GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

要約

このプロトコルは、HEK-293T細胞におけるNHEJおよびHRの効率を定量化するための染色体外非相同末端結合(NHEJ)アッセイおよび相同組換え(HR)アッセイについて説明しています。

要約

DNA二本鎖切断(DSB)は、最も危険なDNA病変であり、大量の遺伝情報の損失と細胞の死を誘発する可能性があります。これに対して、細胞はDSB修復に非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの主要なメカニズムを採用しています。NHEJとHRの効率を別々に定量化することは、それぞれに関連するメカニズムと要因を調査するために重要です。NHEJアッセイとHRアッセイは、それぞれの修復経路の効率を測定するために使用される確立された方法です。これらの方法は、DSBを誘導するエンドヌクレアーゼI-SceIの認識部位を持つ破壊された緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む、細心の注意を払って設計されたプラスミドに依存しています。ここでは、HEK-293T細胞にEJ5-GFP/DR-GFPプラスミド、I-SceI発現プラスミド、およびmCherry発現プラスミドを同時トランスフェクションする染色体外NHEJアッセイとHRアッセイについて説明します。NHEJおよびHR効率の定量的結果は、フローサイトメトリーでカウントされたGFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の比率を計算することによって得られます。染色体統合アッセイとは対照的に、これらの染色体外アッセイは、複数の確立された安定細胞株を含む比較研究を行うのにより適しています。

概要

DNA二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も有害な形態であり、迅速に修復しないと、ゲノムの不安定性、染色体再配列、細胞老化、および細胞死につながる可能性があります¹。非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの確立された経路は、DNA DSBへの対処における有効性が認められています^2,3。HRは、DSB修復のためのエラーのないメカニズムと考えられており、姉妹染色分体の相同配列をテンプレートとして利用して、損傷したDNA分子の元の構成を復元します³。一方、NHEJは、テンプレート²に依存せずに壊れたDNA末端を結合するエラーが発生しやすいDSB修復経路です。

NHEJ アッセイと HR アッセイは、もともとメモリアル スローン ケタリングがんセンターの Jasin の研究室で開発された古典的な方法であり、NHEJ と HR の効率をそれぞれ定量化するために利用されました 4,5,6,7。これらのアッセイは、NHEJおよびHR 8,9,10,11,12,13,14に関連するメカニズムと因子を調査する上で重要な役割を果たします。どちらのアッセイも、I-SceIエンドヌクレアーゼによって誘導されるDSBの修復をモニターするために、EJ5-GFPとDR-GFPという2つの破壊されたGFPレポーターの実装に依存しています。NHEJアッセイではEJ5-GFPレポーターが、HRアッセイではDR-GFPレポーターが使用されています。各レポーターは、I-SceI誘導DSBが特定の修復経路によってのみ修復され、GFP発現カセット^を修復できるように微妙に設計されています^4,5。

NHEJアッセイおよびHRアッセイは、染色体統合アプローチまたは染色体外アプローチのいずれかを用いて実施することができる^15,16。染色体統合アプローチでは、破壊されたGFPレポーターをゲノムに統合する必要があり、染色体コンテキスト内でのDSB修復の解析が可能になります^6,15。しかし、このアプローチは長時間の細胞継代を必要とし、任意の染色体統合のために複数の細胞株を含む比較研究には適さず、固有の違いとは別に追加の交絡因子を導入します。このプロトコールでは、染色体外NHEJアッセイおよびHRアッセイについて説明し、破壊されたGFPおよびI-SceIプラスミドのHEK-293T細胞への一過性トランスフェクションと、それに続くフローサイトメトリー分析について説明します(実験ワークフローを図1に示します)。これらの非統合レポーターアッセイは、もともとJasinの研究室によってDNA鎖間架橋修復を研究するために報告され¹⁶、いくつかの研究室^{9,10,11,12,13,14,17,18,19}(うち11を含む)によってNHEJ効率およびHR効率を評価するために採用されている¹¹.これらの染色体外アプローチは、複数の確立された安定細胞株を含む比較研究におけるDSB修復の解析を容易にします。

プロトコル

1. プラスミドの単離

1. コンピテント 大腸菌 をプラスミドEJ5-GFP、DR-GFP、pCBASceI(I-SceI発現プラスミド)、およびPCI2-HA-mCherry(mCherry発現プラスミド)( 材料表を参照)で、標準形質転換プロトコル²⁰に従って形質転換します。
   注:PCI2-HA-mCherryは、他のmCherryまたはDsRed発現プラスミドで置換できます。
2. 形質転換 した大腸菌 を、100 μg/mL アンピシリンを添加した 500 mL の液体 LB 培地で 37 °C で一晩振とうしながら培養します。
3. 製造元の指示に従って、市販のエンドトキシンフリープラスミドマキシ単離キットを使用してプラスミドを単離します( 材料の表を参照)。
4. ナノ滴微量分光光度計を使用してプラスミド濃度を定量化します。プラスミド濃度を1 μg/μLに調整します。

2. 細胞調製とトランスフェクション

1. HEK-293T細胞をDMEM培地で培養し、10%ウシ胎児血清を添加します。HEK-293T細胞または確立されたHEK-293T安定細胞が良好な増殖状態にあることを確認してください。
   注:凍結細胞は、トランスフェクションの前に少なくとも2回の分裂を受ける必要があります。
2. トランスフェクションの前日に、HEK-293T細胞を6ウェルプレートで2×10⁵ 細胞/ウェルに播種し、翌日に約60%のコンフルエントを達成します。
3. トランスフェクション当日は、細胞の密度を確認し、約60%を目指します。NHEJアッセイでは、製造元の指示に従って市販のトランスフェクション試薬を使用して、1 μgのEJ5-GFP、1 μgのpCBASceI、および1 μgのPCI2-HA-mCherryプラスミドを6ウェルプレートにトランスフェクションします( 材料表を参照)。HRアッセイでは、EJ5-GFPプラスミドをDR-GFPプラスミドに置き換えてください。
4. FACSキャリブレーションコントロールの場合、ネガティブコントロールとしてトランスフェクションされていない細胞のウェルを残します。(1)1 μgのEJ5-GFP(NHEJアッセイ用)または1 μgのDR-GFP(HRアッセイ用)と、GFP単色コントロールとして1 μgのpCBASceI、または(2)1 μgのPCI2-HA-mCherryをmCherry単色コントロールとして、6ウェルプレート中の細胞をトランスフェクションします。

3. フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の解析

1. トランスフェクションの2日後、蛍光顕微鏡を用いてGFPおよびmCherryタンパク質の発現を確認します。
2. トランスフェクションの3日後、培地をウェルから取り出し、PBSで1回洗浄し、各ウェルに500 μLのトリプシンを加えます。37°Cで5分間インキュベートし、プレートからすべての細胞を剥離します。このステップとその後のステップ全体で、細胞を直接光から保護します。
3. 500 μLの完全DMEM培地を各ウェルに加え、細胞を再懸濁して、凝集物が見えないようにします。
4. 各ウェルのすべての細胞を1.5 mLの遠心チューブに移し、次に室温で1000 × g で2分間細胞を遠心分離します。
5. ピペッティングで上清を慎重に取り除き、1.0 mLのPBSで一度洗浄します。
6. 再度、ピペッティングで上清を慎重に除去し、細胞を500μLのPBSに再懸濁し、細胞をFACSチューブに移します( 材料の表を参照)。
   注:最適な結果を得るには、細胞採取後すぐにフローサイトメトリー解析を開始してください。あるいは、細胞を氷上に数時間保存することもできます。
7. トランスフェクションされていない細胞(ネガティブコントロール)、EJ5-GFP/DR-GFP、およびpCBASceIトランスフェクションされた細胞(GFP単色コントロール)およびmCherryトランスフェクションされた細胞(mCherry単色コントロール)でFACSを較正します。GFPとmCherryの間の蛍光のスピルオーバーを最小限に抑えるために、電圧と補償を調整します。
8. 各チューブから少なくとも 10,000 個の無傷の細胞を取り込み、記録します。

4. データ分析

注:次の手順は、FlowJoソフトウェア( 資料表を参照)を使用してFACSデータを分析するために実行されます。同等の手順を代替解析ソフトウェアで実行できます。

1. すべてのFACSファイルをダッシュボードにドラッグします。ファイルの1つをダブルクリックして、FSC/SSCプロットを表示します。
2. ポリゴンゲートを作成して、左下隅の破片を除いた無傷のセルを選択します。このサブポピュレーションに「Intact Cells」という名前を付け、このゲートを「All Samples」バーにドラッグします。 Next Sample ボタンを使用して各サンプルをスクロールし、各サンプルに適切なゲートがあることを確認します(図2A)。
3. ネガティブコントロールサンプル(トランスフェクションされていない細胞)の Intact Cells サブポピュレーションをダブルクリックして、新しいプロットを表示します。軸を FL1-H (x軸、GFP)、FL2-H(y軸、mCherry)に変更します。
4. クワッドゲーティングツールを選択し、ネガティブセル集団の右上端をクリックします(図2B)。4 つの長方形のゲートを [Intact Cells] バーにドラッグします。「Next Sample」ボタンを使用してGFP単色コントロールまたはmCherry単色コントロールのサンプルをスクロールし、GFP陽性またはmCherry陽性のコントロール細胞とネガティブコントロール細胞を区別するための適切なゲーティングを確保します(図2C、D)。必要に応じて象限ゲーティングを微調整し、このゲーティングをすべての「Intact Cells」集団に適用します。
5. レイアウトエディタをクリックします。代表的なプロットを右クリックし、[Copy to Layout Editor]を選択します。代表的なプロットをすべて選択し、ダブルクリックしてグラフ定義を開きます。必要に応じて、軸のラベル、注釈、および凡例を調整します。
6. 実験サンプル中のmCherry陽性細胞の割合は、トランスフェクション効率の制御として機能します。同じプロット内のGFP陽性細胞の数とmCherry陽性細胞の数を比較することにより、相対的なDNA修復効率を計算します。

結果

NHEJおよびHR分析の精度を確保するためには、適切な報酬調整およびゲーティング戦略の実施が必要です。通常、530 nmフィルターを使用すると、mCherry蛍光はGFP検出器に現れません。しかし、細胞が非常に高いGFP発現を示す場合、575 nmフィルターを使用すると、GFP蛍光がmCherry検出器を汚染する可能性があります。これらの懸念に対処するために、ネガティブコントロール、GFP単色コントロール?...

ディスカッション

ここで述べる方法は、NHEJ効率およびHR効率^{を評価する}ためにいくつかの論文で採用されている9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。この方法は、DNA DSB修?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056