GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

要約

このプロトコルは、HEK-293T細胞におけるNHEJおよびHRの効率を定量化するための染色体外非相同末端結合(NHEJ)アッセイおよび相同組換え(HR)アッセイについて説明しています。

要約

DNA二本鎖切断(DSB)は、最も危険なDNA病変であり、大量の遺伝情報の損失と細胞の死を誘発する可能性があります。これに対して、細胞はDSB修復に非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの主要なメカニズムを採用しています。NHEJとHRの効率を別々に定量化することは、それぞれに関連するメカニズムと要因を調査するために重要です。NHEJアッセイとHRアッセイは、それぞれの修復経路の効率を測定するために使用される確立された方法です。これらの方法は、DSBを誘導するエンドヌクレアーゼI-SceIの認識部位を持つ破壊された緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む、細心の注意を払って設計されたプラスミドに依存しています。ここでは、HEK-293T細胞にEJ5-GFP/DR-GFPプラスミド、I-SceI発現プラスミド、およびmCherry発現プラスミドを同時トランスフェクションする染色体外NHEJアッセイとHRアッセイについて説明します。NHEJおよびHR効率の定量的結果は、フローサイトメトリーでカウントされたGFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の比率を計算することによって得られます。染色体統合アッセイとは対照的に、これらの染色体外アッセイは、複数の確立された安定細胞株を含む比較研究を行うのにより適しています。

概要

DNA二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も有害な形態であり、迅速に修復しないと、ゲノムの不安定性、染色体再配列、細胞老化、および細胞死につながる可能性があります¹。非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの確立された経路は、DNA DSBへの対処における有効性が認められています^2,3。HRは、DSB修復のためのエラーのないメカニズムと考えられており、姉妹染色分体の相同配列をテンプレートとして利用して、損傷したDNA分子の元の構成を復元します³。一方、NHEJは、テンプレート²に依存せずに壊れたDNA末端を結合するエラーが発生しやすいDSB修復経路です。

NHEJ アッセイと HR アッセイは、もともとメモリアル スローン ケタリングがんセンターの Jasin の研究室で開発された古典的な方法であり、NHEJ と HR の効率をそれぞれ定量化するために利用されました 4,5,6,7。

プロトコル

1. プラスミドの単離

1. コンピテント 大腸菌 をプラスミドEJ5-GFP、DR-GFP、pCBASceI(I-SceI発現プラスミド)、およびPCI2-HA-mCherry(mCherry発現プラスミド)( 材料表を参照)で、標準形質転換プロトコル²⁰に従って形質転換します。
   注:PCI2-HA-mCherryは、他のmCherryまたはDsRed発現プラスミドで置換できます。
2. 形質転換 した大腸菌 を、100 μg/mL アンピシリンを添加した 500 mL の液体 LB 培地で 37 °C で一晩振とうしながら培養します。
3. 製造元の指示に従って、市販のエンドトキシンフリープラスミドマキシ単離キットを使用してプラスミドを単離します( 材料の表を参照)。
4. ナノ滴微量分光光度計を使用してプラスミド濃度を定量化します。プラスミド濃度を1 μg/μLに調整します。

2. 細胞調製とトランスフェクション

1. HEK-293T細胞をDMEM培地で培養し、10%ウシ胎児血清を添加します。HEK-293T細胞または確立されたHEK-293T安定....

ディスカッション

ここで述べる方法は、NHEJ効率およびHR効率^{を評価する}ためにいくつかの論文で採用されている9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。この方法は、DNA DSB修?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056