullanarak silikon mata sabitleyin.
5. Juguler ven/femoral arter segmentini bir çift mikro makas ve çok ince forseps kullanarak dikkatlice temizleyin.
   1. Sadece juguler ven için: Pimlerden birini çıkarın ve mikro makası kullanarak damar duvarını ponksiyon/trombüs bölgesinin karşısına uzunlamasına kesin. Kabı yavaşça açın ve 4 ila 5 pim kullanarak (her biri tel kesicilerle ikiye bölünmüş), intraluminal tarafı yukarı bakacak şekilde silikon matın üzerine sabitleyin.
6. Tampon çözeltisini aspire edin, hızlı bir şekilde sodyum kakodilat tampon çözeltisinde% 1 paraformaldehit çözeltisi ile değiştirin ve kapağı tabağın üzerine yerleştirin. Dokunun hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. Her zaman sıvıya batırılmış halde tutun.
7. Dokuyu elektron mikroskobu için işleme zamanı gelene kadar 4 ° C'de saklayın (Şekil 2B). Juguler ven / femoral arter ponksiyon yara örneklerinin bir kısmını SBF-SEM⁴ ile görüntüleme için ve diğerlerini WA-TEM ^8,9 ile görüntüleme için işleyin. WA-TEM adımları aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
   DİKKAT: Formaldehit, propilen oksit, OsO₄ ve 2,4,6-Tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) içeren tüm işleri kimyasal çeker ocakta gerçekleştirin. Bunlar tehlikeli kimyasallardır. OsO_4'e maruz kalmak körlüğe ve ölüme neden olabilir.
   NOT: Tüm durulama ve leke hacimleri, numunenin hacminin en az 2 katıdır. 1x fosfat tamponlu salin (PBS), 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile ikame edilebilir. Sabitleme prosedürü sırasında, numunelerin kurumasına asla izin vermemek çok önemlidir, çünkü bu, ultra yapıyı önemli ölçüde etkileyecektir. Polipropilen tüpler kullanın.

3. Montajlı geniş alanlı transmisyon elektron mikroskobu (WA-TEM) için numunenin hazırlanması

NOT: Bu adım, araştırmacının WA-TEM'e hazırlanmayı taahhüt ettiği bir karar noktasını temsil eder. Bu hazırlık prosedürü SBF-SEM'i desteklemez. SBF-SEM hacim EM için, tüm boyama plastiğe gömülmeden önce yapılmalıdır. SBF-SEM hazırlık protokolü için lütfen^4'e bakınız.

1. Doku örneğini 35 mm'lik tabakta 2x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya oda sıcaklığında (RT) PBS ile yıkayın. Numuneyi sabit tutun ve bu hazırlık adımları aracılığıyla numunenin yönünü izlemeye izin verin.
2. Buz üzerinde 20 dakika boyunca 0,8 mL %0,05 malakit yeşili / %2,5 glutaraldehit/ 0,1 M sodyum kakodilat (pH 6,7 - 7,0) ile sabitleyin.
3. Sabitleyiciyi çıkarın ve numuneyi 4 kez 5 dakika boyunca 0.1 M sodyum kakodilat ile yıkayın. 0.1 M sodyum kakodilatı çıkarın.
4. 0.8 mL% 0.8 K₃Fe (CN) ₆ veya K₄Fe (CN)₆ /% 1.0 OsO₄ K₃Fe (CN) ₆ ile 0.1 M sodyum kakodilat içinde sonek. Işığı dışarıda tutmak için tabağın üzerine bir kapak yerleştirin (OsO₄ ışığa duyarlıdır). RT'de 20 dakika ila 1 saat boyayın.
5. OsO_4'ü çıkarın ve 4x'i her biri 0,1 M sodyum kakodilat tamponu ile 5 dakika durulayın. Sodyum kakodilat tamponunu çıkarın ve buz üzerinde 20 dakika boyunca %1 tanik asit ile boyayın.
6. Tanik asidi çıkarın ve 0.1 M sodyum kakodilat tamponu 1x ve 2x ile 5 dakika boyunca moleküler dereceli damıtılmış (DI) su ile 5 dakika yıkayın.
7. % 0,5 uranil asetat (UA) ile 1 saat RT veya gece boyunca karanlıkta 4 ° C'de boyayın.
8. Uranil asetatı çıkarın ve her biri moleküler dereceli damıtılmış su ile 5 dakika boyunca 5 kez durulayın. Son yıkamadan önce ve numune hala DI suya batırılmış durumdayken, sabitlenmiş numunenin etrafındaki silikon matı bir tıraş bıçağıyla kesin. Bu küçük silikon mat parçasını plakadan kaldırın ve bir polipropilen tüpe yerleştirin.
   NOT: Numunenin tüp içindeyken silikon parçasına sabitlenmiş kalması önemlidir. Bu adımda polipropilen tüplere geçmek gereklidir, çünkü sonraki adımlarda kullanılan propilen oksit 35 mm'lik plakaların polistirenini bozacaktır.
9. Son tamponu çıkardıktan sonra, 1x'i% 25 etanol ile kısaca durulayın. %25 etanolü atın ve %25 etanol ile buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
10. % 25 etanolü çıkarın. 1x'i %50 etanol ile kısaca durulayın. %50 etanolü atın ve %50 etanol ile buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
11. %50 etanolü çıkarın ve 1x'i %75 etanol ile kısaca durulayın. %75 etanolü atın ve %75 etanol ile buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
12. %75 etanolü çıkarın ve 1x'i %95 etanol ile kısa bir süre durulayın. % 95 etanolü atın ve% 95 etanol ile buz üzerinde 3 dakika inkübe edin.
13. %95 etanolü çıkarın ve her seferinde en az 10 dakika olmak üzere 3 kez% 100 etanol (200 geçirmez) ile yıkayın. % 100 etanolü çıkarın ve propilen oksit (PO) ekleyin. PO ile her biri en az 10 dakika 3 kez durulayın.
14. Reçine karışımını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
    1. Tamamen sıvılaştırmak için reçine bileşenlerini 60 °C'de ısıtın. 12.5 mL Embed-218, 7.5 mL Araldite 502 ve 27.5 mL DDSA'yı 60 ° C'de 50 mL'lik bir tüpte iyice karıştırın. Bu karışım 4 °C'de 6 ay saklanabilir. Kullanmadan önce 60 °C'ye ısıtın. Kullanmadan önce gerekli miktarı alın.
15. Örnekleri aşağıda açıklandığı gibi gömün.
    1. Reçine karışımının bir kısmını bir tüpe yerleştirin ve 20 μL / mL DMP-30 aktivatörü ekleyin. 60 °C'de döndürerek iyice karıştırın; renk koyulaşmalıdır.
    2. Bu aktif reçine alikotunu PO içinde% 50 oranında seyreltin ve reçine ile PO'nun tamamen karışmasına izin verin.
    3. Numune içeren tüpten son PO durulamasını çıkarın ve tüpü neredeyse tamamen dolduracak şekilde %50 reçine/PO karışımı ile değiştirin. Numuneyi gece boyunca oda sıcaklığında döndürün.
    4. Ertesi gün, yeni bir reçine alikotunu (numune başına 1 mL) 20 μL/mL DMP-30 ile karıştırın.
16. Numuneyi, numune tüpünden bir diseksiyon mikroskobu altında (~6x büyütme) küçük bir hacimde %50 reçine/PO karışımı olan bir polipropilen kaba yerleştirin ve pimleri dikkatlice dokudan çıkarın. Sadece dokuyu bir DMP-30 aktivatörü ile az miktarda %100 reçine içeren başka bir polipropilen kaba aktarın.
17. DMP-30 aktivatörü ile %100 reçine ile bir silikon gömme kalıbını doldurun ve numuneyi dikkatlice kalıba yerleştirin. Kalıbı fırına koyun ve 60 °C'de en az 48 saat pişirin. Hazırlanan numune Şekil 2B'de gösterilmiştir.
18. ^10,11'de açıklandığı gibi montajlı geniş alan transmisyon elektron mikroskobu (WA-TEM) görüntülemesi ^{gerçekleştirin}. İlk delinmeden 3 boyutlu olarak işlenmiş 1 dakikalık trombüse giden sürecin bir tasviri için Şekil 3'e bakınız. Montajlı WA-TEM elektron mikroskobu görüntülemesi için ayrıntılı bir protokolün dahil edilmesi buraya dahil edilmemiştir ve numune hazırlama ile ilgili mevcut protokollerin kapsamı dışındadır.
    NOT: WA-TEM, bilgisayarlı bir aşamaya sahip çoğu modern transmisyon elektron mikroskobunun yeterince takdir edilmeyen bir yeteneğidir. Bu işlevleri destekleyen shareware yazılımı^10,11, Colorado Üniversitesi, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Sonuçlar

Delinme yarası kanama süresi üzerindeki ilaç etkilerinin kantitatitasyonu
Delinme yarası kanama süreleri, farelerde kolayca gerçekleştirilebilecek bir ilaç riskinin fizyolojik bir modelini sağlar. Bir delinme yarası deneyinden elde edilen sonuçlar tahmine dayalıdır. Burada dabigatran doz-yanıt kanama eğrisi gösteriliyor. Bir trombin inhibitörü olan dabigatran, DOAC¹² olarak adlandırılan oral doğrudan etkili bir anti-pıht?...

Tartışmalar

Şah damarlarında ve femoral arterlerde hemostatik trombüs oluşturulması, in situ perfüzyon fiksasyonu ve montajlı geniş alan transmisyon elektron mikroskobu için örnek işleme için ayrıntılı bir ponksiyon yarası prosedürü sunuyoruz. Genel prosedürler, ultrastrüktürel analiz için hemostatik trombüs oluşturmak ve deneysel farelerde, örneğin farklı tip ve dozajlarda farmasötik ilaçlarla tedavi edilen farelerde kanama sürelerini karşılaştırmak için ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000