JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول مقايسة الانضمام النهائي غير المتماثل خارج الكروموسومات (NHEJ) ومقايسة إعادة التركيب المتماثل (HR) لتحديد كفاءة NHEJ و HR في خلايا HEK-293T.

Abstract

تمثل فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) أكثر آفات الحمض النووي خطورة ، وهي قادرة على إحداث فقدان كبير للمعلومات الوراثية وزوال الخلايا. استجابة لذلك ، تستخدم الخلايا آليتين أساسيتين لإصلاح DSB: الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (HR). يعد القياس الكمي لكفاءة NHEJ والموارد البشرية بشكل منفصل أمرا بالغ الأهمية لاستكشاف الآليات والعوامل ذات الصلة المرتبطة بكل منهما. مقايسة NHEJ ومقايسة الموارد البشرية هي طرق راسخة تستخدم لقياس كفاءة مسارات الإصلاح الخاصة بكل منهما. تعتمد هذه الطرق على بلازميدات مصممة بدقة تحتوي على جين بروتين الفلورسنت الأخضر المعطل (GFP) مع مواقع التعرف على نوكلياز I-SceI ، الذي يحفز DSBs. هنا ، نصف مقايسة NHEJ خارج الكروموسومات ومقايسة HR ، والتي تتضمن النقل المشترك لخلايا HEK-293T مع بلازميدات EJ5-GFP / DR-GFP ، وبلازميد I-SceI الذي يعبر ، وبلازميد mCherry المعرب عنه. يتم الحصول على النتائج الكمية لكفاءة NHEJ و HR عن طريق حساب نسبة الخلايا الإيجابية GFP إلى الخلايا الإيجابية mCherry ، كما تم حسابها بواسطة قياس التدفق الخلوي. على عكس المقايسات المتكاملة للكروموسومات ، فإن هذه المقايسات خارج الكروموسومات أكثر ملاءمة لإجراء تحقيقات مقارنة تتضمن خطوط خلايا مستقرة متعددة ثابتة.

Introduction

يعد كسر الحمض النووي المزدوج (DSB) أكثر أشكال تلف الحمض النووي ضررا ، مما قد يؤدي إلى عدم استقرار الجينوم ، وإعادة ترتيب الكروموسومات ، والشيخوخة الخلوية ، وموت الخلايا إذا لم يتم إصلاحه على الفور1. تم التعرف على مسارين راسخين ، الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (HR) ، لفعاليتهما في معالجة DSBsDNA 2,3. يعتبر HR آلية خالية من الأخطاء لإصلاح DSB ، باستخدام التسلسلات المتماثلة في الكروماتيد الشقيقة كقالب لاستعادة التكوين الأصلي لجزيء الحمض النوويالمصاب 3. NHEJ ، من ناحية أخرى ، هو مسار إصلاح DSB عرضة للخطأ ينضم إلى نهايات الحمض النووي المكسورة دون الاعتماد على أي قالب2.

مقايسة NHEJ ومقايسة الموارد البشرية هي طرق كلاسيكية تم تطويرها في الأصل في مختبر Jasin في مركز Memorial Sloan-Kettering للسرطان وتستخدم لتحديد كفاءة NHEJ و HR ، على التوالي4،5،6،7. تلعب هذه المقايسات دورا حاسما في التحقيق في الآليات والعوامل ذات الصلة المرتبطة ب NHEJ و HR8،9،10،11،12،13،14. يعتمد كلا الاختبارين على تنفيذ اثنين من مراسلي GFP المعطلة ، EJ5-GFP و DR-GFP ، لمراقبة إصلاح DSBs الناجم عن I-SceI endonuclease. يتم توظيف مراسل EJ5-GFP في اختبار NHEJ ، بينما يتم استخدام مراسل DR-GFP في فحص الموارد البشرية. تم تصميم كل مراسل بمهارة بحيث لا يمكن إصلاح DSBs المستحثة ب I-SceI إلا من خلال مسار إصلاح محدد لاستعادة شريط تعبير GFP 4,5.

يمكن إجراء فحص NHEJ وفحص الموارد البشرية باستخدام نهج متكامل الكروموسومات أو خارج الكروموسومات15،16. يتطلب النهج المتكامل للكروموسومات دمج مراسلي GFP المعطلة في الجينوم ، مما يسمح بتحليل إصلاح DSB في سياق الكروموسومات 6,15. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يتطلب مرور الخلايا لفترة طويلة وهو غير مناسب للدراسات المقارنة التي تنطوي على خطوط خلايا متعددة بسبب التكامل الكروموسومي التعسفي ، مما يؤدي إلى إدخال عامل مربك إضافي بصرف النظر عن الاختلافات المتأصلة. في هذا البروتوكول ، نصف مقايسة NHEJ خارج الكروموسومات ومقايسات الموارد البشرية ، والتي تتضمن النقل العابر لبلازميدات GFP و I-SceI المعطلة إلى خلايا HEK-293T ، متبوعة بتحليل قياس التدفق الخلوي (يظهر سير عمل التجربة في الشكل 1). تم الإبلاغ عن فحوصات المراسلين غير المتكاملة هذه في الأصل من قبل مختبر Jasin لدراسة إصلاح الروابط المتقاطعة بين الحمض النووي16 وتم استخدامها لتقييم كفاءة NHEJ وكفاءة الموارد البشرية من قبل العديد من المختبرات9،10،11،12،13،14،17،18،19 ، بما في ذلك مختبرنا11. تسهل هذه الأساليب خارج الكروموسومات تحليل إصلاح DSB في الدراسات المقارنة التي تتضمن العديد من خطوط الخلايا المستقرة الثابتة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. عزل البلازميد

  1. تحويل الإشريكية القولونية المختصة باستخدام البلازميدات EJ5-GFP و DR-GFP و pCBASceI (I-SceI التي تعبر عن البلازميد) و PCI2-HA-mCherry (mCherry التي تعبر عن البلازميد) (انظر جدول المواد) باتباع بروتوكول التحويل القياسي20.
    ملاحظة: يمكن استبدال PCI2-HA-mCherry ببلازميدات أخرى معبرة عن mCherry أو DsRed.
  2. قم بزراعة الإشريكية القولونية المحولة في 500 مل من وسط LB السائل المكمل ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج.
  3. اعزل البلازميدات باستخدام مجموعة عزل البلازميد ماكسي الخالية من السموم الداخلية المتاحة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  4. تحديد تركيزات البلازميد باستخدام مقاييس الطيف الضوئي متناهي الصغر نانودروب. اضبط تركيز البلازميد على 1 ميكروغرام / ميكرولتر.

2. إعداد الخلية ونقلها

  1. زراعة خلايا HEK-293T في وسط DMEM تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنين. تأكد من أن خلايا HEK-293T أو الخلايا المستقرة HEK-293T المنشأة في حالة نمو جيدة.
    ملاحظة: يجب أن تخضع الخلايا المجمدة لجولتين على الأقل من الانقسام قبل النقل.
  2. في اليوم السابق لعملية النقل ، قم بزرع خلايا HEK-293T في صفيحة 6 آبار في 2 × 105 خلايا / بئر لتحقيق حوالي 60٪ التقاء في اليوم التالي.
  3. في يوم النقل ، قم بتأكيد التقاء الخلية ، بهدف الحصول على حوالي 60٪. بالنسبة لفحص NHEJ ، قم بنقل خلايا العينة التجريبية في لوحة ذات 6 آبار مع 1 ميكروغرام من EJ5-GFP ، و 1 ميكروغرام من pCBASceI ، و 1 ميكروغرام من بلازميدات PCI2-HA-mCherry ، باستخدام كاشف نقل تجاري يتبع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). بالنسبة لفحص الموارد البشرية، استبدل بلازميد EJ5-GFP ببلازميد DR-GFP.
  4. بالنسبة لضوابط معايرة FACS ، اترك بئرا من الخلايا غير منقولة كعنصر تحكم سلبي. قم بنقل الخلايا في لوحة ذات 6 آبار إما مع (1) 1 ميكروغرام من EJ5-GFP (لمقايسة NHEJ) أو 1 ميكروغرام من DR-GFP (لفحص الموارد البشرية) ، جنبا إلى جنب مع 1 ميكروغرام من pCBASceI كعنصر تحكم GFP أحادي اللون ، أو (2) 1 ميكروغرام من PCI2-HA-mCherry كعنصر تحكم أحادي اللون mChere.

3. تحليل الخلايا الإيجابية ل GFP و mCherry عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. بعد يومين من النقل ، تأكد من التعبير عن بروتينات GFP و mCherry باستخدام مجهر الفلورسنت.
  2. بعد ثلاثة أيام من النقل ، قم بإزالة الوسائط من الآبار ، واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني ، وأضف 500 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق على 37 درجة مئوية لفصل جميع الخلايا من اللوحة. خلال هذه الخطوات والخطوات اللاحقة ، قم بحماية الخلايا من الضوء المباشر.
  3. أضف 500 ميكرولتر من وسائط DMEM الكاملة إلى كل بئر ، وأعد تعليق الخلايا ، مما يضمن عدم ظهور كتل.
  4. نقل جميع الخلايا من كل بئر إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، ثم خلايا الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 × غرام في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب الخراجة وغسلها مرة واحدة باستخدام 1.0 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق السحب ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS ، وانقل الخلايا إلى أنابيب FACS (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، ابدأ تحليل قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد حصاد الخلايا. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الخلايا على الجليد لعدة ساعات.
  7. قم بمعايرة FACS مع الخلايا غير المنقولة (التحكم السلبي) ، EJ5-GFP / DR-GFP ، والخلايا المنقولة pCBASceI (التحكم أحادي اللون GFP) والخلايا المنقولة بالكرز mCherry (التحكم أحادي اللون mCherry ). اضبط الجهد والتعويض لتقليل انتشار التألق بين GFP و mCherry.
  8. الحصول على وتسجيل ما لا يقل عن 10000 خلية سليمة من كل أنبوب.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام برنامج FlowJo (انظر جدول المواد) لتحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية. يمكن تنفيذ إجراءات قابلة للمقارنة في برامج التحليل البديلة.

  1. اسحب جميع ملفات FACS إلى لوحة المعلومات. انقر نقرا مزدوجا فوق أحد الملفات لعرض مخطط FSC / SSC.
  2. قم بإنشاء بوابة مضلعة لتحديد الخلايا السليمة ، باستثناء الحطام في الزاوية اليسرى السفلية. قم بتسمية هذه المجموعة الفرعية "الخلايا السليمة" واسحب هذه البوابة إلى شريط "كافة العينات". قم بالتمرير خلال كل عينة باستخدام زر العينة التالية لضمان البوابات المناسبة لكل عينة (الشكل 2 أ).
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق السكان الفرعيين للخلايا السليمة لعينة التحكم السلبية (الخلايا غير المنقولة) لإظهار مخطط جديد. قم بتغيير المحاور إلى FL1-H (المحور السيني ، GFP) و FL2-H (المحور ص ، mCherry).
  4. حدد أداة Quad Gating وانقر على أقصى اليمين العلوي لسكان الخلايا السالبة (الشكل 2B). اسحب البوابات المستطيلة الأربعة إلى شريط "الخلايا السليمة". قم بالتمرير عبر عينات من التحكم أحادي اللون في GFP أو التحكم أحادي اللون mCherry باستخدام زر العينة التالية لضمان البوابات المناسبة للتمييز بين GFP الإيجابي أو mCherry الإيجابي من خلايا التحكم السلبية (الشكل 2C ، D). قم بضبط البوابة الرباعية إذا لزم الأمر وقم بتطبيق هذه البوابة على جميع مجموعات "الخلايا السليمة".
  5. انقر فوق محرر التخطيط. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المؤامرات التمثيلية واختر نسخ إلى محرر التخطيط. حدد جميع المخططات التمثيلية ، ثم انقر نقرا مزدوجا لفتح تعريف الرسم البياني. اضبط تسمية المحور والتعليق التوضيحي ووسيلة الإيضاح حسب الرغبة.
  6. تعمل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية mCherry في العينات التجريبية كعنصر تحكم في كفاءة النقل. احسب الكفاءة النسبية لإصلاح الحمض النووي بمقارنة عدد الخلايا الموجبة ل GFP بعدد الخلايا الموجبة mCherry في نفس المخطط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لضمان دقة تحليل NHEJ والموارد البشرية ، من الضروري تنفيذ تعديل مناسب للتعويض واستراتيجية البوابة. عادة ، لا يظهر مضان mCherry في كاشف GFP عند استخدام مرشح 530 نانومتر. ومع ذلك ، في حالات الخلايا التي تظهر تعبيرا عاليا للغاية عن GFP ، قد يؤدي مضان GFP إلى تلويث كاشف mCherry عند استخدام مرشح 575 نانومتر. لمعال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تم استخدام الطريقة الموضحة هنا في العديد من الأوراق لتقييم كفاءة NHEJ وكفاءة الموارد البشرية9،10،11،12،13،14،16،17،18،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هيلونغجيانغ الصينية (YQ2022C036) ومؤسسة ابتكار الخريجين بجامعة تشيتشيهار الطبية (QYYCX2022-06). تم إنتاج الشكل 1 باستخدام MedPeer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 cm dishes BBIF611202-9001
6 well platesCorning3516
AmpicillinBeyotimeST007Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent CellsTIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi Plasmid  kitTIANGENDP117alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubesFALCON352054
Fetal bovine serumCLARKFB25015
Flow cytometerBD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1Treestaralternative analysis software can be used
HEK-293T cellsNational Infrastructure of Cell Line Resource1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015alternative transfection regents can be used
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherryalternative plasmids containing DsRed can be used
TrypsinGibco25200-056

References

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
  3. Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
  4. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  5. Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
  7. Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
  8. Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
  9. Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
  10. Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
  11. Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
  12. Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
  13. Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
  14. Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
  15. Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
  16. Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
  17. Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
  18. Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
  19. Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
  21. Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NHEJ GFP HEK 293T I SceI Endonuclease

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved