GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

요약

이 프로토콜은 HEK-293T 세포에서 NHEJ 및 HR의 효율성을 정량화하기 위한 염색체 외 비상동 말단 결합(NHEJ) 분석 및 상동 재조합(HR) 분석을 설명합니다.

초록

DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 상당한 유전 정보 손실과 세포 사멸을 유발할 수 있는 가장 위험한 DNA 병변을 나타냅니다. 이에 대응하여 세포는 DSB 복구를 위한 두 가지 주요 메커니즘, 즉 비상동성 말단 결합(NHEJ)과 상동 재조합(HR)을 사용합니다. NHEJ와 HR의 효율성을 별도로 정량화하는 것은 각각과 관련된 관련 메커니즘 및 요인을 탐색하는 데 중요합니다. NHEJ 분석 및 HR 분석은 각각의 복구 경로의 효율성을 측정하는 데 사용되는 확립된 방법입니다. 이러한 방법은 DSB를 유도하는 엔도뉴클레아제 I-SceI에 대한 인식 부위가 있는 파괴된 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 포함하는 세심하게 설계된 플라스미드에 의존합니다. 여기에서는 HEK-293T 세포를 EJ5-GFP/DR-GFP 플라스미드, I-SceI 발현 플라스미드 및 mCherry 발현 플라스미드와 함께 co-transfection하는 염색체 외 NHEJ 분석 및 HR 분석에 대해 설명합니다. NHEJ 및 HR 효율성의 정량적 결과는 유세포 분석으로 계산한 바와 같이 GFP 양성 세포와 mCherry 양성 세포의 비율을 계산하여 얻습니다. 염색체 통합 분석과 달리, 이러한 염색체 외 분석은 확립된 여러 안정적인 세포주와 관련된 비교 조사를 수행하는 데 더 적합합니다.

서문

DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 DNA 손상의 가장 해로운 형태로, 즉시 복구하지 않으면 게놈 불안정, 염색체 재배열, 세포 노화 및 세포 사멸을 유발할 수 있습니다¹. 잘 정립된 두 가지 경로인 NHEJ(nonhomologous end joining)와 HR(homologous recombination)은 DNA DSB ^2,3을 해결하는 데 효과적인 것으로 인정받고 있습니다. HR은 DSB 복구를 위한 오류 없는 메커니즘으로 간주되며, 손상된 DNA 분자의 원래 구성을 복원하기 위한 템플릿으로 자매 염색분체의 상동 서열을 활용합니다³. 반면에 NHEJ는 템플릿에 의존하지 않고 끊어진 DNA 말단을 결합하는 오류가 발생하기 쉬운 DSB 복구 경로입니다².

NHEJ 분석 및 HR 분석은 원래 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center의 Jasin의 실험실에서 개발된 고전적인 방법으로, NHEJ 및 HR의 효율성을 각각

프로토콜

1. 플라스미드 분리

1. 표준 형질전환 프로토콜²⁰에 따라 플라스미드 EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI(I-SceI 발현 플라스미드) 및 PCI2-HA-mCherry(mCherry 발현 플라스미드)(재료 표 참조)를 사용하여 유능한 E. coli를 형질전환시킵니다.
   참고: PCI2-HA-mCherry는 다른 mCherry 또는 DsRed 발현 플라스미드로 대체할 수 있습니다.
2. 형질전환된 대장균 을 100μg/mL 암피실린이 보충된 500mL의 액체 LB 배지에 넣고 37°C에서 밤새 흔들어 배양합니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 endotoxin-free plasmid maxi isolation kit를 사용하여 plasmid를 분리합니다( 재료 표 참조).
4. nanodrop 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 정량화합니다. 플라스미드 농도를 1 μg/μL로 조절합니다.

2. 세포 준비 및 transfection<....

토론

여기에 설명된 방법은 NHEJ 효율성 및 HR 효율성 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19를 평가하기 위해 여러 논문에서 사용되었습니다. 이 방법은 DNA DSB 복구?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056