使用基于 GFP 的报告系统分析 HEK-293T 细胞中的非同源末端连接和同源重组效率

摘要

该方案描述了染色体外非同源末端连接（NHEJ）测定和同源重组（HR）测定，以量化HEK-293T细胞中NHEJ和HR的效率。

摘要

DNA 双链断裂 （DSB） 是最危险的 DNA 损伤，能够诱导大量的遗传信息丢失和细胞死亡。作为回应，细胞采用两种主要机制进行 DSB 修复:非同源末端连接 （NHEJ） 和同源重组 （HR）。分别量化 NHEJ 和 HR 的效率对于探索与两者相关的相关机制和因素至关重要。NHEJ 测定和 HR 测定是用于测量各自修复途径效率的既定方法。这些方法依赖于精心设计的质粒，该质粒含有破坏的绿色荧光蛋白 （GFP） 基因，该基因具有诱导 DSB 的核酸内切酶 I-SceI 的识别位点。在这里，我们描述了染色体外 NHEJ 测定和 HR 测定，它们涉及将 HEK-293T 细胞与 EJ5-GFP/DR-GFP 质粒、表达 I-SceI 的质粒和表达 mCherry 的质粒共转染。通过计算通过流式细胞术计数的GFP阳性细胞与mCherry阳性细胞的比率，可以获得NHEJ和HR效率的定量结果。与染色体整合测定相比，这些染色体外测定更适合进行涉及多个已建立的稳定细胞系的比较研究。

引言

DNA 双链断裂 （DSB） 是最有害的 DNA 损伤形式，如果不及时修复，可能会导致基因组不稳定、染色体重排、细胞衰老和细胞死亡¹.非同源末端连接 （NHEJ） 和同源重组 （HR） 这两种成熟的途径因其在处理 DNA DSB 方面的有效性而得到认可 ^2,3。HR 被认为是一种用于 DSB 修复的无错误机制，它利用姐妹染色单体中的同源序列作为模板来恢复受伤 DNA 分子的原始构型³。另一方面，NHEJ 是一种容易出错的 DSB 修复途径，它连接断裂的 DNA 末端而不依赖任何模板²。

NHEJ 测定和 HR 测定是经典方法，最初在纪念斯隆-凯特琳癌症中心的 Jasin 实验室开发，分别用于量化 NHEJ 和 HR 的效率 4,5,6,7。这些测定在研究与 NHEJ 和 HR 相关的相关机制和因素 8,9,10,11,12,13,14 中起着至关重要的作用。两种检测都依赖于两种被破坏的 GFP 报告基因 EJ5-GFP 和 DR-GFP 的实施，以监测由 I-SceI 核酸内切酶诱导的 DSB 的修复。EJ5-GFP 报告基因用于 NHEJ 测定，而 DR-GFP 报告基因用于 HR 测定。每个报告基因都经过巧妙设计，使得 I-SceI 诱导的 DSB 只能通过特定的修复途径进行修复，以恢复 GFP 表达盒 ^4,5。

NHEJ 测定和 HR 测定可以使用染色体整合或染色体外方法进行^15,16。染色体整合方法需要将被破坏的 GFP 报告基因整合到基因组中，从而可以在染色体背景下分析 DSB 修复 ^6,15。然而，这种方法需要长时间的细胞传代，并且由于染色体整合的任意性，不适合涉及多个细胞系的比较研究，除了固有的差异外，还引入了额外的混杂因素。在该协议中，我们描述了染色体外NHEJ测定和HR测定，涉及将破坏的GFP和I-SceI质粒瞬时转染到HEK-293T细胞中，然后进行流式细胞术分析（实验工作流程如图1所示）。这些非整合报告基因测定最初由 Jasin 的实验室报告，用于研究 DNA 链间交联修复¹⁶，并已被几个实验室用于评估 NHEJ 效率和 HR 效率 9,10,11,12,13,14,17,18,19，包括我们的 ¹¹.这些染色体外方法有助于在涉及多个已建立的稳定细胞系的比较研究中分析 DSB 修复。

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研究方案

1. 质粒分离

1. 用质粒EJ5-GFP，DR-GFP，pCBASceI（I-SceI表达质粒）和PCI2-HA-mCherry（表达mCherry的质粒）（参见材料表）按照标准转化方案²⁰转化感受态大肠杆菌。
   注意:PCI2-HA-mCherry可以用其他表达mCherry或DsRed的质粒替代。
2. 在补充有100μg/ mL氨苄青霉素的500mL液体LB培养基中培养转化 的大肠杆 菌，在37°C下振荡过夜。
3. 按照制造商的说明，使用市售的无内毒素质粒 maxi 分离试剂盒分离质粒（参见 材料表）。
4. 使用纳米滴微量分光光度计量化质粒浓度。将质粒浓度调节至 1 μg/μL。

2. 细胞制备和转染

1. 在补充有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养 HEK-293T 细胞。确保 HEK-293T 细胞或已建立的 HEK-293T 稳定细胞处于良好的生长状态。
   注意:冷冻细胞在转染前应至少进行两轮分裂。
2. 在转染前一天，将 HEK-293T 细胞以 2 × 10⁵ 个细胞/孔接种到 6 孔板中，以在第二天达到约 60% 的汇合度。
3. 在转染当天，确认细胞汇合度，目标约为 60%。对于 NHEJ 测定，按照制造商的说明，使用商业转染试剂将实验样品细胞转染到 6 孔板中，加入 1 μg EJ5-GFP、1 μg pCBASceI 和 1 μg PCI2-HA-mCherry 质粒（参见 材料表）。对于HR测定，用DR-GFP质粒替换EJ5-GFP质粒。
4. 对于 FACS 校准对照，留一孔未转染的细胞作为阴性对照。用 （1） 1 μg EJ5-GFP（用于 NHEJ 测定）或 1 μg DR-GFP（用于 HR 测定）转染 6 孔板中的细胞，以及 1 μg pCBASceI 作为 GFP 单色对照，或 （2） 1 μg PCI2-HA-mCherry 作为 mCherry 单色对照。

3. 通过流式细胞术分析 GFP 阳性和 mCherry 阳性细胞

1. 转染后两天，使用荧光显微镜确认GFP和mCherry蛋白的表达。
2. 转染后三天，从孔中取出培养基，用 PBS 洗涤一次，并向每个孔中加入 500 μL 胰蛋白酶。在37°C下孵育5分钟，以从板上分离所有细胞。在此步骤和后续步骤中，保护细胞免受直射光。
3. 向每个孔中加入 500 μL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞，确保没有可见团块。
4. 将每个孔中的所有细胞转移到 1.5 mL 离心管中，然后在室温下以 1000 × g 离心细胞 2 分钟。
5. 通过移液小心地去除上清液，并用 1.0 mL PBS 洗涤一次。
6. 再次，通过移液小心地去除上清液，将细胞重悬于500μL PBS中，并将细胞转移到FACS管中（参见 材料表）。
   注:为获得最佳结果，请在细胞收获后立即开始流式细胞术分析。或者，细胞可以在冰上储存数小时。
7. 使用未转染的细胞（阴性对照）、EJ5-GFP/DR-GFP 和 pCBASceI 转染的细胞（GFP 单色对照）和 mCherry 转染的细胞（mCherry 单色对照）校准 FACS。调整电压和补偿，以最大限度地减少 GFP 和 mCherry 之间的荧光溢出。
8. 从每个试管中采集并记录至少 10,000 个完整细胞。

4. 数据分析

注意:以下步骤使用 FlowJo 软件（参见 材料表）执行以分析 FACS 数据。类似的程序可以在替代分析软件中执行。

1. 将所有 FACS 文件拖到仪表板中。双击其中一个文件以显示 FSC/SSC 图。
2. 创建一个多边形门以选择完整的像元，不包括左下角的碎片。将此亚群命名为"完整细胞"，并将此门拖动到"所有样本"栏。使用 "下一个样品 "按钮滚动浏览每个样品，以确保每个样品的适当设门（图2A）。
3. 双击阴性对照样品（未转染细胞）的 "完整细胞 "亚群以显示新图。将轴更改为 FL1-H （x 轴，GFP）和 FL2-H（y 轴，mCherry）。
4. 选择四门控工具，然后单击负细胞群的右上角极值（图2B）。将四个矩形门拖动到"完整单元格"条上。使用"下一个样品"按钮滚动浏览GFP单色对照或mCherry单色对照样品，以确保适当设门以区分GFP阳性或mCherry阳性与阴性对照细胞（图2C，D）。如有必要，微调象限门控，并将此门控应用于所有"完整细胞"群体。
5. 单击 布局编辑器。在具有代表性的绘图上单击鼠标右键，然后选择 "复制到布局编辑器"。选择所有具有代表性的绘图，然后双击以打开 图形定义。根据需要调整轴标签、注释和图例。
6. 实验样品中 mCherry 阳性细胞的百分比用作转染效率控制。通过比较同一图中GFP阳性细胞的数量与mCherry阳性细胞的数量来计算相对DNA修复效率。

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结果

为了确保 NHEJ 和 HR 分析的准确性，实施适当的薪酬调整和门控策略是必要的。通常，使用 530 nm 滤光片时，mCherry 荧光不会在 GFP 检测器中显现出来。然而，在表现出极高 GFP 表达的细胞中，使用 575 nm 滤光片时，GFP 荧光可能会污染 mCherry 检测器。为了解决这些问题，使用阴性对照、GFP 单色对照和 mCherry 单色对照样品进行补偿并调节门控策略。对照细胞的典型FACS结果如图 2所...

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讨论

这里描述的方法已被几篇论文用于评估 NHEJ 效率和 HR 效率 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。该方法对于阐明DNA DSB修复的潜在机制以及识别与NHEJ和HR相关...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056