التهجين البصري للأشعة تحت الحمراء الحرارية الضوئية في الموقع (OPTIR-FISH)

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام التهجين الموضعي للأشعة تحت الحمراء الضوئية الحرارية (OPTIR-FISH) ، المعروف أيضا باسم الأسماك الحرارية الضوئية في منتصف الأشعة تحت الحمراء (MIP-FISH) ، لتحديد الخلايا الفردية وفهم عملية التمثيل الغذائي لها. يمكن تطبيق هذه المنهجية على نطاق واسع لتطبيقات متنوعة ، بما في ذلك رسم خرائط التمثيل الغذائي الخلوي بدقة الخلية الواحدة.

Abstract

يعد فهم الأنشطة الأيضية للخلايا الفردية داخل المجتمعات المعقدة أمرا بالغ الأهمية لكشف دورها في الأمراض البشرية. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتحديد الخلايا وتحليل التمثيل الغذائي المتزامن باستخدام منصة OPTIR-FISH من خلال الجمع بين مجسات FISH الموسومة بالحمض النووي الريبي (rRNA) والركائز المسماة بالنظائر. يوفر التصوير الفلوري تحديد الخلية من خلال الارتباط المحدد لمسبارات FISH التي تحمل علامة rRNA ، بينما يوفر تصوير OPTIR أنشطة التمثيل الغذائي داخل الخلايا المفردة عن طريق الانزياح الأحمر الناجم عن النظائر على أطياف OPTIR. باستخدام البكتيريا المستزرعة ب ¹³C-glucose كسرير اختبار ، يحدد البروتوكول الثقافة الميكروبية مع وضع العلامات النظيرية ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، وإعداد العينة ، وتحسين إعداد التصوير OPTIR-FISH ، والحصول على البيانات. نوضح أيضا كيفية إجراء تحليل الصور وتفسير البيانات الطيفية على مستوى الخلية المفردة ذات الإنتاجية العالية. ستسهل الطبيعة الموحدة والمفصلة لهذا البروتوكول إلى حد كبير اعتماده من قبل الباحثين من خلفيات وتخصصات متنوعة داخل مجتمع أبحاث التمثيل الغذائي أحادي الخلية الواسع.

Introduction

يقف التمثيل الغذائي الخلوي كركيزة أساسية في بيولوجيا الخلية ، حيث يوجه العديد من العمليات التي تحدد صحة الخلية ووظيفتها وتفاعلها مع البيئة. يوفر تحليل التمثيل الغذائي على مستوى الخلية الفردية ، لا سيما داخل البيئات الأصلية ، رؤى لا تقدر بثمن للكشف عن الأنشطة غير المتجانسة والمعقدة في الأنظمة^{البيولوجية 1}. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص في دراسة الكائنات الحية الدقيقة ، حيث تظهر العديد من الميكروبات متطلبات نمو فريدة أو تبعيات بيئية تتحدى طرق الزراعة التقليدية². على سبيل المثال ، قد تتطلب بعض الأنواع تركيبات مغذية محددة أو علاقات تكافلية لا يمكن تكرارها بسهولة في بيئة مختبرية ، مما يجعلها غ....

Protocol

يتوافق استخدام العينات البكتيرية في هذه الدراسة مع إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بجامعة بوسطن والمعهد الوطني للصحة.

ملاحظة: يتم تلخيص سير العمل العام المتبع في هذا البروتوكول في الشكل 2.

1. الثقافة البكتيرية ووضع العلامات على النظائر (الشكل 2 أ)

ملاحظة: المثال الوارد هنا هو تسمية ثقافة بكتيرية نقية. في حالة تطبيق هذا البروتوكول على المجتمعات متعددة الميكروبات ، يجب تعديل الوسط ووقت الملصقات وفقا للمجتمع وفسيولوجيا الكائنات الحية ذات الأهمية.

1. ت....

النتائج

يتم تلخيص سير العمل العام لتحليل التمثيل الغذائي الميكروبي أحادي الخلية مع التحديد الجيني بواسطة OPTIR-FISH في الشكل 2. تظهر النتائج التمثيلية التي توضح قدرة التصوير الأيضي أحادي الخلية ل OPTIR في الشكل 3. استخدم هذا المثال بكتريا قولونية خلايا ?.......

Discussion

هنا ، وصفنا بروتوكولا مفصلا لتطبيق منصة OPTIR-FISH للتحديد المتزامن للأنواع الميكروبية والقياس الكمي لأنشطة التمثيل الغذائي بدقة الخلية الواحدة. تشمل الخطوات الحاسمة الاستزراع مع وضع العلامات على النظائر المستقرة لدراسة أنشطة التمثيل الغذائي المحددة والتهجين الفلوري ف.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G