Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام التهجين الموضعي للأشعة تحت الحمراء الضوئية الحرارية (OPTIR-FISH) ، المعروف أيضا باسم الأسماك الحرارية الضوئية في منتصف الأشعة تحت الحمراء (MIP-FISH) ، لتحديد الخلايا الفردية وفهم عملية التمثيل الغذائي لها. يمكن تطبيق هذه المنهجية على نطاق واسع لتطبيقات متنوعة ، بما في ذلك رسم خرائط التمثيل الغذائي الخلوي بدقة الخلية الواحدة.

Abstract

يعد فهم الأنشطة الأيضية للخلايا الفردية داخل المجتمعات المعقدة أمرا بالغ الأهمية لكشف دورها في الأمراض البشرية. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتحديد الخلايا وتحليل التمثيل الغذائي المتزامن باستخدام منصة OPTIR-FISH من خلال الجمع بين مجسات FISH الموسومة بالحمض النووي الريبي (rRNA) والركائز المسماة بالنظائر. يوفر التصوير الفلوري تحديد الخلية من خلال الارتباط المحدد لمسبارات FISH التي تحمل علامة rRNA ، بينما يوفر تصوير OPTIR أنشطة التمثيل الغذائي داخل الخلايا المفردة عن طريق الانزياح الأحمر الناجم عن النظائر على أطياف OPTIR. باستخدام البكتيريا المستزرعة ب 13C-glucose كسرير اختبار ، يحدد البروتوكول الثقافة الميكروبية مع وضع العلامات النظيرية ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، وإعداد العينة ، وتحسين إعداد التصوير OPTIR-FISH ، والحصول على البيانات. نوضح أيضا كيفية إجراء تحليل الصور وتفسير البيانات الطيفية على مستوى الخلية المفردة ذات الإنتاجية العالية. ستسهل الطبيعة الموحدة والمفصلة لهذا البروتوكول إلى حد كبير اعتماده من قبل الباحثين من خلفيات وتخصصات متنوعة داخل مجتمع أبحاث التمثيل الغذائي أحادي الخلية الواسع.

Introduction

يقف التمثيل الغذائي الخلوي كركيزة أساسية في بيولوجيا الخلية ، حيث يوجه العديد من العمليات التي تحدد صحة الخلية ووظيفتها وتفاعلها مع البيئة. يوفر تحليل التمثيل الغذائي على مستوى الخلية الفردية ، لا سيما داخل البيئات الأصلية ، رؤى لا تقدر بثمن للكشف عن الأنشطة غير المتجانسة والمعقدة في الأنظمةالبيولوجية 1. هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص في دراسة الكائنات الحية الدقيقة ، حيث تظهر العديد من الميكروبات متطلبات نمو فريدة أو تبعيات بيئية تتحدى طرق الزراعة التقليدية2. على سبيل المثال ، قد تتطلب بعض الأنواع تركيبات مغذية محددة أو علاقات تكافلية لا يمكن تكرارها بسهولة في بيئة مختبرية ، مما يجعلها غير قابلة للزراعة بالتقنيات المعيارية3. علاوة على ذلك ، فإن الفترات الطويلة اللازمة لزراعة أنواع معينة تشكل تحديات كبيرة للبحوث الميكروبيولوجية ، وغالبا ما تمتد إلى ما هو أبعد من الأطر الزمنية العملية للدراسة والتحليل. للتحايل على هذه القيود ، تسمح الطرق البديلة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) بتحديد الأنواع الميكروبية دون الحاجة إلى الزراعة4 ، والتي يمكن أن تحقق رؤية أكثر دقة وشمولية للنظم الإيكولوجية الميكروبية. ومع ذلك ، تفتقر هذه التقنيات التحليلية إلى القدرة على توضيح التمثيل الغذائي الخلوي. تسلط هذه الفجوة الضوء على التحديات المستمرة في مجال علم الأحياء الدقيقة: المهمة المتزامنة المتمثلة في التمييز بين الهوية الخلوية وتوضيح التمثيل الغذائي على مستوى الخلية الواحدة. ظهرت التطورات في تقنيات مثل قياس الطيف الكتلي للتصوير (IMS) إلى جانب النظائر المستقرة كأدوات قوية لتحليل التمثيل الغذائي أحادي الخلية5. في هذه التجارب ، تم تحضين الخلايا بركائز تحتوي على نظائر مثل 13درجة مئوية أو 15نيوتن. تحمل الجزيئات الحيوية المضاننة حديثا هذه النظائر ، مما يجعلها مميزة على أطياف m / z. ومع ذلك ، يعاني IMS من أجهزة باهظة الثمن ، وإعداد عينات معقدة ، وإنتاجية منخفضة نسبيا ، والخبرة المطلوبة لتحليل أطياف m / z. عند دمجها مع التصوير الفلوري الخاص بالعلامات الجزيئية ، تم إحراز تقدم في توضيح التمثيل الغذائي الخلوي مع زيادة الخصوصية6. ومع ذلك، لا تزال هناك تحديات في الربط بين هاتين الطريقتين. يجعل الاختلاف في الاستبانة بين IMS والتصوير الفلوري ، جنبا إلى جنب مع الإعدادات التشغيلية المختلفة ، من الصعب مواءمة النتائج وربطها7.

يوفر دمج التصوير الطيفي الاهتزازي مع وضع العلامات على النظائر المستقرة حلا جديدا لدراسة التمثيل الغذائي للخلية الواحدة. يؤدي دمج النظائر الثقيلة إلى إبطاء اهتزاز الروابط الكيميائية ، مما يؤدي إلى قمم أحمر في الأطياف الاهتزازية8. والجدير بالذكر أن التصوير الاهتزازي يوفر دقة مكانية مماثلة للتصوير الفلوري ، ويمكن إجراء كل من القياس الكمي الأيضي وتحديد الخلية في إعداد واحد ، مما يبسط تسجيل الصورة والارتباط. أظهر عملنا الأخير مزيجا من منصة التصوير الاهتزازي المتقدمة: الأشعة تحت الحمراء الضوئية الحرارية البصرية (OPTIR) مع التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لاستكشاف استقلاب الجلوكوز في المجتمعات البكتيرية9 (الشكل 1). OPTIR هو نظام مجهر طيفي اهتزازي يسخر التأثير الحراري الضوئي لامتصاص الأشعة تحت الحمراء المتوسطة من خلال اكتشاف تغير الضوء المرئي ، والذي يوفر دقة ميكرومتر فرعي كما هو الحال في الفحص المجهري البصري ولكن مع المعلومات الطيفية الاهتزازية الإضافية التي تنشأ من امتصاص منتصف الأشعة تحت الحمراء. FISH هي تقنية شائعة الاستخدام لتحديد هوية الكائنات الحية الدقيقة على مستوى الخلية الواحدة. يمكن تصميم تسلسل قليل النوكليوتيدات لاستهداف تسلسلات 16S محددة من أصناف مختلفة ، ويمكن إرفاق الفلوروفورات المختلفة. يؤدي التهجين المحدد لمسبارات قليل النوكليوتيدات المصممة مع الحمض النووي الريبي المستهدف إلى إشارات مضان قوية للأنواع المستهدفة داخل الخلايا الفردية ، ويمكن إجراء التصوير الفلوري متعدد القنوات لتحديد أنواع متعددة داخل السكان. نظرا لأن كل من التصوير OPTIR والتصوير الفلوري يعتمدان على الكشف البصري ، فإن الجمع بين OPTIR و FISH مضان أمر سهل التنفيذ. تشترك الطريقتان في نفس الدقة البصرية لتحليل الخلية الواحدة ويمكن تبديلهما بسهولة دون الحاجة إلى محاذاة إضافية أو تسجيل مشترك.

يقدم هذا البروتوكول دليلا مفصلا للاستفادة من منصة OPTIR-FISH لتحليل متقدم لوظيفة بنية الخلية الواحدة. استخدمنا العينات البكتيرية المزروعة في 13وسطا يحتوي على الجلوكوز C كسرير اختبار وقمنا بقياس تخليق البروتين الجديد من 13C-glucose. من أجل إثبات قدرة المنصة على تحديد الخلايا ، استخدمنا مخاليط بكتيرية تم فيها تصنيف كل نوع باستخدام مجسات FISH التي تستهدف الحمض النووي الريبي الريبوزي. سهل هذا النهج التحديد الدقيق لخلية واحدة لسلالات بكتيرية معينة ، مثل الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) والبكتيريا ثييوتاوميكرون (B. theta) ، والتمثيل الغذائي لها. يوفر هذا البروتوكول للباحثين أداة قوية للتنميط الأيضي المتزامن وتحديد الأنواع على مستوى الخلية الواحدة ، مما يعد بتعزيز فهمنا للتفاعلات الخلوية وعلم وظائف الأعضاء وأدوارها في البيئات المعقدة.

Protocol

يتوافق استخدام العينات البكتيرية في هذه الدراسة مع إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بجامعة بوسطن والمعهد الوطني للصحة.

ملاحظة: يتم تلخيص سير العمل العام المتبع في هذا البروتوكول في الشكل 2.

1. الثقافة البكتيرية ووضع العلامات على النظائر (الشكل 2 أ)

ملاحظة: المثال الوارد هنا هو تسمية ثقافة بكتيرية نقية. في حالة تطبيق هذا البروتوكول على المجتمعات متعددة الميكروبات ، يجب تعديل الوسط ووقت الملصقات وفقا للمجتمع وفسيولوجيا الكائنات الحية ذات الأهمية.

  1. تلقيح السلالة البكتيرية ذات الأهمية من مستعمرة واحدة والزراعة المسبقة في وسط غني بالمغذيات مثل مرق الصويا التريبتيك (TSB) أو مرق لوريا بيرتاني (LB) لمدة 3 ساعات للوصول إلى مرحلة النمو الأسي (السجل). الإشريكية القولونية يتم استخدام BW25113 كمثال على سلالة في هذا البروتوكول.
    ملاحظة: سيختلف وقت الوصول إلى مرحلة السجل وفقا للسلالة المستخدمة. يجب تكييف هذه المرة مع كل سلالة.
  2. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر لتقدير تركيز البكتيريا.
  3. قم بإعداد الحد الأدنى من وسط النمو المكمل بركائز ذات علامات نظائرية. بالنسبة للإشريكية القولونية BW25113، استكمل الوسط البسيط M9 ب 13C-glucose بتركيز نهائي قدره 0.2٪ (وزن / حجم).
    ملاحظة: تم تصنيف 13جلوكوز C المستخدم (D-glucose U −13C6 ، 99٪) عالميا ، حيث تم استبدال جميع ذرات الكربون ب 13ذرة C. يعتمد اختيار الحد الأدنى من وسط النمو على السلالة البكتيرية. يعتمد اختيار ركيزة النظائر على عملية التمثيل الغذائي المحددة ذات الأهمية. الهدف العام هو أن تكون الركيزة النظيرية بمثابة مصدر التغذية الرئيسي مقارنة بنظيراتها غير المصنفة.
  4. تمييع البكتيريا في الحد الأدنى من وسط النمو الذي يحتوي على الركيزة ذات العلامات النظيرية إلى تركيز نهائي يبلغ 5 × 105 CFU / mL.
    ملاحظة: عادة ، يتم استخدام نسبة تخفيف عالية مثل 1: 100 ، وتصبح التغذية غير المصنفة من الوسط الغني ضئيلة. بدلا من ذلك ، لضمان الإزالة الكاملة للوسط الغني بالمغذيات ، يمكن إجراء الغسيل بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) عن طريق الطرد المركزي عند 14,000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة التعليق في PBS متبوعا بالطرد المركزي الثاني وإعادة التعليق النهائي في وسط النمو الأدنى.
  5. قم بزراعة عينات بكتيرية في حاضنة اهتزاز مدارية في ظل ظروف النمو المثلى. بشكل عام ، اضبط حاضنة الاهتزاز المداري على سرعة 220 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة 37 درجة مئوية ، وضع أنابيب الاستزراع مائلة بغطاء فضفاض للحضانة الهوائية. بالنسبة للإشريكية القولونية ، عادة ما تكون 24 ساعة من الحضانة الهوائية عند 37 درجة مئوية كافية للوصول إلى الحد الأقصى لوضع العلامات البالغ 13درجة مئوية.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على عملية التمثيل الغذائي ذات الأهمية. يؤدي وقت الحضانة الأطول بشكل عام إلى وضع علامات أعلى على النظائر. يمكن أن يوفر قياس منحنى النمو في نفس الحالة مع ركيزة غير مسماة نظرة ثاقبة لتحديد النقاط الزمنية المناسبة للجمع.
  6. اجمع الخلايا البكتيرية في النقاط الزمنية المرغوبة عن طريق الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها بحجم متساو من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS. قم بتثبيت الخلايا في محلول PFA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) أو ساعتين عند 4 درجات مئوية. للتخزين طويل الأجل ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من 50٪ (حجم / حجم) من PBS و 96٪ إيثانول ، وخزنها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

2. التهجين الموضعي المضان (FISH) (الشكل 2 ب)

  1. قم بتهجين بكتريا قولونية الخلايا باستخدام مسبار قليل النوكليوتيدات Gam42a10 المسمى بفلوروفور السيانين 5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) و B. خلايا ثيتا مع مسبار قليل النوكليوتيد Bac30311 المسمى بفلوروفور السيانين 3 (Cy3) (Bac303-Cy3) ، باتباع بروتوكول FISH القياسي.
    ملاحظة: أساسيات rRNA-FISH للتحديد: جزيئات الحمض النووي الريبي هي أهداف مثالية ل FISH حيث يتم توزيعها في كل مكان وتضخيمها بشكل طبيعي داخل الخلايا الميكروبية. يحتوي الحمض النووي الريبي أيضا على مناطق تسلسل محفوظة ومتغيرة بحيث يمكن تحديد عمق النشوء والتطور للمجموعة المستهدفة من خلال درجة حفظ مسبار قليل النوكليوتيدات. من خلال الارتباط المحدد للمسبار المصمم بالتسلسل المستهدف ، يظهر الفلوروفور الموسوم إشارات الفلورسنت للخلايا الفردية.
  2. راجع الأدبيات المنشورة سابقا12،13،14 للحصول على البروتوكول التفصيلي للتهجين الفلوري في الموقع . تصف الخطوات أدناه بإيجاز البروتوكول القياسي للخلايا الميكروبية.
    1. تجفاف:
      1. الطرد المركزي للخلايا الثابتة (100 ميكرولتر) عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق للحبيبات ، وإعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من الإيثانول من الدرجة التحليلية بنسبة 96٪ ، واحتضانها لمدة دقيقة واحدة في RT.
      2. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 14,000 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة الإيثانول ، واترك حبيبات الخلية تجف في الهواء.
    2. التهجين: تهجين الخلايا في محلول (100 ميكرولتر) لمدة 3 ساعات عند 46 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للتهجين من 900 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 20 ملي مولار من حمض الميثان الأميني ثلاثي (هيدروكسي ميثيل) ، و 1 ملي مولار من حمض رباعي الأسيتيك من الإيثيلين ديامين ، و 0.01٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم ، و 100 نانوغرام من قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت وتركيز الفورماميد المطلوب للحصول على شروط صارمة.
    3. جهاز الطرد المركزي: مباشرة بعد التهجين ، انقل العينات إلى جهاز طرد مركزي مع دوار مسخن مسبقا عند 46 درجة مئوية وجهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند درجة الحرارة القصوى المسموح بها (عادة 40 درجة مئوية).
    4. اغسل واخزن:
      1. اغسل العينات في مخزن مؤقت ذو صرامة مناسبة لمدة 15 دقيقة عند 48 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 14,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند درجة الحرارة القصوى المسموح بها في جهاز طرد مركزي مع دوار مسخن مسبقا عند 46 درجة مئوية.
      2. أخيرا ، اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS المثلج ، وأعد تعليقها في 20 ميكرولتر من 1x PBS ، وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
        ملاحظة: يتم ضمان الارتباط المحدد للمسبار من خلال صرامة التهجين الصحيحة. يمكن تحقيق صرامة عالية عن طريق زيادة درجة حرارة التهجين أو تقليل تركيز الملح أو إضافة فورماميد ممسح. تداخلات الفورماميد مع الروابط الهيدروجينية التي تعمل على استقرار الازدواج للحمض النووي. هنا ، لا يتم تعديل درجة الحرارة وتركيز الملح في التهجين أثناء ضبط تركيز الفورماميد. يتم تحديد تركيز الفورماميد الأمثل للمجسات المصممة حديثا تجريبيا باستخدام منحنيات تفكك الفورماميد10. يمكن العثور على تركيز الفورمميدات المطلوب للمجسات المنشورة في المسبار15 أو عن طريق البحث في الأدبيات. بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على تركيزات الفورماميد المتوقعة من التحليل في السيليكو باستخدام mathFISH16. في خطوة الغسيل ، تؤدي درجة الحرارة المرتفعة قليلا إلى حالة أكثر صرامة قليلا ، مما يؤدي إلى خصوصية ربط أعلى.

3. تحضير العينة (الشكل 2 ج)

  1. تنظيف الشرائح والطلاء:
    1. استخدم شرائح CaF2 القياسية (قطرها 10 مم وسمك 350 ميكرومتر للتوافق مع حامل عينة الجهاز). اغمر CaF2 في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة واشطفه مرتين بماء DI.
    2. انقل الشرائح التي تم تنظيفها إلى محلول بولي إل ليسين بنسبة 0.1٪ واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اشطف الشرائح مرة واحدة بماء DI وجففها في الهواء.
  2. قم بإذابة عينات الخلايا المحضرة في RT أثناء حمايتها من الضوء.
  3. لتجنب بلورات الملح الزائدة من PBS أثناء تجفيف العينة ، اتبع الخطوات 3.3.1-3.3.2.
    1. اغسل الخلايا مرتين بالماء منزوع الأيونات (DI). جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية.
    2. أضف الحجم الأصلي لماء DI والدوامة برفق. كرر الطرد المركزي وأضف DI Water Wash مرة أخرى.
  4. (اختياري) بالنسبة لعينات الخليط ، انقل نفس الحجم من كل عينة واخلطها في أنبوب طرد مركزي واحد.
  5. قم بتركيز عينات الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
  6. قم بدوامة المحلول المتبقي برفق لمدة ~ 30 ثانية وأضف 1-2 ميكرولتر من المحلول على شريحة CaF2 المعدة. جفف العينة بالهواء لمدة 30 دقيقة مع حمايتها من الضوء.
    ملاحظة: يجب أن تظهر نقطة مستديرة صغيرة على الشريحة بعد التجفيف بالهواء. بسبب تأثير "حلقة القهوة" ، سيكون لحواف النقطة كثافة أعلى من الخلايا البكتيرية. تتمثل خطوة الطرد المركزي هذه في الوصول إلى كثافة مناسبة للتصوير البكتيري أحادي الخلية بكفاءة. يجب أن يؤدي التركيز المثالي إلى طبقة موحدة وكثيفة من الخلايا البكتيرية الفردية تحت المجهر. إذا كانت هناك حبيبات واضحة يمكن رؤيتها بالعين المجردة بعد جهاز الطرد المركزي ، فقم بإزالة المادة الطافية بحيث يبدو المحلول واضحا تقريبا بعد الدوامة. يمكن إجراء اختبار سريع على عينة التحكم لتقدير حجم إزالة المادة الطافية. يمكن ترسيب مجموعة من القطرات بكميات مختلفة من المادة الطافية المتبقية على شريحة زجاج المجهر لفحص حجم التخفيف الأمثل تحت مجهر المجال الساطع. إذا لم يكن هناك حبيبات مرئية بعد الطرد المركزي ، فقم بإزالة معظم المادة الطافية لتركيز العينات إلى أقصى حد. الحيلة هي وضع أنبوب الطرد المركزي مع المفصلة من الخارج في دوار بزاوية ثابتة بحيث تظهر الحبيبات على نفس الجانب من مفصلة الأنبوب. بالإضافة إلى ذلك، قم بتسوية أحجام الماصات (P1000 وP200 وP10) لزيادة الدقة أثناء إزالة المادة الطافية للحفاظ على الحبيبات سليمة.
  7. قم بتركيب الشريحة في حامل عينة مرفق واستخدم نقاطا صغيرة من شريط البوليستر لتأمين الشريحة أثناء القياس.

4. تصوير OPTIR-FISH

ملاحظة: سيتم إجراء التصوير الفلوري والتصوير OPTIR على نظام OPTIR.

  1. هندسة النظام:
    1. استخدم الانتشار المضاد لمضخة الأشعة تحت الحمراء المتوسطة والمسبار المرئي ، والكشف العكسي (epi) للضوء المرئي باستخدام هذا البروتوكول.
    2. لتركيز الضوء المرئي وجمع الضوء المرئي المنعكس والمتناثر ، استخدم هدفا جويا (50 × 0.8NA). لتركيز ضوء الأشعة تحت الحمراء الوسطى، استخدم هدف Cassegrain (40x 0.78NA).
    3. تأكد من أن النظام مجهز أيضا بوحدة مضان epi واسعة المجال مع مجموعات مرشحات مضان متعددة. بالنسبة للفلوروفورات المستخدمة في هذا البروتوكول ، حدد مجموعة مرشح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) للكشف عن Cy3 ومجموعة مرشح Alexa Fluor 647 للكشف عن Cy5.
  2. استعد للقياسات:
    1. قم بتشغيل النظام وافتح برنامج التحكم في الأجهزة. بعد التهيئة ، قم بتبديل شريط تمرير Counterprop و Fluorescence إلى موضع التشغيل.
    2. قم بتعيين الهدف ليكون 50x ، ثم قم بإجراء الخلفية التلقائية للحصول على طيف طاقة الأشعة تحت الحمراء. استخدم طيف الطاقة لتطبيع أطياف العينة المكتسبة أو تطبيع صور OPTIR بأرقام موجية مختلفة. سيؤدي ذلك إلى استبعاد تأثير اختلافات طاقة الليزر في منتصف الأشعة تحت الحمراء على تحليل البيانات وتقديرها الكمي.
      ملاحظة: يعد الحصول على أطياف طاقة الأشعة تحت الحمراء للتطبيع أمرا ضروريا للتحليل الكمي النهائي حيث ترتبط الشدة المقاسة خطيا بقوة الأشعة تحت الحمراء. بعد إجراء الخلفية التلقائية ، سيقوم البرنامج بتطبيع أطياف OPTIR وصور OPTIR إلى أطياف طاقة الأشعة تحت الحمراء تلقائيا للمستخدمين. يمكن أن يؤدي تطهير النظام باستخدام N2 إلى تقليل تأثير بخار الماء وزيادة قابلية التكاثر بين التجارب.
  3. لتحميل العينة، استخدم الزر إلغاء تحميل لنقل مرحلة العينة للخارج. استخدم هدف تكبير منخفض مثل 10x لتحديد موقع منطقة العينة والانتقال إلى المنطقة ذات كثافة العينة المثلى. ركز العينة عن طريق ضبط ارتفاع الهدف في برنامج التحكم. قم بتغيير تحديد الهدف إلى 50x.
  4. الحصول على الصور
    ملاحظة: العينات المستخدمة هي: أنا) الإشريكية القولونية (13جلوكوز محتضن) ؛ ب) الإشريكية القولونية (12جلوكوز محتضن) ؛ ج) ب. ثيتا (12ج-جلوكوز محتضن) ؛ رابعا) خليط من الإشريكية القولونية (13C-glucose محتضن) و B. ثيتا (12C-glucose محتضنة).
    1. صور المجال الساطع (الشكل 2D): اجعل العينة في التركيز من خلال النظر إلى صور المجال الساطع.
    2. صور التألق (الشكل 2E): قم بتغيير مجموعة المرشح بالنقر فوق زر اسم المرشح (GFP ل Cy3 و Alexa Fluor 647 ل Cy5) للكشف عن الفلوروفورات المرتبطة بمجسات FISH المصممة والحصول على التصوير الفلوري بالتتابع باستخدام وحدة التألق في البرنامج. اضبط شدة الضوء ووقت التعرض للحصول على تباين إشارة مناسب قبل تبييض الفلوروفورات.
      ملاحظة: نظرا لأن المسبار المستخدم في قياسات OPTIR قد يبيض الفلوروفورات الضوئية ، فاحصل دائما على صور مضان قبل صور OPTIR. للقلق بشأن تأثير علامات الفلورسنت على اكتشاف OPTIR ، راجع عمل منشور سابقا أظهر أن FISH مع Cy5 fluorophore لا يؤثر على التقدير الكمي التالي بناء على صور OPTIR حيث أن Cy5 صغير الحجم ومنخفض الوفرة مقارنة بالبروتين البكتيريالمستهدف 9.
    3. صور OPTIR (الشكل 2F):
      1. تحديد الذروة الطبيعية وموضع الذروة المتغير باللون الأحمر الناجم عن النظائر. في حالة تخليق البروتين من 13C-glucose ، يتم الكشف عن ذروة الأميد I الطبيعية عند حوالي 1656 سم -1 ، وتكون الذروة ذات الانزياح الأحمر عند حوالي 1612 سم -1 (الشكل 3 أ).
        ملاحظة: يعتمد وضع الذروة الطبيعي على المكون الكيميائي الحيوي و / أو المنتج الأيضي ذي الأهمية. يعتمد موضع الذروة المتحول أيضا على النظير المستخدم في وضع العلامات. يمكن أيضا تحديد هذين الرقمين الموجيين تجريبيا عن طريق قياس الأطياف الكاملة للخلايا غير المسماة والمسماة إلى أقصى حد (انظر الخطوة 4.5)
      2. اضبط الطول الموجي لمضخة الأشعة تحت الحمراء إلى 1656 سم -1 باستخدام البرنامج. قم بتعديل قوة المسبار وكسب الكاشف وفقا لذلك لتجنب تشبع إشارة التيار المستمر (8 فولت). اضبط ارتفاع هدف Cassegrain السفلي لزيادة إشارة التيار المتردد إلى أقصى حد.
        ملاحظة: تبلغ طاقة الأشعة تحت الحمراء النموذجية في العينة حوالي 5 ميجاوات ، وتبلغ طاقة المسبار في العينة حوالي 3-15 ميجاوات ، اعتمادا على العينة. يمكن ضبط كل من طاقة الأشعة تحت الحمراء والمسبار باستخدام برنامج التحكم لتحسين مستوى الطاقة لضمان تباين عال في الصورة مع تجنب إتلاف الخلايا.
      3. اضبط صور OPTIR لتحتوي على 200 × 200 بكسل واضبط معدل المسح الضوئي على 100 ميكرومتر / ثانية. اضبط حجم الخطوة في الاتجاهين X و Y على 150 نانومتر بحيث يكون حجم الصورة حوالي 30 × 30 ميكرومتر2.
      4. احصل على الصورة.
      5. اضبط الطول الموجي لمضخة الأشعة تحت الحمراء إلى 1612 سم -1 واحصل على صورة من نفس مجال الرؤية في هذا الرقم الموجي.
      6. لكل عينة، صور ثلاثة حقول رؤية على الأقل للتحليل الإحصائي.
  5. (اختياري) القياس الطيفي: بعد الحصول على الصورة ، إذا تم تحديد موقع ميزة مكانية ذات أهمية ، فقم بإجراء القياس الطيفي.
    1. تحديد المواقع: اختر نقطة واحدة أو حدد مصفوفة من النقاط للتحليل في الوحدة الطيفية للبرنامج.
    2. تعيين معلمة المسح الطيفي. حدد نطاق تغطية الرقم الموجي وسرعة المسح الضوئي وتباعد إخراج البيانات بناء على المتطلبات.
      ملاحظة: إذا كانت سرعة المسح الضوئي وتباعد إخراج البيانات مختلفين مقارنة بتلك المستخدمة في خطوة الحصول على الخلفية (الخطوة 4.2)، فستكون هناك حاجة إلى خلفية جديدة تستند إلى معلمات المسح الطيفي الحالية للتسوية الصحيحة.
    3. قم بتعيين رقم المتوسط المشترك وابدأ القياس الطيفي. تؤدي زيادة المتوسط المشترك أيضا إلى زيادة الإشارة إلى ضوضاء الأطياف ولكنها تتطلب أوقات اكتساب أطول.
      ملاحظة: إذا لوحظ تذبذب كبير أثناء المتوسط المشترك ، فقد يشير ذلك إلى عدم استقرار العينة الناجم عن التسخين بالليزر. يمكن معالجة ذلك غالبا عن طريق خفض طاقة الأشعة تحت الحمراء و / أو خفض قوة المسبار المرئية.

5. معالجة البيانات وتحليلها على مستوى الخلية الواحدة

  1. تحديد التخليق الأيضي من ركائز النظائر (الشكل 2G)
    ملاحظة: يعتمد القياس الكمي التالي لدمج التمثيل الغذائي من ركائز النظائر على صور OPTIR ذات الرقم الموجي المزدوج المقابلة للقمم الطبيعية والمتغيرة للجزيئات الكبيرة المستهدفة. بالمقارنة مع المكدس الفائق الطيفي الكامل ، يمكن للتصوير ثنائي الرقم الموجي أن يقلل بشكل كبير من الوقت المطلوب لكل مجال رؤية ويحسن الإنتاجية مع استعادة التأثير النظيري الحاسم لقياس التمثيل الغذائي بالكامل.
    1. طرح صورة OPTIR الذروة المتغيرة من صورة OPTIR الذروة العادية يولد خريطة مرئية لأنشطة التوليف من ركائز النظائر. كعرض توضيحي (الشكل 3C) ، بالنسبة للإشريكية القولونية المستزرعة ب 13C-glucose ، تشير وحدات البكسل الموجبة في الصورة (1656 سم -1-1612 سم -1) إلى الدمج النشط ل 13درجة مئوية في البروتينات ، وبالتالي ، مستوى تخليق بروتين أعلى.
      ملاحظة: يمكن إجراء الطرح باستخدام وظيفة حاسبة الصور ImageJ. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء الطرح بسهولة بأي لغة برمجة مفضلة لمعالجة الدفعات.
    2. القياس الكمي لنشاط التمثيل الغذائي أحادي الخلية
      1. احصل على المعاملات (ممثلة ب h في الشكل 2G) من عينات مرجعية غير مصنفة ومسماة بالكامل. نظرا لأن الذروة ذات الانزياح الأحمر الناجم عن النظائر ستتداخل جزئيا مع الذروة العادية ، فإن كل من العينات غير المسماة والمسمية (التي تم تصنيعها حديثا من الركيزة ذات العلامات النظيرية) ستساهم في إشارات OPTIR عند الذروة العادية والمتغيرة. حدد هذه المساهمات المختلفة باستخدام شدة إشارة OPTIR المعادية في الذروة العادية والمتغيرة من العينات المرجعية غير المسماة والمسمية بالكامل.
        ملاحظة: بالنسبة للعينات المرجعية ، يتم زراعة العينات المرجعية غير المسماة (أو احتضانها) بدون أي ركيزة مصنفة نظائر. عادة ما تزرع العينات المرجعية المصنفة بالكامل بأعلى تركيز من الركيزة المصنفة نظائريا مع أطول وقت للزراعة.
      2. لتحليل الخلية الواحدة ، احصل على أقنعة أحادية الخلية بناء على صور المجال الساطع.
        ملاحظة: يمكن تطبيق تقنيات مختلفة في معالجة الصور هنا لإنشاء هذا القناع ، بما في ذلك الكشف عن الجسيمات المختلفة مثل تحليل النقطة وطرق تجزئة الخلايا مثل مستجمعات المياه.
      3. قم بقياس شدة إشارة OPTIR من الخلايا الفردية. قم بتطبيق قناع الخلية المكتسبة على صورتي OPTIR (في الذروة العادية والذروة المتغيرة)، ولكل خلية مفردة، قم بحساب متوسط قيم البكسل في منطقة قناع الخلية الواحدة. سيتم استخدام متوسط القيمة من الخلايا الفردية في القياس الكمي.
      4. وبالنسبة لكل خلية، احسب المساهمة النسبية للمكونات الحيوية غير المسماة والمسمية استنادا إلى المعاملات الواردة من الخطوة 1.2.1.5 والإشارات من الخطوة 3.1.1.5.
        ملاحظة: يتم تعريف نسبة استبدال النظائر على أنها المساهمة النسبية للمكونات الحيوية المصنفة على مجموع كل من المكونات الحيوية المصنفة وغير المسماة (الشكل 2G). يجب أن تقع هذه النسبة في حدود 0 إلى 1. تتناسب نسبة استبدال النظائر خطيا مع نسبة الجلوكوز C 13إلى 12C الجلوكوز (مع كمية الجلوكوز الإجمالية الثابتة)9. تم إثبات حساسية الكشف العالية بنسبة 5٪ 13C-glucose لخلايا الإشريكية القولونية .
  2. تحديد الأنواع البكتيرية من صور التألق متعددة القنوات (الشكل 2H)
    1. ادمج قنوات التألق متعددة الألوان لإنشاء إرشادات مرئية لأنواع البكتيريا المختلفة باستخدام ImageJ (صورة > لون > دمج القنوات).
    2. لتحليل الخلية الواحدة ، لكل قناة مضان ، قم بإنشاء مجموعة من مناطق الاهتمام (ROIs) للخلايا الفردية.
      ملاحظة: يمكن تطبيق تقنيات مختلفة في معالجة الصور هنا لإنشاء القناع ، بما في ذلك طرق العتبة التلقائية المختلفة وطرق تجزئة الخلايا.
  3. ربط هويات FISH وأنشطة التمثيل الغذائي OPTIR (الشكل 2I)
    1. اربط الهويات البكتيرية على مستوى الخلية المفردة من صور FISH المضان مباشرة بأنشطة التمثيل الغذائي من صور OPTIR من خلال ربط مواضع عائد الاستثمار.
    2. إجراء تحليل إحصائي لمقارنة أنشطة التمثيل الغذائي للأنواع المختلفة.
      ملاحظة: يتم إنشاء الأقنعة بشكل منفصل عن صور التألق وصور OPTIR لأنه يمكن تحليل أنشطة التمثيل الغذائي لجميع الخلايا من صور OPTIR ، بينما لن تظهر الخلايا غير المعروفة على أي من قنوات التألق. هذا يضمن إمكانية تضمين جميع الخلايا في تحليل التمثيل الغذائي. إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا المجهولة ، فقد يلزم النظر في مجسات FISH المختلفة التي تستهدف الحمض النووي الريبي من أصناف مختلفة ذات أهمية.

النتائج

يتم تلخيص سير العمل العام لتحليل التمثيل الغذائي الميكروبي أحادي الخلية مع التحديد الجيني بواسطة OPTIR-FISH في الشكل 2. تظهر النتائج التمثيلية التي توضح قدرة التصوير الأيضي أحادي الخلية ل OPTIR في الشكل 3. استخدم هذا المثال بكتريا قولونية خلايا ?...

Discussion

هنا ، وصفنا بروتوكولا مفصلا لتطبيق منصة OPTIR-FISH للتحديد المتزامن للأنواع الميكروبية والقياس الكمي لأنشطة التمثيل الغذائي بدقة الخلية الواحدة. تشمل الخطوات الحاسمة الاستزراع مع وضع العلامات على النظائر المستقرة لدراسة أنشطة التمثيل الغذائي المحددة والتهجين الفلوري ف...

Disclosures

Y.B. هو مستشار بدوام جزئي لشركة Photothermal Spectroscopy Corp.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة R35GM136223 ، R01AI141439 إلى J.X.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96% EthanolThermoScientificT032021000
Calcium FluorideCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
formamideThermoScientific17899
Luria-Bertani broth Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Minimal Salts 5xSIGMAM6030-1KG
OPTIR instrumentPhotothermal Spectroscopy Corp.mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBSThermoScientificJ19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-25G
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichL3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%ThermoScientificA11379.18
Trypic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G

References

  1. Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
  2. Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
  3. Epstein, S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  4. Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -. Q., Yang, J. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).
  5. Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).
  6. Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis. Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).
  7. Porta Siegel, T., et al. Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues. Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).
  8. Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species. Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).
  9. Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -. X. Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells. Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).
  10. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -. H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions. System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).
  11. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -. H. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).
  12. Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. Molecular Microbial Ecology. , (2004).
  13. Bridger, J. M., Volpi, E. V. . Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).
  14. Wang, D. O., et al. A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes. RNA. 18 (1), 166-175 (2012).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).
  16. Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).
  17. Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy. Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).
  18. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering. Nat Commun. 12 (1), 7097 (2021).
  19. Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -. X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci Adv. 7 (20), (2021).
  20. Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -. X. Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications. J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).
  21. Du, J., Wang, H., Wei, L. Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes. ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).
  22. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Phys Biol. 16 (4), 041003 (2019).
  23. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  24. Bai, Y., et al. Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems. Nat Commun. 15 (1), 350 (2024).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Ge, X., et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119 (2022).
  27. Bai, Y., et al. Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption. Sci Adv. 5 (7), 7127 (2019).
  28. Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -. X. High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering. J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).
  29. Lin, H., et al. Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat Commun. 12 (1), 3052 (2021).
  30. Fu, P., et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat Photon. 17, 330-337 (2023).
  31. Tamamitsu, M., et al. Mid-infrared widefield nanoscopy. arXiv. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204 OPTIR FISH FISH RRNA OPTIR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved