Análise da Eficiência de Junção de Extremidade Não Homóloga e Recombinação Homóloga em Células HEK-293T Usando Sistemas Reporter Baseados em GFP

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio extracromossômico de junção final não homóloga (NHEJ) e um ensaio de recombinação homóloga (HR) para quantificar a eficiência de NHEJ e HR em células HEK-293T.

Resumo

As quebras de fita dupla de DNA (DSBs) representam as lesões de DNA mais perigosas, capazes de induzir perda substancial de informação genética e morte celular. Em resposta, as células empregam dois mecanismos primários para o reparo de DSB: junção final não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR). Quantificar a eficiência do NHEJ e da FC separadamente é crucial para explorar os mecanismos e fatores relevantes associados a cada um. O ensaio NHEJ e o ensaio HR são métodos estabelecidos usados para medir a eficiência de suas respectivas vias de reparo. Esses métodos dependem de plasmídeos meticulosamente projetados contendo um gene de proteína fluorescente verde (GFP) interrompido com locais de reconhecimento para endonuclease I-SceI, que induz DSBs. Aqui, descrevemos o ensaio extracromossômico NHEJ e o ensaio HR, que envolvem a co-transfecção de células HEK-293T com plasmídeos EJ5-GFP/DR-GFP, um plasmídeo que expressa I-SceI e um plasmídeo que expressa mCherry. Os resultados quantitativos da eficiência de NHEJ e HR são obtidos calculando a proporção de células positivas para GFP e células positivas para mCherry, conforme contado por citometria de fluxo. Em contraste com os ensaios cromossomicamente integrados, esses ensaios extracromossômicos são mais adequados para a realização de investigações comparativas envolvendo várias linhagens celulares estáveis estabelecidas.

Introdução

Uma quebra de fita dupla de DNA (DSB) é a forma mais deletéria de dano ao DNA, potencialmente levando à instabilidade do genoma, rearranjos cromossômicos, senescência celular e morte celular se não for reparada prontamente¹. Duas vias bem estabelecidas, junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR), são reconhecidas por sua eficácia no tratamento de DSBs de DNA ^2,3. A HR é considerada um mecanismo livre de erros para o reparo de DSB, utilizando sequências homólogas na cromátide irmã como modelo para restaurar a configuração original da molé....

Protocolo

1. Isolamento de plasmídeo

1. Transformar E. coli competente com os plasmídeos EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmídeo que expressa I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmídeo que expressa mCherry) (ver Tabela de Materiais) seguindo o protocolo de transformação padrão²⁰.
   NOTA: PCI2-HA-mCherry pode ser substituído por outros plasmídeos que expressam mCherry ou DsRed.
2. Cultive a E. coli transformada em 500 mL de meio LB líquido suplementado com 100 μg / mL de ampicilina durante a noite a 37 ° C com agitação.
3. Isole os plasmídeos usando um kit de isolamento maxi de pla....

Discussão

O método aqui descrito tem sido empregado em vários trabalhos para avaliar a eficiência do NHEJ e a eficiência da FC 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Este método é pertinente para eluc.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056