Analyse de l’efficacité de l’assemblage d’extrémités non homologues et de la recombinaison homologue dans les cellules HEK-293T à l’aide de systèmes rapporteurs basés sur la GFP

Résumé

Ce protocole décrit un test de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) extrachromosomique et un test de recombinaison homologue (HR) pour quantifier l’efficacité de NHEJ et HR dans les cellules HEK-293T.

Résumé

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) représentent les lésions de l’ADN les plus dangereuses, capables d’induire une perte substantielle d’informations génétiques et la disparition cellulaire. En réponse, les cellules utilisent deux mécanismes principaux pour la réparation des DSB : la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). Il est essentiel de quantifier l’efficacité de la NHEJ et de la RH séparément pour explorer les mécanismes et les facteurs pertinents associés à chacun. Le test NHEJ et le test HR sont des méthodes établies utilisées pour mesurer l’efficacité de leurs voies de réparation respectives. Ces méthodes reposent sur des plasmides méticuleusement conçus contenant un gène de protéine fluorescente verte (GFP) perturbé avec des sites de reconnaissance pour l’endonucléase I-SceI, qui induit des CDB. Ici, nous décrivons le test NHEJ extrachromosomique et le test HR, qui impliquent la co-transfectation de cellules HEK-293T avec des plasmides EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide exprimant I-SceI et un plasmide exprimant mCherry. Les résultats quantitatifs de l’efficacité de la NHEJ et de la HR sont obtenus en calculant le rapport entre les cellules GFP positives et les cellules mCherry-positives, tel que compté par cytométrie en flux. Contrairement aux tests chromosomiquement intégrés, ces tests extrachromosomiques sont plus adaptés à la réalisation d’études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires stables établies.

Introduction

Une cassure double brin de l’ADN (CDB) est la forme la plus délétère de dommages à l’ADN, conduisant potentiellement à l’instabilité du génome, à des réarrangements chromosomiques, à la sénescence cellulaire et à la mort cellulaire si elle n’est pas réparée rapidement¹. Deux voies bien établies, la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR), sont reconnues pour leur efficacité dans le traitement des DSB^de l’ADN ^2,3. La HR est considérée comme un mécanisme sans erreur pour la réparation des DSB, utilisant des séquences homologues ....

Protocole

1. Isolement plasmidique

1. Transformez E. coli compétent avec les plasmides EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide exprimant I-SceI) et PCI2-HA-mCherry (plasmide exprimant mCherry) (voir Tableau des matériaux) en suivant le protocole de transformation standard²⁰.
   REMARQUE : PCI2-HA-mCherry peut être remplacé par d’autres plasmides exprimant mCherry ou DsRed.
2. Cultiver l’E. coli transformé dans 500 mL de milieu LB liquide complété par 100 μg/mL d’ampicilline pendant une nuit à 37 °C en agitant.
3. Isolez les plasmides à l’aide d’une trousse d’isolement de maxi d....

Discussion

La méthode décrite ici a été utilisée dans plusieurs articles pour évaluer l’efficacité du NHEJ et l’efficacité des RH 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Cette méthode est pertine.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056