تحليل الانضمام النهائي غير المتماثل وكفاءة إعادة التركيب المتماثل في خلايا HEK-293T باستخدام أنظمة مراسل قائمة على GFP

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة الانضمام النهائي غير المتماثل خارج الكروموسومات (NHEJ) ومقايسة إعادة التركيب المتماثل (HR) لتحديد كفاءة NHEJ و HR في خلايا HEK-293T.

Abstract

تمثل فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) أكثر آفات الحمض النووي خطورة ، وهي قادرة على إحداث فقدان كبير للمعلومات الوراثية وزوال الخلايا. استجابة لذلك ، تستخدم الخلايا آليتين أساسيتين لإصلاح DSB: الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (HR). يعد القياس الكمي لكفاءة NHEJ والموارد البشرية بشكل منفصل أمرا بالغ الأهمية لاستكشاف الآليات والعوامل ذات الصلة المرتبطة بكل منهما. مقايسة NHEJ ومقايسة الموارد البشرية هي طرق راسخة تستخدم لقياس كفاءة مسارات الإصلاح الخاصة بكل منهما. تعتمد هذه الطرق على بلازميدات مصممة بدقة تحتوي على جين بروتين الفلورسنت الأخضر المعطل (GFP) مع مواقع التعرف على نوكلياز I-SceI ، الذي يحفز DSBs. هنا ، نصف مقايسة NHEJ خارج الكروموسومات ومقايسة HR ، والتي تتضمن النقل المشترك لخلايا HEK-293T مع بلازميدات EJ5-GFP / DR-GFP ، وبلازميد I-SceI الذي يعبر ، وبلازميد mCherry المعرب عنه. يتم الحصول على النتائج الكمية لكفاءة NHEJ و HR عن طريق حساب نسبة الخلايا الإيجابية GFP إلى الخلايا الإيجابية mCherry ، كما تم حسابها بواسطة قياس التدفق الخلوي. على عكس المقايسات المتكاملة للكروموسومات ، فإن هذه المقايسات خارج الكروموسومات أكثر ملاءمة لإجراء تحقيقات مقارنة تتضمن خطوط خلايا مستقرة متعددة ثابتة.

Introduction

يعد كسر الحمض النووي المزدوج (DSB) أكثر أشكال تلف الحمض النووي ضررا ، مما قد يؤدي إلى عدم استقرار الجينوم ، وإعادة ترتيب الكروموسومات ، والشيخوخة الخلوية ، وموت الخلايا إذا لم يتم إصلاحه على الفور¹. تم التعرف على مسارين راسخين ، الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (HR) ، لفعاليتهما في معالجة DSBs^{DNA 2,3}. يعتبر HR آلية خالية من الأخطاء لإصلاح DSB ، باستخدام التسلسلات المتماثلة في الكروماتيد الشقيقة كقالب لاستعادة التكوين الأصلي لجزيء الحمض النووي^{المصاب 3}. NHEJ ، من ناحية أخرى ، هو مسار إصلاح DSB عرضة للخطأ ينضم إلى نه....

Protocol

1. عزل البلازميد

1. تحويل الإشريكية القولونية المختصة باستخدام البلازميدات EJ5-GFP و DR-GFP و pCBASceI (I-SceI التي تعبر عن البلازميد) و PCI2-HA-mCherry (mCherry التي تعبر عن البلازميد) (انظر جدول المواد) باتباع بروتوكول التحويل القياسي²⁰.
   ملاحظة: يمكن استبدال PCI2-HA-mCherry ببلازميدات أخرى معبرة عن mCherry أو DsRed.
2. قم بزراعة الإشريكية القولونية المحولة في 500 مل من وسط LB السائل المكمل ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج.
3. اعزل البلازميدات باستخدام مجموعة عزل البلازميد ماكسي الخالية من السموم الداخلية المتاحة تجاريا باتباع....

النتائج

لضمان دقة تحليل NHEJ والموارد البشرية ، من الضروري تنفيذ تعديل مناسب للتعويض واستراتيجية البوابة. عادة ، لا يظهر مضان mCherry في كاشف GFP عند استخدام مرشح 530 نانومتر. ومع ذلك ، في حالات الخلايا التي تظهر تعبيرا عاليا للغاية عن GFP ، قد يؤدي مضان GFP إلى تلويث كاشف mCherry عند استخدام مرشح 575 نانومتر. لمعال.......

Discussion

تم استخدام الطريقة الموضحة هنا في العديد من الأوراق لتقييم كفاءة NHEJ وكفاءة الموارد البشرية^{9،10،11،12،13،14،16،17،18،}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056