ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

Abstract

שברי DNA דו-גדיליים (DSBs) מייצגים את נגעי הדנ"א המסוכנים ביותר, המסוגלים לגרום לאובדן מידע גנטי משמעותי ולמוות תאי. בתגובה, תאים משתמשים בשני מנגנונים עיקריים לתיקון DSB: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR). כימות היעילות של NHEJ ומשאבי אנוש בנפרד הוא חיוני לבחינת המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים לכל אחד מהם. בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות מבוססות המשמשות למדידת היעילות של מסלולי התיקון שלהם. שיטות אלה מסתמכות על פלסמידים שתוכננו בקפידה המכילים גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משובש (GFP) עם אתרי זיהוי עבור אנדונוקלאז I-SceI, אשר משרה DSBs. כאן, אנו מתארים את בדיקת NHEJ החוץ-כרומוזומלית ובדיקת HR, הכוללים העברה משותפת של תאי HEK-293T עם פלסמידים EJ5-GFP/DR-GFP, פלסמיד המבטא I-SceI ופלסמיד המבטא mCherry. תוצאות כמותיות של יעילות NHEJ ו- HR מתקבלות על ידי חישוב היחס בין תאים חיוביים ל- GFP לתאים חיוביים mCherry, כפי שנספר על ידי ציטומטריית זרימה. בניגוד לבדיקות משולבות כרומוזומלית, בדיקות חוץ-כרומוזומליות אלה מתאימות יותר לביצוע חקירות השוואתיות המערבות מספר קווי תאים יציבים מבוססים.

Introduction

שבר דנ"א דו-גדילי (DSB) הוא הצורה המזיקה ביותר של נזק לדנ"א, שעלולה להוביל לחוסר יציבות גנומית, סידור מחדש של כרומוזומליים, הזדקנות תאית ומוות תאי אם לא יתוקן מיד¹. שני מסלולים מבוססים היטב, הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR), מוכרים ביעילותם בטיפול ב- DNA DSBs ^2,3. HR נחשב למנגנון נטול שגיאות לתיקון DSB, תוך שימוש ברצפים הומולוגיים בכרומטיד האחות כתבנית לשחזור התצורה המקורית של מולקולת הדנ"א הפגועה³. NHEJ, לעומת זאת, הוא מסלול תיקון DSB מועד לשגיאות שמצטרף לקצוות הדנ"א השבורים מבלי להסתמך על תבנית² כלשהי.

בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות קלאסיות שפותחו במקור במעבדה של ג'סין במרכז הסרטן ממוריאל סלואן-קטרינג ושימשו לכימות היעילות של NHEJ ו- HR, בהתאמה 4,5,6,7. בדיקות אלה ממלאות תפקיד מכריע בחקירת המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים ל- NHEJ ו- HR 8,9,10,11,12,13,14. שתי הבדיקות מסתמכות על יישום של שני כתבי GFP משובשים, EJ5-GFP ו- DR-GFP, כדי לפקח על תיקון DSB המושרה על ידי I-SceI endonuclease. כתב EJ5-GFP מועסק במבחן NHEJ, ואילו כתב DR-GFP מנוצל במבחן משאבי אנוש. כל כתב מתוכנן בעדינות כך שניתן לתקן את ה- DSB המושרה על ידי I-SceI-Induced רק על ידי מסלול תיקון ספציפי כדי לשחזר קלטת ביטוי GFP ^4,5.

ניתן לבצע את בדיקת NHEJ ובדיקת HR באמצעות גישה משולבת כרומוזומלית או גישה חוץ-כרומוזומלית^15,16. הגישה המשולבת כרומוזומלית מחייבת שילוב של כתבי GFP משובשים בגנום, ומאפשרת ניתוח של תיקון DSB בהקשר כרומוזומלי ^6,15. עם זאת, גישה זו דורשת מעבר תאים ממושך ואינה מתאימה למחקרים השוואתיים המערבים קווי תאים מרובים עקב אינטגרציה כרומוזומלית שרירותית, המציגה גורם מבלבל נוסף מלבד הבדלים מובנים. בפרוטוקול זה אנו מתארים את מבחני NHEJ ו-HR החוץ-כרומוזומליים, הכוללים טרנספקציה חולפת של פלסמידים GFP ו-I-SceI משובשים לתאי HEK-293T, ולאחר מכן ניתוח ציטומטריית זרימה (זרימת העבודה של הניסוי מוצגת באיור 1). מבחני כתבים לא משולבים אלה דווחו במקור על ידי מעבדתו של ג'סין לחקר תיקון קישורים צולבים של DNA¹⁶ ושימשו להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש על ידי מספר מעבדות 9,10,11,12,13,14,17,18,19, כולל שלנו¹¹. גישות חוץ-כרומוזומליות אלה מקלות על ניתוח תיקון DSB במחקרים השוואתיים הכוללים מספר קווי תאים יציבים מבוססים.

Protocol

1. בידוד פלסמיד

1. הפוך E. coli מוכשר עם פלסמידים EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-Sce I המבטא פלסמיד), ו- PCI2-HA-mCherry (mCherry המבטא פלסמיד) (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול הטרנספורמציה הסטנדרטי²⁰.
   הערה: PCI2-HA-mCherry ניתן להחליף עם mCherry או DsRed אחרים המבטאים פלסמידים.
2. טפחו את E. coli שעבר טרנספורמציה ב-500 מ"ל של LB בינוני נוזלי בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ"ל למשך הלילה ב-37°C עם רעידות.
3. בודד את הפלסמידים באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מקסי ללא אנדוטוקסין הזמינה באופן מסחרי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
4. כמת את ריכוזי הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטרים של מיקרו-נפחים ננו-טיפתיים. כוונן את ריכוז הפלסמיד ל- 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.

2. הכנת תאים וטרנספקציה

1. תרבית תאי HEK-293T בתווך DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי. ודא כי תאי HEK-293T או תאים יציבים HEK-293T מבוססים נמצאים במצב צמיחה טוב.
   הערה: תאים קפואים צריכים לעבור לפחות שני סבבים של פיצול לפני הטרנספקציה.
2. ביום שלפני ההדבקה, זרעו תאי HEK-293T בצלחת 6 בארות ב 2 × 10⁵ תאים / באר כדי להשיג סביב 60% מפגש למחרת.
3. ביום הטרנספקציה, לאשר את מפגש התא, מכוון כ 60%. עבור בדיקת NHEJ, הדבק את תאי הדגימה הניסיוניים בצלחת 6 בארות עם 1 מיקרוגרם של EJ5-GFP, 1 מיקרוגרם של pCBASceI, ו 1 מיקרוגרם של פלסמידים PCI2-HA-mCherry, באמצעות מגיב טרנספקציה מסחרי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). עבור בדיקת HR, החלף את פלסמיד EJ5-GFP בפלסמיד DR-GFP.
4. עבור פקדי כיול FACS, השאר באר של תאים לא נגועים כבקרה שלילית. העבר את התאים בצלחת של 6 בארות עם (1) 1 מיקרוגרם של EJ5-GFP (עבור מבחן NHEJ) או 1 מיקרוגרם של DR-GFP (עבור בדיקת HR), יחד עם 1 מיקרוגרם של pCBASceI כבקרת צבע יחיד של GFP, או (2) 1 מיקרוגרם של PCI2-HA-mCherry כבקרת צבע יחיד של mCherry.

3. אנליזה של תאים חיוביים ל-GFP ותאי mCherry-positive לפי ציטומטריית זרימה

1. יומיים לאחר הטרנספקציה, לאשר את הביטוי של חלבונים GFP ו mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. שלושה ימים לאחר ההעברה, להסיר את המדיה מן הבארות, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולהוסיף 500 μL טריפסין לכל באר. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לנתק את כל התאים מהצלחת. במהלך שלב זה והשלבים הבאים, להגן על התאים מפני אור ישיר.
3. הוסף מדיית DMEM מלאה של 500 μL לכל באר, השהה מחדש תאים, וודא שלא נראים גושים.
4. מעבירים את כל התאים מכל באר לצינורות צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל, ולאחר מכן לתאי צנטריפוגות למשך 2 דקות בטמפרטורה של 1000 × גרם בטמפרטורת החדר.
5. בזהירות להסיר את supernatant על ידי pipetting ולשטוף פעם אחת עם 1.0 מ"ל PBS.
6. שוב, בזהירות להסיר את supernatant על ידי pipetting, resuspend את התאים ב 500 μL של PBS, ולהעביר את התאים צינורות FACS (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, התחל בניתוח ציטומטריה של זרימה מיד לאחר קצירת תאים. לחלופין, תאים יכולים להיות מאוחסנים על קרח במשך מספר שעות.
7. כייל את FACS עם תאים לא נגועים (בקרה שלילית), EJ5-GFP/DR-GFP ותאים נגועים pCBASceI (בקרת צבע יחיד של GFP) ותאים נגועים mCherry (בקרת צבע יחיד mCherry). כוונן את המתח והפיצוי כדי למזער את זליגת הפלואורסצנטיות בין GFP ל-mCherry.
8. לרכוש ולתעד לפחות 10,000 תאים שלמים מכל צינור.

4. ניתוח נתונים

הערה: השלבים הבאים מבוצעים באמצעות תוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח את נתוני FACS. ניתן לבצע הליכים דומים בתוכנת ניתוח חלופית.

1. גרור את כל קבצי FACS ללוח המחוונים. לחץ פעמיים על אחד הקבצים כדי להציג את התוויית FSC/SSC.
2. צרו שער מצולע לבחירת תאים שלמים, למעט לכלוך בפינה השמאלית התחתונה. תן לתת-אוכלוסייה זו את השם "תאים שלמים" וגרור שער זה לסרגל "כל הדגימות". גללו לאורך כל דגימה באמצעות הלחצן 'הדגימה הבאה ' כדי להבטיח התאמה לכל דגימה (איור 2A).
3. לחץ פעמיים על תת-אוכלוסיית התאים השלמים של דגימת הבקרה השלילית (תאים לא נגועים) כדי להעלות תרשים חדש. שנה את הצירים ל- FL1-H (ציר x, GFP) ו- FL2-H (ציר y, mCherry).
4. בחרו בכלי Quad Gating ולחצו על הקיצוניות הימנית העליונה של אוכלוסיית התאים השלילית (איור 2B). גרור את ארבעת השערים המלבניים לסרגל "תאים שלמים". גלול בין דגימות של פקד GFP בצבע יחיד או פקד צבע יחיד mCherry באמצעות הלחצן Next Sample כדי להבטיח gating מתאים להבחנה בין GFP חיובי או mCherry-חיובי לבין תאי ביקורת שליליים (איור 2C,D). כוונן את ה- quadrant gating במידת הצורך והחל gating זה על כל אוכלוסיות "תאים שלמים".
5. לחץ על עורך הפריסה. לחץ לחיצה ימנית על החלקות המייצגות ובחר העתק לעורך הפריסה. בחרו בכל החלקות המייצגות ולאחר מכן לחצו פעמיים לפתיחת 'הגדרת תרשים'. התאם את תווית הציר, הוסף ביאורים ומקרא כרצונך.
6. אחוז התאים החיוביים mCherry בדגימות ניסוי משמש כבקרת יעילות הטרנספקציה. חשב את יעילות תיקון ה- DNA היחסי על ידי השוואת מספר התאים החיוביים ל- GFP עם מספר התאים החיוביים mCherry באותה חלקה.

תוצאות

כדי להבטיח את הדיוק של ניתוח NHEJ ומשאבי אנוש, יש צורך ביישום אסטרטגיית התאמת תגמול והתאמה מתאימה. בדרך כלל, פלואורסצנטיות mCherry אינה מתבטאת בגלאי GFP בעת שימוש במסנן 530 ננומטר. עם זאת, במקרים של תאים המציגים ביטוי GFP גבוה מאוד, פלואורסצנטיות GFP עלולה לזהם את גלאי mCherry בעת שימוש במסנן 575 ננומטר. כדי...

Discussion

השיטה המתוארת כאן שימשה במספר מאמרים להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. שיטה זו רלוו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056