使用基于 GFP 的报告系统分析 HEK-293T 细胞中的非同源末端连接和同源重组效率

摘要

该方案描述了染色体外非同源末端连接（NHEJ）测定和同源重组（HR）测定，以量化HEK-293T细胞中NHEJ和HR的效率。

摘要

DNA 双链断裂 （DSB） 是最危险的 DNA 损伤，能够诱导大量的遗传信息丢失和细胞死亡。作为回应，细胞采用两种主要机制进行 DSB 修复：非同源末端连接 （NHEJ） 和同源重组 （HR）。分别量化 NHEJ 和 HR 的效率对于探索与两者相关的相关机制和因素至关重要。NHEJ 测定和 HR 测定是用于测量各自修复途径效率的既定方法。这些方法依赖于精心设计的质粒，该质粒含有破坏的绿色荧光蛋白 （GFP） 基因，该基因具有诱导 DSB 的核酸内切酶 I-SceI 的识别位点。在这里，我们描述了染色体外 NHEJ 测定和 HR 测定，它们涉及将 HEK-293T 细胞与 EJ5-GFP/DR-GFP 质粒、表达 I-SceI 的质粒和表达 mCherry 的质粒共转染。通过计算通过流式细胞术计数的GFP阳性细胞与mCherry阳性细胞的比率，可以获得NHEJ和HR效率的定量结果。与染色体整合测定相比，这些染色体外测定更适合进行涉及多个已建立的稳定细胞系的比较研究。

引言

DNA 双链断裂 （DSB） 是最有害的 DNA 损伤形式，如果不及时修复，可能会导致基因组不稳定、染色体重排、细胞衰老和细胞死亡¹.非同源末端连接 （NHEJ） 和同源重组 （HR） 这两种成熟的途径因其在处理 DNA DSB 方面的有效性而得到认可 ^2,3。HR 被认为是一种用于 DSB 修复的无错误机制，它利用姐妹染色单体中的同源序列作为模板来恢复受伤 DNA 分子的原始构型³。另一方面，NHEJ 是一种容易出错的 DSB 修复途径，它连接断裂的 DNA 末端而不依赖任何模板²。

NHEJ 测定和 HR 测定是经典方法，最初在纪念斯隆-凯特琳癌症中心的 Jasin 实验室开发，分别用于量化 NHEJ 和 HR 的效率 4,5,6,7。这些测定在研究与 NHEJ 和 HR 相关的相关机制和因素

研究方案

1. 质粒分离

1. 用质粒EJ5-GFP，DR-GFP，pCBASceI（I-SceI表达质粒）和PCI2-HA-mCherry（表达mCherry的质粒）（参见材料表）按照标准转化方案²⁰转化感受态大肠杆菌。
   注意：PCI2-HA-mCherry可以用其他表达mCherry或DsRed的质粒替代。
2. 在补充有100μg/ mL氨苄青霉素的500mL液体LB培养基中培养转化 的大肠杆 菌，在37°C下振荡过夜。
3. 按照制造商的说明，使用市售的无内毒素质粒 maxi 分离试剂盒分离质粒（参见 材料表）。
4. 使用纳米滴微量分光光度计量化质粒浓度。将质粒浓度调节至 1 μg/μL。

2. 细胞制备和转染

1. 在补充有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养 HEK-293T 细胞。确保 HEK-293T 细胞或已建立的 HEK-293T 稳定细胞处于良好的生长状态。
   注意：冷冻细胞在转染前应至少进行两轮分裂。
2. 在转染前一天，将 HEK-293T 细胞以 2 × 10⁵ 个细胞/孔接种到 6 孔板....

讨论

这里描述的方法已被几篇论文用于评估 NHEJ 效率和 HR 效率 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。该方法对于阐明DNA DSB修复的潜在机制以及识别与NHEJ和HR相关.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056