Análisis de la unión de extremos no homólogos y la eficiencia de recombinación homóloga en células HEK-293T utilizando sistemas reporteros basados en GFP

Resumen

Este protocolo describe un ensayo extracromosómico de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y un ensayo de recombinación homóloga (HR) para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR en células HEK-293T.

Resumen

Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) representan las lesiones de ADN más peligrosas, capaces de inducir una pérdida sustancial de información genética y la muerte celular. En respuesta, las células emplean dos mecanismos principales para la reparación de DSB: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Cuantificar la eficiencia de la NHEJ y la HR por separado es crucial para explorar los mecanismos y factores relevantes asociados con cada uno. El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos establecidos que se utilizan para medir la eficiencia de sus respectivas vías de reparación. Estos métodos se basan en plásmidos meticulosamente diseñados que contienen un gen de proteína verde fluorescente (GFP) interrumpido con sitios de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI, que induce DSB. Aquí, describimos el ensayo extracromosómico NHEJ y el ensayo HR, que implican la co-transfección de células HEK-293T con plásmidos EJ5-GFP/DR-GFP, un plásmido que expresa I-SceI y un plásmido que expresa mCherry. Los resultados cuantitativos de la eficiencia de NHEJ y HR se obtienen calculando la proporción de células positivas para GFP y células mCherry positivas, según se cuentan mediante citometría de flujo. A diferencia de los ensayos cromosómicamente integrados, estos ensayos extracromosómicos son más adecuados para realizar investigaciones comparativas que involucran múltiples líneas celulares estables establecidas.

Introducción

Una rotura de doble cadena de ADN (DSB) es la forma más deletérea de daño en el ADN, que puede provocar inestabilidad del genoma, reordenamientos cromosómicos, senescencia celular y muerte celular si no se repara^con prontitud. Dos vías bien establecidas, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR), son reconocidas por su eficacia en el tratamiento de los DSB de ADN ^2,3. HR se considera un mecanismo libre de errores para la reparación de DSB, utilizando secuencias homólogas en la cromátida hermana como plantilla para restaurar la config....

Protocolo

1. Aislamiento de plásmidos

1. Transformar E. coli competente con los plásmidos EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plásmido que expresa I-Sce I) y PCI2-HA-mCherry (plásmido que expresa mCherry) (ver Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo de transformación estándar²⁰.
   NOTA: PCI2-HA-mCherry puede ser sustituido por otros plásmidos que expresen mCherry o DsRed.
2. Cultivar la E. coli transformada en 500 mL de medio LB líquido suplementado con 100 μg/mL de ampicilina durante la noche a 37 °C con agitación.
3. Aísle los plásmidos utilizando un kit de aislamiento maxi d....

Discusión

El método aquí descrito ha sido empleado en varios trabajos para evaluar la eficiencia de la NHEJ y la eficiencia de la HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Este método es pertinente para .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056