Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen extrachromosomalen nicht-homologen Endverbindungs-Assay (NHEJ) und einen homologen Rekombinations-Assay (HR), um die Effizienz von NHEJ und HR in HEK-293T-Zellen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen die gefährlichsten DNA-Läsionen dar, die zu einem erheblichen Verlust genetischer Informationen und dem Ableben von Zellen führen können. Als Reaktion darauf nutzen die Zellen zwei primäre Mechanismen für die DSB-Reparatur: die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR). Die getrennte Quantifizierung der Effizienz von NHEJ und HR ist entscheidend für die Erforschung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die damit verbunden sind. Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind etablierte Methoden, mit denen die Effizienz ihrer jeweiligen Reparaturwege gemessen wird. Diese Methoden beruhen auf sorgfältig entworfenen Plasmiden, die ein gestörtes Gen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit Erkennungsstellen für die Endonuklease I-SceI enthalten, die DSBs induziert. Hier beschreiben wir den extrachromosomalen NHEJ-Assay und den HR-Assay, bei denen HEK-293T-Zellen mit EJ5-GFP/DR-GFP-Plasmiden, einem I-SceI-exprimierenden Plasmid und einem mCherry-exprimierenden Plasmid co-transfiziert werden. Quantitative Ergebnisse der NHEJ- und HR-Effizienz erhalten Sie durch Berechnung des Verhältnisses von GFP-positiven Zellen zu mCherry-positiven Zellen, wie es durch Durchflusszytometrie gezählt wird. Im Gegensatz zu chromosomal integrierten Assays eignen sich diese extrachromosomalen Assays eher für vergleichende Untersuchungen mit mehreren etablierten stabilen Zelllinien.

Einleitung

Ein DNA-Doppelstrangbruch (DSB) ist die schädlichste Form von DNA-Schäden, die zu Genominstabilität, chromosomalen Umlagerungen, zellulärer Seneszenz und Zelltod führen kann, wenn sie nicht sofort repariert wird¹. Zwei gut etablierte Signalwege, die nicht-homologe Endbindung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR), sind für ihre Wirksamkeit bei der Adressierung von DNA-DSBs bekannt ^2,3. HR gilt als fehlerfreier Mechanismus für die DSB-Reparatur, wobei homologe Sequenzen im Schwesterchromatid als Vorlage verwendet werden, um die ursprüngliche Konfiguration des verletzten DNA-Moleküls³ wiederherzustellen. NHEJ hingegen ist ein fehleranfälliger DSB-Reparaturweg, der die defekten DNA-Enden verbindet, ohne sich auf eine Vorlage² zu verlassen.

Der NHEJ-Assay und der HR-Assay sind klassische Methoden, die ursprünglich in Jasins Labor am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center entwickelt und zur Quantifizierung der Effizienz von NHEJ bzw. HR verwendet wurden 4,5,6,7. Diese Assays spielen eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung der relevanten Mechanismen und Faktoren, die mit NHEJ und HR verbunden sind 8,9,10,11,12,13,14. Beide Assays beruhen auf der Implementierung von zwei gestörten GFP-Reportern, EJ5-GFP und DR-GFP, um die Reparatur von DSBs zu überwachen, die durch die I-SceI-Endonukapase induziert werden. Der EJ5-GFP-Reporter wird im NHEJ-Assay verwendet, während der DR-GFP-Reporter im HR-Assay verwendet wird. Jeder Reporter ist subtil so gestaltet, dass die I-SceI-induzierten DSBs nur durch einen spezifischen Reparaturweg repariert werden können, um eine GFP-Expressionskassette wiederherzustellen ^4,5.

Der NHEJ-Assay und der HR-Assay können entweder mit einem chromosomal integrierten oder einem extrachromosomalen Ansatz durchgeführt werden^15,16. Der chromosomal integrierte Ansatz erfordert die Integration der gestörten GFP-Reporter in das Genom, was die Analyse der DSB-Reparatur im chromosomalen Kontext ermöglicht ^6,15. Dieser Ansatz erfordert jedoch eine verlängerte Zellpassage und ist für vergleichende Studien mit mehreren Zelllinien aufgrund willkürlicher chromosomaler Integration ungeeignet, was neben den inhärenten Unterschieden einen zusätzlichen Störfaktor mit sich bringt. In diesem Protokoll beschreiben wir den extrachromosomalen NHEJ-Assay und die HR-Assays, die die transiente Transfektion der gestörten GFP- und I-SceI-Plasmide in HEK-293T-Zellen beinhalten, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse (der Arbeitsablauf des Experiments ist in Abbildung 1 dargestellt). Diese nicht integrierten Reporter-Assays wurden ursprünglich von Jasins Labor zur Untersuchung der DNA-Vernetzungsreparatur¹⁶ gemeldet und wurden von mehreren Laboratorien 9,10,11,12,13,14,17,18,19, einschließlich unseres Labors ¹¹, zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und HR-Effizienz eingesetzt . Diese extrachromosomalen Ansätze erleichtern die Analyse der DSB-Reparatur in vergleichenden Studien mit mehreren etablierten stabilen Zelllinien.

Protokoll

1. Isolierung von Plasmiden

1. Transformieren Sie kompetente E. coli mit den Plasmiden EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-SceI-exprimierendes Plasmid) und PCI2-HA-mCherry (mCherry-exprimierendes Plasmid) (siehe Materialtabelle) nach dem Standard-Transformationsprotokoll²⁰.
   HINWEIS: PCI2-HA-mCherry kann durch andere mCherry oder DsRed exprimierende Plasmide substituiert werden.
2. Die transformierten E. coli werden in 500 mL flüssigem LB-Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin, über Nacht bei 37 °C unter Schütteln kultiviert.
3. Isolieren Sie die Plasmide mit einem im Handel erhältlichen endotoxinfreien Plasmid-Maxi-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
4. Quantifizieren Sie die Plasmidkonzentrationen mit Nanotropfen-Mikrovolumen-Spektralphotometern. Stellen Sie die Plasmidkonzentration auf 1 μg/μl ein.

2. Zellvorbereitung und Transfektion

1. Kultivierung von HEK-293T-Zellen in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum. Stellen Sie sicher, dass sich die HEK-293T-Zellen oder etablierten stabilen HEK-293T-Zellen in einem guten Wachstumszustand befinden.
   HINWEIS: Gefrorene Zellen sollten vor der Transfektion mindestens zwei Teilungsrunden durchlaufen.
2. Am Tag vor der Transfektion werden HEK-293T-Zellen in einer 6-Well-Platte bei 2 × 10⁵ Zellen/Well gesät, um am nächsten Tag eine Konfluenz von etwa 60 % zu erreichen.
3. Bestätigen Sie am Tag der Transfektion die Zellkonfluenz, wobei Sie auf etwa 60 % abzielen. Für den NHEJ-Assay transfizieren Sie die experimentellen Probenzellen in einer 6-Well-Platte mit 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI und 1 μg PCI2-HA-mCherry-Plasmiden unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Ersetzen Sie für den HR-Assay das EJ5-GFP-Plasmid durch das DR-GFP-Plasmid.
4. Lassen Sie für FACS-Kalibrierungskontrollen eine Vertiefung mit Zellen als Negativkontrolle undurchtrennt. Transfizieren Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte entweder mit (1) 1 μg EJ5-GFP (für NHEJ-Assay) oder 1 μg DR-GFP (für HR-Assay) zusammen mit 1 μg pCBASceI als einfarbige GFP-Kontrolle oder (2) 1 μg PCI2-HA-mCherry als einfarbige mCherry-Kontrolle.

3. Analyse der GFP-positiven und mCherry-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie

1. Zwei Tage nach der Transfektion bestätigen Sie die Expression von GFP- und mCherry-Proteinen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
2. Entfernen Sie drei Tage nach der Transfektion das Medium aus den Vertiefungen, waschen Sie es einmal mit PBS und geben Sie 500 μl Trypsin in jede Vertiefung. 5 min bei 37 °C inkubieren, um alle Zellen von der Platte zu lösen. Schirmen Sie die Zellen während dieses und der folgenden Schritte vor direktem Licht ab.
3. Geben Sie 500 μl vollständiges DMEM-Medium in jede Vertiefung, resuspendieren Sie die Zellen und stellen Sie sicher, dass keine Klumpen sichtbar sind.
4. Übertragen Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann 2 Minuten lang bei 1000 × g bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren und waschen Sie ihn einmal mit 1,0 mL PBS.
6. Entfernen Sie erneut vorsichtig den Überstand durch Pipettieren, resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBS und übertragen Sie die Zellen in FACS-Röhrchen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, beginnen Sie unmittelbar nach der Zellernte mit der Durchflusszytometrie-Analyse. Alternativ können die Zellen auch mehrere Stunden auf Eis gelagert werden.
7. Kalibrieren Sie das FACS mit untransfizierten Zellen (Negativkontrolle), EJ5-GFP/DR-GFP und pCBASceI-transfizierten Zellen (GFP-Einfarbkontrolle) und mCherry-transfizierten Zellen (mCherry-Einfarbkontrolle). Passen Sie Spannung und Kompensation an, um den Fluoreszenz-Spillover zwischen GFP und mCherry zu minimieren.
8. Erfassen und erfassen Sie mindestens 10.000 intakte Zellen aus jedem Röhrchen.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden mit der FlowJo-Software (siehe Materialtabelle) durchgeführt, um die FACS-Daten zu analysieren. Vergleichbare Verfahren können in alternativer Analysesoftware ausgeführt werden.

1. Ziehen Sie alle FACS-Dateien in das Dashboard. Doppelklicken Sie auf eine der Dateien, um den FSC/SSC-Plot anzuzeigen.
2. Erstellen Sie ein Polygon-Tor, um intakte Zellen auszuwählen, ohne Ablagerungen in der unteren linken Ecke. Nennen Sie diese Teilpopulation "Intakte Zellen" und ziehen Sie dieses Tor in die Leiste "Alle Stichproben". Scrollen Sie mit der Schaltfläche "Nächste Probe" durch jede Probe, um ein geeignetes Gating für jede Probe sicherzustellen (Abbildung 2A).
3. Doppelklicken Sie auf die Subpopulation Intakte Zellen der negativen Kontrollprobe (nicht transfizierte Zellen), um ein neues Diagramm aufzurufen. Ändern Sie die Achsen in FL1-H (x-Achse, GFP) und FL2-H (y-Achse, mCherry).
4. Wählen Sie das Quad-Gating-Werkzeug aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation (Abbildung 2B). Ziehen Sie die vier rechteckigen Tore in die Leiste "Intakte Zellen". Scrollen Sie mit der Schaltfläche "Nächste Probe" durch die Proben der einfarbigen GFP-Steuerung oder der einfarbigen mCherry-Kontrolle, um ein geeignetes Gating für die Unterscheidung von GFP-positiven oder mCherry-positiven von negativen Kontrollzellen sicherzustellen (Abbildung 2C, D). Passen Sie bei Bedarf die Feinabstimmung des Quadranten-Gating an und wenden Sie dieses Gating auf alle "intakten Zellen" Populationen an.
5. Klicken Sie auf den Layout-Editor. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die repräsentativen Diagramme, und wählen Sie In Layouteditor kopieren. Wählen Sie alle repräsentativen Diagramme aus, und doppelklicken Sie dann, um die Diagrammdefinition zu öffnen. Passen Sie die Achsenbeschriftung, die Beschriftung und die Legende wie gewünscht an.
6. Der Prozentsatz der mCherry-positiven Zellen in experimentellen Proben dient als Kontrolle der Transfektionseffizienz. Berechnen Sie die relative DNA-Reparatureffizienz, indem Sie die Anzahl der GFP-positiven Zellen mit der Anzahl der mCherry-positiven Zellen im selben Diagramm vergleichen.

Ergebnisse

Um die Genauigkeit der NHEJ- und HR-Analyse zu gewährleisten, ist die Implementierung einer geeigneten Vergütungsanpassungs- und Gating-Strategie erforderlich. In der Regel manifestiert sich die mCherry-Fluoreszenz im GFP-Detektor nicht, wenn ein 530-nm-Filter verwendet wird. In Fällen, in denen Zellen eine extrem hohe GFP-Expression aufweisen, kann die GFP-Fluoreszenz den mCherry-Detektor jedoch verunreinigen, wenn ein 575-nm-Filter verwendet wird. Um diese Bedenken auszuräumen, wurden Negativkontroll-, GFP-Einfarb-...

Diskussion

Die hier beschriebene Methode wurde in mehreren Arbeiten zur Bewertung der NHEJ-Effizienz und der HR-Effizienz 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19 eingesetzt. Diese Methode ist relevant, um die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056