Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen extrachromosomalen nicht-homologen Endverbindungs-Assay (NHEJ) und einen homologen Rekombinations-Assay (HR), um die Effizienz von NHEJ und HR in HEK-293T-Zellen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen die gefährlichsten DNA-Läsionen dar, die zu einem erheblichen Verlust genetischer Informationen und dem Ableben von Zellen führen können. Als Reaktion darauf nutzen die Zellen zwei primäre Mechanismen für die DSB-Reparatur: die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR). Die getrennte Quantifizierung der Effizienz von NHEJ und HR ist entscheidend für die Erforschung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die damit verbunden sind. Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind etablierte Methoden, mit denen die Effizienz ihrer jeweiligen Reparaturwege gemessen wird. Diese Methoden beruhen auf sorgfältig entworfenen Plasmiden, die ein gestörtes Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit Erkennungsstellen für die Endonuklease I-SceI enthalten, die DSBs induziert. Hier beschreiben wir den extrachromosomalen NHEJ-Assay und den HR-Assay, bei denen HEK-293T-Zellen mit EJ5-GFP/DR-GFP-Plasmiden, einem I-SceI-exprimierenden Plasmid und einem mCherry-exprimierenden Plasmid co-transfiziert werden. Quantitative Ergebnisse der NHEJ- und HR-Effizienz erhalten Sie durch Berechnung des Verhältnisses von GFP-positiven Zellen zu mCherry-positiven Zellen, wie es durch Durchflusszytometrie gezählt wird. Im Gegensatz zu chromosomal integrierten Assays eignen sich diese extrachromosomalen Assays eher für vergleichende Untersuchungen mit mehreren etablierten stabilen Zelllinien.

Einleitung

Ein DNA-Doppelstrangbruch (DSB) ist die schädlichste Form von DNA-Schäden, die zu Genominstabilität, chromosomalen Umlagerungen, zellulärer Seneszenz und Zelltod führen kann, wenn sie nicht sofort repariert wird¹. Zwei gut etablierte Signalwege, die nicht-homologe Endbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR), sind für ihre Wirksamkeit bei der Adressierung von DNA-DSBs bekannt ^2,3. HR gilt als fehlerfreier Mechanismus für die DSB-Reparatur, wobei homologe Sequenzen im Schwesterchromatid als Vorlage verwendet werden, um die ursprüngliche Konfiguration des ve....

Protokoll

1. Isolierung von Plasmiden

1. Transformieren Sie kompetente E. coli mit den Plasmiden EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-SceI-exprimierendes Plasmid) und PCI2-HA-mCherry (mCherry-exprimierendes Plasmid) (siehe Materialtabelle) nach dem Standard-Transformationsprotokoll²⁰.
   HINWEIS: PCI2-HA-mCherry kann durch andere mCherry oder DsRed exprimierende Plasmide substituiert werden.
2. Die transformierten E. coli werden in 500 mL flüssigem LB-Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin, über Nacht bei 37 °C unter Schütteln kultiviert.
3. Isolieren Sie die Plasmide mit einem i....

Diskussion

Die hier beschriebene Methode wurde in mehreren Arbeiten zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und der HR-Effizienz 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19 eingesetzt. Diese Methode ist relevant, um die.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056