JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

Özet

DNA çift sarmallı kırılmalar (DSB'ler), önemli genetik bilgi kaybına ve hücresel ölüme neden olabilen en tehlikeli DNA lezyonlarını temsil eder. Yanıt olarak, hücreler DSB onarımı için iki ana mekanizma kullanır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR). NHEJ ve İK'nın verimliliğini ayrı ayrı ölçmek, her biriyle ilişkili ilgili mekanizmaları ve faktörleri keşfetmek için çok önemlidir. NHEJ testi ve HR testi, ilgili onarım yollarının verimliliğini ölçmek için kullanılan yerleşik yöntemlerdir. Bu yöntemler, DSB'leri indükleyen endonükleaz I-SceI için tanıma bölgelerine sahip bozulmuş bir yeşil floresan protein (GFP) geni içeren titizlikle tasarlanmış plazmitlere dayanır. Burada, HEK-293T hücrelerinin EJ5-GFP/DR-GFP plazmitleri, plazmid eksprese eden bir I-SceI ve plazmid eksprese eden bir mCherry ile birlikte transfekte edilmesini içeren ekstrakromozomal NHEJ testini ve HR testini açıklıyoruz. NHEJ ve HR verimliliğinin kantitatif sonuçları, akış sitometrisi ile sayıldığı gibi, GFP pozitif hücrelerin mCherry pozitif hücrelere oranının hesaplanmasıyla elde edilir. Kromozomal olarak entegre tahlillerin aksine, bu ekstrakromozomal tahliller, birden fazla yerleşik stabil hücre hattını içeren karşılaştırmalı araştırmalar yürütmek için daha uygundur.

Giriş

DNA çift sarmallı kırılma (DSB), DNA hasarının en zararlı şeklidir ve derhal onarılmazsa potansiyel olarak genom kararsızlığına, kromozomal yeniden düzenlemelere, hücresel yaşlanmaya ve hücre ölümüne yol açar1. İki iyi bilinen yol, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR), DNA DSB'lerini 2,3 adreslemedeki etkinlikleri ile tanınmaktadır. HR, yaralı DNA molekülü3'ün orijinal konfigürasyonunu eski haline getirmek için bir şablon olarak kardeş kromatitteki homolog dizileri kullanan DSB onarımı için hatasız bir mekanizma olarak kabul edilir. Öte yandan NHEJ, herhangi bir şablon2'ye güvenmeden kırık DNA uçlarını birleştiren hataya açık bir DSB onarım yoludur.

NHEJ testi ve HR testi, orijinal olarak Jasin'in Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'ndeki laboratuvarında geliştirilen ve sırasıyla NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için kullanılan klasik yöntemlerdir 4,5,6,7. Bu tahliller, NHEJ ve HR 8,9,10,11,12,13,14 ile ilişkili ilgili mekanizmaların ve faktörlerin araştırılmasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Her iki test de, I-SceI endonükleaz tarafından indüklenen DSB'lerin onarımını izlemek için iki bozulmuş GFP raportörünün, EJ5-GFP ve DR-GFP'nin uygulanmasına dayanır. EJ5-GFP raportörü NHEJ tahlilinde kullanılırken, DR-GFP muhabiri İK tahlilinde kullanılır. Her raporlayıcı, I-SceI ile indüklenen DSB'lerin yalnızca bir GFP ekspresyon kasetini 4,5 geri yüklemek için belirli bir onarım yolu ile onarılabilmesi için ince bir şekilde tasarlanmıştır.

NHEJ testi ve HR testi, kromozomal olarak entegre veya ekstrakromozomal yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilebilir15,16. Kromozomal olarak entegre yaklaşım, bozulmuş GFP raportörlerinin genoma entegrasyonunu gerektirir ve DSB onarımının kromozomal bir bağlam içinde analizine izin verir 6,15. Bununla birlikte, bu yaklaşım uzun süreli hücre geçişi gerektirir ve keyfi kromozomal entegrasyon nedeniyle birden fazla hücre dizisini içeren karşılaştırmalı çalışmalar için uygun değildir, bu da doğal farklılıklardan ayrı olarak ek bir karıştırıcı faktör sunar. Bu protokolde, bozulmuş GFP ve I-SceI plazmitlerinin HEK-293T hücrelerine geçici transfeksiyonunu ve ardından akış sitometrisi analizini içeren ekstrakromozomal NHEJ testi ve HR testlerini açıklıyoruz (deney iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir). Bu entegre olmayan raportör tahlilleri ilk olarak Jasin'in laboratuvarı tarafından DNA iplikçikler arası çapraz bağ onarımını16 incelemek için rapor edildi ve bizimki de dahil olmak üzere çeşitli laboratuvarlar 9,10,11,12,13,14,17,18,19 tarafından NHEJ verimliliğini ve HR verimliliğini değerlendirmek için kullanıldı11. Bu ekstrakromozomal yaklaşımlar, birden fazla yerleşik stabil hücre hattını içeren karşılaştırmalı çalışmalarda DSB onarımının analizini kolaylaştırır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Plazmit izolasyonu

  1. Yetkin E. coli'yi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plazmidi eksprese eden I-SceI) ve PCI2-HA-mCherry (mCherry eksprese eden plazmit) ile dönüştürün (bkz. Malzeme Tablosu) standart dönüşüm protokolünü takiben20.
    NOT: PCI2-HA-mCherry, diğer mCherry veya DsRed eksprese eden plazmitlerle ikame edilebilir.
  2. Dönüştürülmüş E. coli'yi , 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 500 mL sıvı LB ortamında, gece boyunca 37 ° C'de çalkalayarak yetiştirin.
  3. Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen endotoksin içermeyen bir plazmid maksi izolasyon kiti kullanarak plazmitleri izole edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Nanodrop mikrohacim spektrofotometreleri kullanarak plazmit konsantrasyonlarını ölçün. Plazmit konsantrasyonunu 1 μg/μL'ye ayarlayın.

2. Hücre hazırlığı ve transfeksiyonu

  1. Kültür HEK-293T hücreleri% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM ortamında. HEK-293T hücrelerinin veya kurulu HEK-293T kararlı hücrelerinin iyi büyüme durumunda olduğundan emin olun.
    NOT: Donmuş hücreler, transfeksiyondan önce en az iki tur bölünmeye tabi tutulmalıdır.
  2. Transfeksiyondan bir gün önce, HEK-293T hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 2 × 105 hücre / kuyuda tohumlayın ve ertesi gün yaklaşık% 60 birleşme elde edin.
  3. Transfeksiyon gününde, yaklaşık% 60'ı hedefleyerek hücre birleşmesini onaylayın. NHEJ testi için, deneysel numune hücrelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanarak 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI ve 1 μg PCI2-HA-mCherry plazmidleri içeren 6 oyuklu bir plakada transfekte edin (bkz. HR testi için EJ5-GFP plazmidini DR-GFP plazmidi ile değiştirin.
  4. FACS kalibrasyon kontrolleri için, negatif kontrol olarak transfekte edilmemiş bir hücre kuyusu bırakın. Hücreleri 6 oyuklu bir plakada (1) 1 μg EJ5-GFP (NHEJ testi için) veya 1 μg DR-GFP (HR testi için), GFP tek renkli kontrol olarak 1 μg pCBASceI ile birlikte transfekte edin veya (2) mCherry tek renkli kontrol olarak 1 μg PCI2-HA-mCherry.

3. GFP-pozitif ve mCherry-pozitif hücrelerin akış sitometrisi ile analizi

  1. Transfeksiyondan iki gün sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak GFP ve mCherry proteinlerinin ekspresyonunu doğrulayın.
  2. Transfeksiyondan üç gün sonra, ortamı kuyucuklardan çıkarın, bir kez PBS ile yıkayın ve her oyuğa 500 μL tripsin ekleyin. Tüm hücreleri plakadan ayırmak için 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Bu ve sonraki adımlar boyunca, hücreleri doğrudan ışıktan koruyun.
  3. Her oyuğa 500 μL tam DMEM ortamı ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve hiçbir topaklanmanın görünmemesini sağlayın.
  4. Tüm hücreleri her bir kuyucuktan 1.5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın, ardından hücreleri oda sıcaklığında 1000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın ve bir kez 1.0 mL PBS ile yıkayın.
  6. Yine, süpernatanı pipetleme ile dikkatlice çıkarın, hücreleri 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri FACS tüplerine aktarın (bkz.
    NOT: En iyi sonuçlar için, hücre hasadından hemen sonra akış sitometrisi analizine başlayın. Alternatif olarak, hücreler birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.
  7. FACS'yi transfekte edilmemiş hücreler (negatif kontrol), EJ5-GFP/DR-GFP ve pCBASceI-transfekte edilmiş hücreler (GFP tek renk kontrolü) ve mCherry transfekte edilmiş hücreler (mCherry tek renk kontrolü) ile kalibre edin. GFP ve mCherry arasındaki floresan yayılmasını en aza indirmek için voltajı ve kompanzasyonunu ayarlayın.
  8. Her tüpten en az 10.000 sağlam hücre alın ve kaydedin.

4. Veri analizi

NOT: Aşağıdaki adımlar, FACS Verilerini analiz etmek için FlowJo yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak gerçekleştirilir. Alternatif analiz yazılımında benzer prosedürler yürütülebilir.

  1. Tüm FACS dosyalarını kontrol paneline sürükleyin. FSC/SSC grafiğini görüntülemek için dosyalardan birine çift tıklayın.
  2. Sol alt köşedeki kalıntıları hariç tutarak bozulmamış hücreleri seçmek için bir çokgen kapısı oluşturun. Bu alt popülasyonu "Bozulmamış Hücreler" olarak adlandırın ve bu geçidi "Tüm Örnekler" çubuğuna sürükleyin. Her numune için uygun geçitlemeyi sağlamak için Sonraki Sample düğmesini kullanarak her numunede ilerleyin (Şekil 2A).
  3. Yeni bir çizim oluşturmak için negatif kontrol örneğinin (transfekte edilmemiş hücreler) Bozulmamış Hücreler alt popülasyonuna çift tıklayın. Eksenleri FL1-H (x ekseni, GFP) ve FL2-H (y ekseni, mCherry) olarak değiştirin.
  4. Dörtlü Geçit aracını seçin ve negatif hücre popülasyonunun sağ üst ucuna tıklayın (Şekil 2B). Dört dikdörtgen kapıyı "Sağlam Hücreler" çubuğuna sürükleyin. GFP pozitif veya mCherry pozitifi negatif kontrol hücrelerinden ayırt etmek için uygun geçitlemeyi sağlamak için Sonraki Örnek düğmesini kullanarak GFP tek renk kontrolü veya mCherry tek renk kontrolü örnekleri arasında gezinin (Şekil 2C, D). Gerekirse kadran kapısına ince ayar yapın ve bu geçitlemeyi tüm "Sağlam Hücreler" popülasyonlarına uygulayın.
  5. Düzen düzenleyicisine tıklayın. Temsili grafiklere sağ tıklayın ve Düzen Düzenleyicisine Kopyala'yı seçin. Tüm temsili grafikleri seçin, ardından Grafik Tanımı'nı açmak için çift tıklayın. Eksen etiketini, açıklama eklemeyi ve göstergeyi istediğiniz gibi ayarlayın.
  6. Deneysel örneklerdeki mCherry pozitif hücrelerin yüzdesi, transfeksiyon verimliliği kontrolü olarak işlev görür. Aynı grafikteki GFP pozitif hücrelerin sayısını mCherry pozitif hücrelerin sayısıyla karşılaştırarak bağıl DNA onarım verimliliğini hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

NHEJ ve İK analizinin doğruluğunu sağlamak için, uygun bir tazminat ayarlaması ve geçit stratejisinin uygulanması gereklidir. Tipik olarak, mCherry floresansı, 530 nm'lik bir filtre kullanıldığında GFP dedektöründe ortaya çıkmaz. Bununla birlikte, son derece yüksek GFP ekspresyonu sergileyen hücrelerin örneklerinde, GFP floresansı, 575 nm'lik bir filtre kullanıldığında mCherry dedektörünü kirletebilir. Bu endişeleri gidermek için, kompanzasyon ve geçit stratejisini düzenlemek için negatif...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntem, NHEJ verimliliğini ve İK verimliliğini değerlendirmek için çeşitli makalelerde kullanılmıştır 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Bu yöntem, DNA DSB onar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

İfşa edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin'in Heilongjiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (YQ2022C036) ve Qiqihar Tıp Üniversitesi Lisansüstü İnovasyon Vakfı (QYYCX2022-06) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 1, MedPeer kullanılarak üretilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
6 cm dishes BBIF611202-9001
6 well platesCorning3516
AmpicillinBeyotimeST007Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent CellsTIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi Plasmid  kitTIANGENDP117alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubesFALCON352054
Fetal bovine serumCLARKFB25015
Flow cytometerBD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1Treestaralternative analysis software can be used
HEK-293T cellsNational Infrastructure of Cell Line Resource1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015alternative transfection regents can be used
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherryalternative plasmids containing DsRed can be used
TrypsinGibco25200-056

Referanslar

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
  3. Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
  4. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  5. Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
  7. Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
  8. Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
  9. Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
  10. Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
  11. Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
  12. Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
  13. Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
  14. Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
  15. Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
  16. Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
  17. Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
  18. Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
  19. Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
  21. Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

NHEJHomolog RekombinasyonDNA ift plikli K r lmalarGFP Raport r SistemiHEK 293T H creleriFlow SitometrisiEkstrakromozomal DeneyI SceI Endon kleaz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır