Analyse de l’efficacité de l’assemblage d’extrémités non homologues et de la recombinaison homologue dans les cellules HEK-293T à l’aide de systèmes rapporteurs basés sur la GFP

Résumé

Ce protocole décrit un test de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) extrachromosomique et un test de recombinaison homologue (HR) pour quantifier l’efficacité de NHEJ et HR dans les cellules HEK-293T.

Résumé

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) représentent les lésions de l’ADN les plus dangereuses, capables d’induire une perte substantielle d’informations génétiques et la disparition cellulaire. En réponse, les cellules utilisent deux mécanismes principaux pour la réparation des DSB : la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). Il est essentiel de quantifier l’efficacité de la NHEJ et de la RH séparément pour explorer les mécanismes et les facteurs pertinents associés à chacun. Le test NHEJ et le test HR sont des méthodes établies utilisées pour mesurer l’efficacité de leurs voies de réparation respectives. Ces méthodes reposent sur des plasmides méticuleusement conçus contenant un gène de protéine fluorescente verte (GFP) perturbé avec des sites de reconnaissance pour l’endonucléase I-SceI, qui induit des CDB. Ici, nous décrivons le test NHEJ extrachromosomique et le test HR, qui impliquent la co-transfectation de cellules HEK-293T avec des plasmides EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide exprimant I-SceI et un plasmide exprimant mCherry. Les résultats quantitatifs de l’efficacité de la NHEJ et de la HR sont obtenus en calculant le rapport entre les cellules GFP positives et les cellules mCherry-positives, tel que compté par cytométrie en flux. Contrairement aux tests chromosomiquement intégrés, ces tests extrachromosomiques sont plus adaptés à la réalisation d’études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires stables établies.

Introduction

Une cassure double brin de l’ADN (CDB) est la forme la plus délétère de dommages à l’ADN, conduisant potentiellement à l’instabilité du génome, à des réarrangements chromosomiques, à la sénescence cellulaire et à la mort cellulaire si elle n’est pas réparée rapidement¹. Deux voies bien établies, la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR), sont reconnues pour leur efficacité dans le traitement des DSB^de l’ADN ^2,3. La HR est considérée comme un mécanisme sans erreur pour la réparation des DSB, utilisant des séquences homologues dans la chromatide sœur comme modèle pour restaurer la configuration originale de la molécule d’ADN³ blessée. NHEJ, d’autre part, est une voie de réparation DSB sujette aux erreurs qui rejoint les extrémités d’ADN brisées sans s’appuyer sur un modèle².

Le test NHEJ et le test HR sont des méthodes classiques développées à l’origine dans le laboratoire de Jasin au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center et utilisées pour quantifier l’efficacité de NHEJ et HR, respectivement 4,5,6,7. Ces tests jouent un rôle crucial dans l’étude des mécanismes et des facteurs pertinents associés à la NHEJ et à HR 8,9,10,11,12,13,14. Les deux tests reposent sur la mise en œuvre de deux rapporteurs GFP perturbés, EJ5-GFP et DR-GFP, pour surveiller la réparation des DSB induite par l’endonucléase I-SceI. Le rapporteur EJ5-GFP est utilisé dans le test NHEJ, tandis que le rapporteur DR-GFP est utilisé dans le test HR. Chaque rapporteur est subtilement conçu de telle sorte que les DSB induites par I-SceI ne peuvent être réparées que par une voie de réparation spécifique pour restaurer une cassette d’expression GFP ^4,5.

Le test NHEJ et le test HR peuvent être effectués en utilisant une approche chromosomiquement intégrée ou extrachromosomique^15,16. L’approche chromosomiquement intégrée nécessite l’intégration des rapporteurs GFP perturbés dans le génome, permettant l’analyse de la réparation des DSB dans un contexte chromosomique ^6,15. Cependant, cette approche nécessite un passage cellulaire prolongé et ne convient pas aux études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires en raison de l’intégration chromosomique arbitraire, introduisant un facteur de confusion supplémentaire en plus des différences inhérentes. Dans ce protocole, nous décrivons le test NHEJ extrachromosomique et les tests HR, impliquant la transfection transitoire des plasmides GFP et I-SceI perturbés dans les cellules HEK-293T, suivie d’une analyse par cytométrie en flux (le flux de travail de l’expérience est illustré à la figure 1). Ces tests de rapporteur non intégrés ont été initialement rapportés par le laboratoire de Jasin pour étudier la réparation des réticulations interbrins d’ADN¹⁶ et ont été utilisés pour évaluer l’efficacité de la NHEJ et l’efficacité de la RH par plusieurs laboratoires 9,10,11,12,13,14,17,18,19, y compris le nôtre ¹¹. Ces approches extrachromosomiques facilitent l’analyse de la réparation des DSB dans des études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires stables établies.

Protocole

1. Isolement plasmidique

1. Transformez E. coli compétent avec les plasmides EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide exprimant I-SceI) et PCI2-HA-mCherry (plasmide exprimant mCherry) (voir Tableau des matériaux) en suivant le protocole de transformation standard²⁰.
   REMARQUE : PCI2-HA-mCherry peut être remplacé par d’autres plasmides exprimant mCherry ou DsRed.
2. Cultiver l’E. coli transformé dans 500 mL de milieu LB liquide complété par 100 μg/mL d’ampicilline pendant une nuit à 37 °C en agitant.
3. Isolez les plasmides à l’aide d’une trousse d’isolement de maxi de plasmides exempts d’endotoxines disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir la table des matériaux).
4. Quantifiez les concentrations de plasmides à l’aide de spectrophotomètres à microvolume nanodrop. Ajustez la concentration plasmidique à 1 μg/μL.

2. Préparation et transfection des cellules

1. Culture de cellules HEK-293T dans un milieu DMEM complété par 10 % de sérum de bovin fœtal. Assurez-vous que les cellules HEK-293T ou les cellules stables HEK-293T établies sont en bon état de croissance.
   REMARQUE : Les cellules congelées doivent subir au moins deux cycles de division avant la transfection.
2. La veille de la transfection, ensemencez les cellules HEK-293T dans une plaque à 6 puits à 2 × 10 à⁵ cellules/puits pour atteindre une confluence d’environ 60 % le lendemain.
3. Le jour de la transfection, confirmez la confluence cellulaire, en visant environ 60%. Pour l’essai NHEJ, transfecter les cellules d’échantillon expérimentales dans une plaque à 6 puits avec 1 μg de EJ5-GFP, 1 μg de pCBASceI et 1 μg de plasmides PCI2-HA-mCherry, à l’aide d’un réactif de transfection commercial en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour le test HR, remplacez le plasmide EJ5-GFP par le plasmide DR-GFP.
4. Pour les contrôles d’étalonnage FACS, laissez un puits de cellules non transfectées en tant que contrôle négatif. Transfectez les cellules dans une plaque à 6 puits avec soit (1) 1 μg d’EJ5-GFP (pour le test NHEJ) ou 1 μg de DR-GFP (pour le test HR), avec 1 μg de pCBASceI en tant que contrôle GFP monocolore, ou (2) 1 μg de PCI2-HA-mCherry en tant que contrôle monocolore mCherry.

3. Analyse des cellules GFP-positives et mCherry-positives par cytométrie en flux

1. Deux jours après la transfection, confirmer l’expression des protéines GFP et mCherry à l’aide d’un microscope fluorescent.
2. Trois jours après la transfection, retirez le milieu des puits, lavez-le une fois avec du PBS et ajoutez 500 μL de trypsine dans chaque puits. Incuber 5 min à 37 °C pour détacher toutes les cellules de la plaque. Tout au long de cette étape et des suivantes, protégez les cellules de la lumière directe.
3. Ajouter 500 μL de média DMEM complet dans chaque puits, remettre les cellules en suspension en s’assurant qu’aucun agglutinage n’est visible.
4. Transférez toutes les cellules de chaque puits dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml, puis centrifugez les cellules pendant 2 minutes à 1000 × g à température ambiante.
5. Retirez délicatement le surnageant par pipetage et lavez-le une fois avec 1,0 mL de PBS.
6. Encore une fois, retirez soigneusement le surnageant par pipetage, remettez les cellules en suspension dans 500 μL de PBS et transférez les cellules dans des tubes FACS (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Pour des résultats optimaux, commencez l’analyse par cytométrie en flux immédiatement après le prélèvement cellulaire. Alternativement, les cellules peuvent être stockées sur de la glace pendant plusieurs heures.
7. Étalonnez le FACS avec des cellules non transfectées (contrôle négatif), des cellules transfectées EJ5-GFP/DR-GFP et pCBASceI (contrôle monocolore GFP) et des cellules transfectées mCherry (contrôle monocolore mCherry). Ajustez la tension et la compensation pour minimiser le débordement de fluorescence entre GFP et mCherry.
8. Acquérir et enregistrer au moins 10 000 cellules intactes de chaque tube.

4. Analyse des données

REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées à l’aide du logiciel FlowJo (voir Tableau des matériaux) pour analyser les données FACS. Des procédures comparables peuvent être exécutées dans d’autres logiciels d’analyse.

1. Faites glisser tous les fichiers FACS dans le tableau de bord. Double-cliquez sur l’un des fichiers pour afficher le tracé FSC/SSC.
2. Créez une porte polygonale pour sélectionner les cellules intactes, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche. Nommez cette sous-population « Cellules intactes » et faites glisser cette porte vers la barre « Tous les échantillons ». Faites défiler chaque échantillon à l’aide du bouton Échantillon suivant pour vous assurer que le contrôle est approprié pour chaque échantillon (Figure 2A).
3. Double-cliquez sur la sous-population de cellules intactes de l’échantillon de contrôle négatif (cellules non transfectées) pour afficher un nouveau graphique. Remplacez les axes par FL1-H (axe x, GFP) et FL2-H (axe y, mCherry).
4. Sélectionnez l’outil Quad Gating et cliquez sur l’extrémité supérieure droite de la population de cellules négatives (Figure 2B). Faites glisser les quatre portes rectangulaires vers la barre « Cellules intactes ». Faites défiler des échantillons de commande GFP unicolore ou mCherry unicolore à l’aide du bouton Échantillon suivant pour vous assurer que la porte est appropriée pour distinguer les cellules GFP positives ou mCherry positives des cellules témoins négatives (Figure 2C,D). Affinez le gate du quadrant si nécessaire et appliquez ce gate à toutes les populations de « cellules intactes ».
5. Cliquez sur l’éditeur de mise en page. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les tracés représentatifs et choisissez Copier dans l’éditeur de modèle. Sélectionnez tous les tracés représentatifs, puis double-cliquez pour ouvrir Définition de graphique. Ajustez l’étiquette de l’axe, annotez et la légende comme vous le souhaitez.
6. Le pourcentage de cellules mCherry-positives dans les échantillons expérimentaux sert de contrôle de l’efficacité de transfection. Calculez l’efficacité relative de la réparation de l’ADN en comparant le nombre de cellules GFP positives avec le nombre de cellules mCherry positives dans le même graphique.

Résultats

Pour garantir la précision de l’analyse NHEJ et RH, la mise en œuvre d’une stratégie d’ajustement de la rémunération et de contrôle appropriée est nécessaire. En règle générale, la fluorescence de mCherry ne se manifeste pas dans le détecteur GFP lors de l’utilisation d’un filtre de 530 nm. Cependant, dans les cas de cellules présentant une expression extrêmement élevée de la GFP, la fluorescence de la GFP peut contaminer le détecteur mCherry lors de l’utilisation d’un filtre de 575 nm. Pou...

Discussion

La méthode décrite ici a été utilisée dans plusieurs articles pour évaluer l’efficacité du NHEJ et l’efficacité des RH 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Cette méthode est pertine...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056