Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

Riepilogo

Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.

Abstract

Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) rappresentano le lesioni del DNA più pericolose, in grado di indurre una sostanziale perdita di informazioni genetiche e la morte cellulare. In risposta, le cellule impiegano due meccanismi primari per la riparazione del DSB: l'unione delle estremità non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). Quantificare separatamente l'efficienza di NHEJ e HR è fondamentale per esplorare i meccanismi e i fattori rilevanti associati a ciascuno. Il test NHEJ e il test HR sono metodi consolidati utilizzati per misurare l'efficienza dei rispettivi percorsi di riparazione. Questi metodi si basano su plasmidi meticolosamente progettati contenenti un gene della proteina fluorescente verde (GFP) interrotto con siti di riconoscimento per l'endonucleasi I-SceI, che induce DSB. Qui, descriviamo il saggio NHEJ extracromosomico e il saggio HR, che comportano la co-trasfezione di cellule HEK-293T con plasmidi EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide che esprime I-SceI e un plasmide che esprime mCherry. I risultati quantitativi dell'efficienza NHEJ e HR si ottengono calcolando il rapporto tra le cellule GFP-positive e le cellule mCherry-positive, come contato mediante citometria a flusso. A differenza dei saggi cromosomicamente integrati, questi saggi extracromosomici sono più adatti per condurre indagini comparative che coinvolgono più linee cellulari stabili stabili.

Introduzione

Una rottura del doppio filamento di DNA (DSB) è la forma più deleteria di danno al DNA, che può portare a instabilità del genoma, riarrangiamenti cromosomici, senescenza cellulare e morte cellulare se non riparata prontamente¹. Due vie ben consolidate, l'unione delle estremità non omologhe (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR), sono riconosciute per la loro efficacia nell'affrontare i DSB^{del DNA 2,3}. L'HR è considerato un meccanismo privo di errori per la riparazione del DSB, utilizzando sequenze omologhe nel cromatide fratello come modello per ripristinare la configurazione originale della molecola di DNA danneggiata³. NHEJ, d'altra parte, è un percorso di riparazione DSB soggetto a errori che unisce le estremità del DNA rotte senza fare affidamento su alcun modello².

Il test NHEJ e il test HR sono metodi classici originariamente sviluppati nel laboratorio di Jasin presso il Memorial Sloan-Kettering Cancer Center e utilizzati per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR, rispettivamente 4,5,6,7. Questi saggi svolgono un ruolo cruciale nello studio dei meccanismi e dei fattori rilevanti associati a NHEJ e HR 8,9,10,11,12,13,14. Entrambi i test si basano sull'implementazione di due reporter GFP interrotti, EJ5-GFP e DR-GFP, per monitorare la riparazione dei DSB indotta dall'endonucleasi I-SceI. Il reporter EJ5-GFP è impiegato nel test NHEJ, mentre il reporter DR-GFP è utilizzato nel test HR. Ogni reporter è sottilmente progettato in modo che i DSB indotti da I-Scepossano essere riparati solo da una specifica via di riparazione per ripristinare una cassetta di espressione GFP ^4,5.

Il test NHEJ e il test HR possono essere condotti utilizzando un approccio cromosomicamente integrato o extracromosomico^15,16. L'approccio cromosomicamente integrato richiede l'integrazione dei reporter GFP interrotti nel genoma, consentendo l'analisi della riparazione DSB all'interno di un contesto cromosomico ^6,15. Tuttavia, questo approccio richiede un passaggio cellulare prolungato e non è adatto per studi comparativi che coinvolgono più linee cellulari a causa di un'integrazione cromosomica arbitraria, introducendo un ulteriore fattore di confusione oltre alle differenze intrinseche. In questo protocollo, descriviamo il saggio NHEJ extracromosomico e i saggi HR, che coinvolgono la trasfezione transitoria dei plasmidi GFP e I-SceI interrotti in cellule HEK-293T, seguita da analisi di citometria a flusso (il flusso di lavoro dell'esperimento è mostrato nella Figura 1). Questi saggi reporter non integrati sono stati originariamente riportati dal laboratorio di Jasin per studiare la riparazione dei legami incrociati tra i filamenti di DNA¹⁶ e sono stati impiegati per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza HR da diversi laboratori 9,10,11,12,13,14,17,18,19, incluso il nostro ¹¹. Questi approcci extracromosomici facilitano l'analisi della riparazione del DSB in studi comparativi che coinvolgono più linee cellulari stabili stabili.

Protocollo

1. Isolamento plasmidico

1. Trasformare E. coli competente con i plasmidi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide che esprime I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmide che esprime mCherry) (vedi Tabella dei materiali) seguendo il protocollo di trasformazione standard²⁰.
   NOTA: PCI2-HA-mCherry può essere sostituito con altri plasmidi che esprimono mCherry o DsRed.
2. Coltivare l'E. coli trasformato in 500 mL di terreno LB liquido integrato con 100 μg/mL di ampicillina per una notte a 37 °C con agitazione.
3. Isolare i plasmidi utilizzando un maxi kit di isolamento plasmidico privo di endotossine disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
4. Quantificare le concentrazioni di plasmidi utilizzando spettrofotometri a microvolume nanodrop. Regolare la concentrazione del plasmide a 1 μg/μL.

2. Preparazione e trasfezione cellulare

1. Coltura di cellule HEK-293T in terreno DMEM integrate con il 10% di siero fetale bovino. Assicurarsi che le cellule HEK-293T o le cellule stabili HEK-293T siano in buono stato di crescita.
   NOTA: Le celle congelate devono essere sottoposte ad almeno due cicli di scissione prima della trasfezione.
2. Il giorno prima della trasfezione, seminare le cellule HEK-293T in una piastra a 6 pozzetti a 2 × 10⁵ cellule/pozzetto per ottenere una confluenza di circa il 60% il giorno successivo.
3. Il giorno della trasfezione, confermare la confluenza cellulare, puntando a circa il 60%. Per il test NHEJ, trasfettare le cellule del campione sperimentale in una piastra a 6 pozzetti con 1 μg di EJ5-GFP, 1 μg di pCBASceI e 1 μg di plasmidi PCI2-HA-mCherry, utilizzando un reagente di trasfezione commerciale seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Per il test HR, sostituire il plasmide EJ5-GFP con il plasmide DR-GFP.
4. Per i controlli di calibrazione FACS, lasciare un pozzetto di cellule non trasfettate come controllo negativo. Tranfettare le cellule in una piastra a 6 pozzetti con (1) 1 μg di EJ5-GFP (per il test NHEJ) o 1 μg di DR-GFP (per il test HR), insieme a 1 μg di pCBASceI come controllo GFP a colore singolo, o (2) 1 μg di PCI2-HA-mCherry come controllo mCherry a colore singolo.

3. Analisi delle cellule GFP-positive e mCherry-positive mediante citometria a flusso

1. Due giorni dopo la trasfezione, confermare l'espressione delle proteine GFP e mCherry utilizzando un microscopio a fluorescenza.
2. Tre giorni dopo la trasfezione, rimuovere il terreno dai pozzetti, lavare una volta con PBS e aggiungere 500 μL di tripsina a ciascun pozzetto. Incubare per 5 minuti a 37 °C per staccare tutte le cellule dalla piastra. Durante questo e i passaggi successivi, proteggi le celle dalla luce diretta.
3. Aggiungere 500 μl di terreno DMEM completo a ciascun pozzetto, risospendere le cellule, assicurandosi che non siano visibili grumi.
4. Trasferire tutte le cellule da ciascun pozzetto in provette da centrifuga da 1,5 mL, quindi centrifugare le celle per 2 minuti a 1000 × g a temperatura ambiente.
5. Rimuovere con cautela il surnatante mediante pipettaggio e lavare una volta con 1,0 mL di PBS.
6. Anche in questo caso, rimuovere con cura il surnatante mediante pipettaggio, risospendere le cellule in 500 μl di PBS e trasferire le cellule in provette FACS (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Per ottenere risultati ottimali, iniziare l'analisi della citometria a flusso subito dopo il prelievo delle cellule. In alternativa, le cellule possono essere conservate sul ghiaccio per diverse ore.
7. Calibrare il FACS con celle non trasfettate (controllo negativo), celle trasfettate EJ5-GFP/DR-GFP e pCBASceI (controllo monocolore GFP) e celle trasfettate mCherry (controllo monocolore mCherry). Regolare la tensione e la compensazione per ridurre al minimo lo spillover della fluorescenza tra GFP e mCherry.
8. Acquisire e registrare almeno 10.000 cellule intatte da ciascuna provetta.

4. Analisi dei dati

NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti utilizzando il software FlowJo (vedere la tabella dei materiali) per analizzare i dati FACS. Procedure comparabili possono essere eseguite in software di analisi alternativi.

1. Trascinare tutti i file FACS nel dashboard. Fare doppio clic su uno dei file per visualizzare il grafico FSC/SSC.
2. Crea un cancello poligonale per selezionare le celle intatte, esclusi i detriti nell'angolo in basso a sinistra. Assegna a questa sottopopolazione il nome "Celle intatte" e trascina questo cancello sulla barra "Tutti i campioni". Scorrere ogni campione utilizzando il pulsante Campione successivo per garantire un gating appropriato per ciascun campione (Figura 2A).
3. Fare doppio clic sulla sottopopolazione Celle intatte del campione di controllo negativo (cellule non trasfettate) per visualizzare un nuovo grafico. Modificare gli assi in FL1-H (asse x, GFP) e FL2-H (asse y, mCherry).
4. Selezionare lo strumento Quad Gating e fare clic sull'estremità superiore destra della popolazione di celle negative (Figura 2B). Trascina i quattro cancelli rettangolari sulla barra "Celle intatte". Scorrere i campioni del controllo a colore singolo GFP o del controllo a colore singolo mCherry utilizzando il pulsante Campione successivo per garantire un gating appropriato per discriminare le celle di controllo GFP-positive o mCherry positive da quelle negative (Figura 2C,D). Se necessario, regolare il gating del quadrante e applicarlo a tutte le popolazioni di "Celle intatte".
5. Fare clic sull'editor di layout. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui grafici rappresentativi e scegliere Copia nell'editor di layout. Selezionare tutti i grafici rappresentativi, quindi fare doppio clic per aprire Definizione grafico. Regolare l'etichetta, l'annotazione e la legenda dell'asse come desiderato.
6. La percentuale di cellule mCherry-positive nei campioni sperimentali funge da controllo dell'efficienza della trasfezione. Calcola l'efficienza relativa della riparazione del DNA confrontando il numero di cellule GFP-positive con il numero di cellule mCherry-positive nello stesso grafico.

Risultati

Per garantire l'accuratezza dell'analisi NHEJ e HR, è necessaria l'implementazione di un'adeguata strategia di adeguamento retributivo e di gating. Tipicamente, la fluorescenza di mCherry non si manifesta nel rivelatore GFP quando si utilizza un filtro da 530 nm. Tuttavia, nei casi di cellule che presentano un'espressione estremamente elevata di GFP, la fluorescenza GFP può contaminare il rivelatore mCherry quando si utilizza un filtro a 575 nm. Per affrontare queste preoccupazioni, sono stati utilizzati campioni di co...

Discussione

Il metodo qui descritto è stato impiegato in diversi articoli per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Questo metodo è pertinente per chiarire i me...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056