HEK-293T Hücrelerinde Homolog Olmayan Uç Birleştirme ve Homolog Rekombinasyon Etkinliğinin GFP Tabanlı Raporlayıcı Sistemler Kullanılarak Analizi

Özet

Bu protokol, HEK-293T hücrelerinde NHEJ ve HR'nin etkinliğini ölçmek için bir ekstrakromozomal homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) testi ve homolog rekombinasyon (HR) testini tanımlar.

Özet

DNA çift sarmallı kırılmalar (DSB'ler), önemli genetik bilgi kaybına ve hücresel ölüme neden olabilen en tehlikeli DNA lezyonlarını temsil eder. Yanıt olarak, hücreler DSB onarımı için iki ana mekanizma kullanır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR). NHEJ ve İK'nın verimliliğini ayrı ayrı ölçmek, her biriyle ilişkili ilgili mekanizmaları ve faktörleri keşfetmek için çok önemlidir. NHEJ testi ve HR testi, ilgili onarım yollarının verimliliğini ölçmek için kullanılan yerleşik yöntemlerdir. Bu yöntemler, DSB'leri indükleyen endonükleaz I-SceI için tanıma bölgelerine sahip bozulmuş bir yeşil floresan protein (GFP) geni içeren titizlikle tasarlanmış plazmitlere dayanır. Burada, HEK-293T hücrelerinin EJ5-GFP/DR-GFP plazmitleri, plazmid eksprese eden bir I-SceI ve plazmid eksprese eden bir mCherry ile birlikte transfekte edilmesini içeren ekstrakromozomal NHEJ testini ve HR testini açıklıyoruz. NHEJ ve HR verimliliğinin kantitatif sonuçları, akış sitometrisi ile sayıldığı gibi, GFP pozitif hücrelerin mCherry pozitif hücrelere oranının hesaplanmasıyla elde edilir. Kromozomal olarak entegre tahlillerin aksine, bu ekstrakromozomal tahliller, birden fazla yerleşik stabil hücre hattını içeren karşılaştırmalı araştırmalar yürütmek için daha uygundur.

Giriş

DNA çift sarmallı kırılma (DSB), DNA hasarının en zararlı şeklidir ve derhal onarılmazsa potansiyel olarak genom kararsızlığına, kromozomal yeniden düzenlemelere, hücresel yaşlanmaya ve hücre ölümüne yol açar¹. İki iyi bilinen yol, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR), DNA DSB'lerini ^2,3 adreslemedeki etkinlikleri ile tanınmaktadır. HR, yaralı DNA molekülü^3'ün orijinal konfigürasyonunu eski haline getirmek için bir şablon olarak kardeş kromatitteki homolog dizileri kullanan DSB onarımı için hatasız bir mekanizm....

Protokol

1. Plazmit izolasyonu

1. Yetkin E. coli'yi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plazmidi eksprese eden I-SceI) ve PCI2-HA-mCherry (mCherry eksprese eden plazmit) ile dönüştürün (bkz. Malzeme Tablosu) standart dönüşüm protokolünü takiben²⁰.
   NOT: PCI2-HA-mCherry, diğer mCherry veya DsRed eksprese eden plazmitlerle ikame edilebilir.
2. Dönüştürülmüş E. coli'yi , 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 500 mL sıvı LB ortamında, gece boyunca 37 ° C'de çalkalayarak yetiştirin.
3. Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen endotoksin içermeyen bir plazmid ....

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntem, NHEJ verimliliğini ve İK verimliliğini değerlendirmek için çeşitli makalelerde kullanılmıştır 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Bu yöntem, DNA DSB onar.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056