JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описываются экстрахромосомные негомологические тесты на соединение концов (NHEJ) и гомологичные рекомбинационные анализы (HR) для количественной оценки эффективности NHEJ и HR в клетках HEK-293T.

Аннотация

Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой наиболее опасные повреждения ДНК, способные вызвать значительную потерю генетической информации и гибель клеток. В ответ на это клетки используют два основных механизма репарации DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Количественная оценка эффективности NHEJ и HR по отдельности имеет решающее значение для изучения соответствующих механизмов и факторов, связанных с каждым из них. Анализ NHEJ и анализ HR являются установленными методами, используемыми для измерения эффективности соответствующих путей восстановления. Эти методы основаны на тщательно спроектированных плазмидах, содержащих разрушенный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) с сайтами узнавания эндонуклеазы I-SceI, которая индуцирует DSB. В данной работе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, которые включают совместную трансфекцию клеток HEK-293T с плазмидами EJ5-GFP/DR-GFP, экспрессирующую плазмиду I-SceI и экспрессирующую плазмиду mCherry. Количественные результаты эффективности NHEJ и HR получены путем расчета соотношения GFP-положительных клеток к mCherry-положительным клеткам, подсчитанным с помощью проточной цитометрии. В отличие от хромосомно-интегрированных анализов, эти внехромосомные анализы больше подходят для проведения сравнительных исследований с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.

Введение

Двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) является наиболее опасной формой повреждения ДНК, потенциально приводящей к нестабильности генома, хромосомным перестройкам, клеточному старению и гибели клеток, если его своевременно не восстановить. Два хорошо установленных пути, негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR), признаны эффективными в работе с DSB ДНК 2,3. HR считается безошибочным механизмом репарации DSB, использующим гомологичные последовательности в сестринской хроматиде в качестве матрицы для восстановления исходной конфигурации поврежденной молекулы ДНК3. NHEJ, с другой стороны, представляет собой подверженный ошибкам путь репарации DSB, который соединяет поврежденные концы ДНК, не полагаясь на какой-либо шаблон2.

Анализ NHEJ и анализ HR являются классическими методами, первоначально разработанными в лаборатории Ясина в Мемориальном онкологическом центре им. Слоуна-Кеттеринга и используемыми для количественной оценки эффективности NHEJ и HR соответственно 4,5,6,7. Эти анализы играют решающую роль в исследовании соответствующих механизмов и факторов, связанных с NHEJ и HR 8,9,10,11,12,13,14. Оба анализа основаны на использовании двух нарушенных репортеров GFP, EJ5-GFP и DR-GFP, для мониторинга репарации DSB, индуцированной эндонуклеазой I-SceI. Репортер EJ5-GFP используется в анализе NHEJ, в то время как репортер DR-GFP используется в анализе HR. Каждый репортер тонко спроектирован таким образом, что индуцированные I-Sce I-индуцированныеDSB могут быть восстановлены только с помощью определенного пути репарации для восстановления кассеты с экспрессией GFP 4,5.

Анализ NHEJ и анализ HR могут быть проведены с использованием либо хромосомно-интегрированного, либо внехромосомного подхода15,16. Хромосомно-интегрированный подход требует интеграции нарушенных репортеров GFP в геном, что позволяет анализировать репарацию DSB в хромосомном контексте 6,15. Тем не менее, этот подход требует длительного пассирования клеток и не подходит для сравнительных исследований с участием нескольких клеточных линий из-за произвольной хромосомной интеграции, что вносит дополнительный искажающий фактор, помимо присущих ему различий. В этом протоколе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, включающий транзиторную трансфекцию разрушенных плазмид GFP и I-SceI в клетки HEK-293T с последующим анализом проточной цитометрии (рабочий процесс эксперимента показан на рисунке 1). Эти неинтегрированные репортерные анализы были первоначально представлены лабораторией Джасина для изучения репарации межцепочечных связей ДНК16 и использовались для оценки эффективности NHEJ и эффективности HR несколькими лабораториями 9,10,11,12,13,14,17,18,19, включая нашу 11. Эти экстрахромосомные подходы облегчают анализ репарации DSB в сравнительных исследованиях с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Выделение плазмид

  1. Трансформируйте компетентную E. coli с плазмидами EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (экспрессирующая плазмида I-SceI) и PCI2-HA-mCherry (экспрессирующая плазмида mCherry) (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартным протоколом трансформации20.
    Примечание: PCI2-HA-mCherry может быть заменен другими экспрессирующими mCherry или DsRed плазмидами.
  2. Трансформированную кишечную палочку культивируют в 500 мл жидкой среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в течение ночи при 37 °С с встряхиванием.
  3. Изолируйте плазмиды с помощью имеющегося в продаже набора для макси-изоляции плазмид, не содержащего эндотоксинов, в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  4. Количественное определение концентраций плазмид с помощью нанокапельных микрообъемных спектрофотометров. Отрегулируйте концентрацию плазмид до 1 мкг/л.

2. Клеточный препарирование и трансфекция

  1. Культура клеток HEK-293T в среде DMEM дополнена 10% фетальной бычьей сывороткой. Убедитесь, что клетки HEK-293T или стабильные клетки HEK-293T находятся в хорошем состоянии роста.
    Примечание: Замороженные клетки должны пройти не менее двух раундов расщепления перед трансфекцией.
  2. За день до трансфекции засейте клетки HEK-293T в 6-луночный планшет с концентрацией 2 × 105 клеток/лунку, чтобы достичь около 60% конфлюенции на следующий день.
  3. В день трансфекции подтвердите слияние клеток, стремясь примерно к 60%. Для проведения анализа NHEJ трансфицируют клетки экспериментального образца в 6-луночный планшет 1 г EJ5-GFP, 1 г pCBASceI и 1 г плазмид PCI2-HA-mCherry с использованием коммерческого реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для анализа HR замените плазмиду EJ5-GFP на плазмиду DR-GFP.
  4. Для контроля калибровки FACS оставьте лунку с клетками нетрансфицированной в качестве отрицательного контроля. Трансфектируйте клетки в 6-луночном планшете либо (1) 1 мкг EJ5-GFP (для анализа NHEJ), либо 1 мкг DR-GFP (для анализа HR), вместе с 1 мкг pCBASceI в качестве одноцветного контроля GFP, либо (2) 1 мкг PCI2-HA-mCherry в качестве одноцветного контроля mCherry.

3. Анализ GFP-положительных и mCherry-положительных клеток методом проточной цитометрии

  1. Через два дня после трансфекции подтвердите экспрессию белков GFP и mCherry с помощью флуоресцентного микроскопа.
  2. Через три дня после трансфекции удалите среду из лунок, промойте один раз PBS и добавьте в каждую лунку по 500 мкл трипсина. Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C, чтобы отделить все клетки от планшета. На протяжении этого и последующих этапов защищайте клетки от прямого света.
  3. Добавьте 500 мкл полной среды DMEM в каждую лунку, повторно суспендируйте клетки, убедившись, что комки не видны.
  4. Переложите все ячейки из каждой лунки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, затем центрифугируйте ячейки в течение 2 минут при 1000 × г при комнатной температуре.
  5. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования и промойте один раз 1,0 мл PBS.
  6. Снова осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, повторно суспендируйте клетки в 500 мкл PBS и переведите клетки в трубки FACS (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов начните анализ проточной цитометрии сразу после забора клеток. Как вариант, клетки можно хранить на льду в течение нескольких часов.
  7. Откалибруйте FACS с нетрансфицированными клетками (отрицательный контроль), EJ5-GFP/DR-GFP и pCBASceI-трансфицированными клетками (одноцветный контроль GFP) и mCherry-трансфицированными клетками (одноцветный контроль mCherry). Отрегулируйте напряжение и компенсацию, чтобы свести к минимуму переток флуоресценции между GFP и mCherry.
  8. Получите и зарегистрируйте не менее 10 000 неповрежденных клеток из каждой пробирки.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются с помощью программного обеспечения FlowJo (см. Таблицу материалов) для анализа данных FACS. Аналогичные процедуры могут быть выполнены в альтернативном аналитическом программном обеспечении.

  1. Перетащите все файлы FACS на панель управления. Дважды щелкните один из файлов, чтобы отобразить график FSC/SSC.
  2. Создайте полигональный ворот для выбора неповрежденных ячеек, исключив мусор в левом нижнем углу. Назовите эту субпопуляцию "Intact Cells" и перетащите этот элемент на панель "All Samples". Прокрутите каждый образец с помощью кнопки «Следующий образец», чтобы убедиться в подходящем стробировании для каждого образца (рисунок 2A).
  3. Дважды щелкните по субпопуляции «Интактные клетки » отрицательного контрольного образца (нетрансфицированные клетки), чтобы открыть новый график. Измените оси на FL1-H (ось x, GFP) и FL2-H (ось y, mCherry).
  4. Выберите инструмент Quad Gating и щелкните по верхнему правому крайнему значению популяции отрицательных клеток (Рисунок 2B). Перетащите четыре прямоугольных ворота на панель «Неповрежденные клетки». Прокрутите образцы одноцветного элемента управления GFP или одноцветного элемента управления mCherry с помощью кнопки «Следующий образец», чтобы обеспечить соответствующее стробирование для различения GFP-положительных или mCherry-положительных клеток от отрицательных контрольных клеток (рис. 2C, D). При необходимости настройте стробирование квадранта и примените это стробирование ко всем популяциям «Интактных клеток».
  5. Нажмите на редактор макетов. Щелкните правой кнопкой мыши на репрезентативных графиках и выберите «Копировать в редактор компоновок». Выберите все репрезентативные графики, затем дважды щелкните, чтобы открыть окно «Определение графика». При необходимости настройте метку оси, аннотацию и легенду.
  6. Процент mCherry-положительных клеток в экспериментальных образцах служит для контроля эффективности трансфекции. Рассчитайте относительную эффективность репарации ДНК, сравнив количество GFP-положительных клеток с количеством mCherry-положительных клеток на том же графике.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для обеспечения точности анализа NHEJ и HR необходимо внедрить подходящую стратегию корректировки компенсации и стробирования. Как правило, флуоресценция mCherry не проявляется в детекторе GFP при использовании фильтра 530 нм. Однако в тех случаях, когда клетки демонстрируют чрезвычайно высок...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описанный здесь метод был использован в нескольких работах для оценки эффективности NHEJ и эффективности управления персоналом 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нет никаких конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование финансировалось Фондом естественных наук провинции Хэйлунцзян в Китае (YQ2022C036) и Фондом инноваций для выпускников Медицинского университета Цицикар (QYYCX2022-06). Рисунок 1 получен с использованием MedPeer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6 cm dishes BBIF611202-9001
6 well platesCorning3516
AmpicillinBeyotimeST007Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent CellsTIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi Plasmid  kitTIANGENDP117alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubesFALCON352054
Fetal bovine serumCLARKFB25015
Flow cytometerBD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1Treestaralternative analysis software can be used
HEK-293T cellsNational Infrastructure of Cell Line Resource1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015alternative transfection regents can be used
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherryalternative plasmids containing DsRed can be used
TrypsinGibco25200-056

Ссылки

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
  3. Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
  4. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  5. Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
  7. Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
  8. Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
  9. Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
  10. Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
  11. Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
  12. Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
  13. Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
  14. Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
  15. Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
  16. Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
  17. Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
  18. Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
  19. Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
  21. Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

NHEJGFPHEK 293Ti SceI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены