Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהכלאה פוטותרמית פוטותרמית-פלואורסצנטית באתרו (OPTIR-FISH), הידועה גם בשם MID-INFRARED PHOTOTHERMAL-FISH (MIP-FISH), כדי לזהות תאים בודדים ולהבין את חילוף החומרים שלהם. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב עבור יישומים מגוונים, כולל מיפוי מטבוליזם תאי עם רזולוציה של תא יחיד.

Abstract

הבנת הפעילות המטבולית של תאים בודדים בתוך קהילות מורכבות היא קריטית לפענוח תפקידם במחלות אנושיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לזיהוי תאים בו זמנית וניתוח מטבולי עם פלטפורמת OPTIR-FISH על ידי שילוב של בדיקות FISH המתויגות ב- rRNA ומצעים המסומנים באיזוטופים. דימות פלואורסצנטי מספק זיהוי תאים על ידי קשירה ספציפית של בדיקות FISH המתויגות ב-rRNA, בעוד שהדמיית OPTIR מספקת פעילויות מטבוליות בתוך תאים בודדים על ידי הסחה לאדום המושרה על ידי איזוטופים בספקטרום OPTIR. באמצעות חיידקים בתרבית עם 13C-גלוקוז כמיטת בדיקה, הפרוטוקול מתאר תרבית מיקרוביאלית עם תיוג איזוטופי, הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), הכנת דגימות, אופטימיזציה של מערך ההדמיה OPTIR-FISH, ורכישת נתונים. אנו גם מדגימים כיצד לבצע ניתוח תמונה ולפרש נתונים ספקטרליים ברמת התא היחיד עם תפוקה גבוהה. אופיו הסטנדרטי והמפורט של פרוטוקול זה יקל מאוד על אימוצו על ידי חוקרים מרקעים ודיסציפלינות מגוונות בקהילת המחקר הרחבה של מטבוליזם חד-תאי.

Introduction

חילוף החומרים התאי עומד כעמוד יסוד בביולוגיה של התא, ומנווט תהליכים רבים הקובעים את בריאות התא, תפקודו והאינטראקציה עם הסביבה. ניתוח חילוף החומרים ברמת התא הבודד, במיוחד בסביבות המקומיות, מספק תובנות שלא יסולא בפז כדי לחשוף את הפעילויות ההטרוגניות והמורכבות במערכות ביולוגיות1. זה חיוני במיוחד בחקר מיקרואורגניזמים, שכן מיקרובים רבים מפגינים דרישות גידול ייחודיות או תלות סביבתית המאתגרת את שיטות הגידול המסורתיות2. לדוגמה, מינים מסוימים עשויים לדרוש הרכבי חומרים מזינים ספציפיים או יחסים סימביוטיים שאינם משוכפלים בקלות בתנאי מעבדה, ובכך להפוך אותם לבלתי ניתנים להתרבות בטכניקות סטנדרטיות3. יתר על כן, התקופות הממושכות הדרושות לגידול מינים מסוימים מציבות אתגרים משמעותיים למחקר מיקרוביולוגי, המתארכים לעתים קרובות מעבר למסגרות זמן מעשיות למחקר וניתוח. כדי לעקוף מגבלות אלה, שיטות חלופיות כגון תגובת שרשרת פולימראז והכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) מאפשרות זיהוי של מיני מיקרואורגניזמים ללא צורך בגידול4, אשר יכול להשיג ראייה מדויקת והוליסטית יותר של מערכות אקולוגיות מיקרוביות. עם זאת, טכנולוגיות אנליטיות אלה חסרות את היכולת להבהיר את חילוף החומרים התאי. פער זה מדגיש את האתגרים המתמשכים בתחום המיקרוביולוגיה: המשימה המקבילה של התמיינות הזהות התאית והבהרת חילוף החומרים ברמת התא הבודד. התקדמות בטכניקות כגון ספקטרומטריית מסות הדמיה (IMS) בשילוב עם איזוטופים יציבים התגלו ככלים רבי עוצמה לניתוח מטבולי של תא בודד5. בניסויים אלה, תאים הודגרו עם מצעים המכילים איזוטופים כגון 13C או 15N. הביומולקולות החדשות נושאות איזוטופים אלה, מה שהופך אותם לניתנים להבחנה על ספקטרום m/z. עם זאת, IMS סובל ממכשור יקר, הכנת דגימות מסובכת, תפוקה נמוכה יחסית ומומחיות הנדרשת לניתוח ספקטרום m/z. בשילוב עם דימות פלואורסצנטי ספציפי לסמנים מולקולריים, נעשו התקדמות בהבהרת חילוף החומרים התאי עם ספציפיות מוגברת6. עם זאת, עדיין קיימים אתגרים בגישור בין שתי האופנים. ההבדל ברזולוציה בין IMS לבין דימות פלואורסצנטי, בשילוב עם מערכים תפעוליים שונים, מקשה על יישור והתאמה של ממצאים7.

השילוב של הדמיה ספקטרוסקופית תנודתית עם תיוג איזוטופים יציב מציע פתרון חדשני לחקר מטבוליזם של תא יחיד. שילוב איזוטופים כבדים יותר מאט את הרטט של קשרים כימיים, מה שמוביל לפסגות מוסטות לאדום בספקטרום הרטט8. יש לציין כי דימות רטט מספק רזולוציה מרחבית הדומה לדימות פלואורסצנטי, וניתן לבצע הן כימות מטבולי והן זיהוי תאים במערך יחיד, המפשט את רישום התמונה ואת הקורלציה. עבודתנו האחרונה הדגימה את השילוב של פלטפורמת דימות רטט מתקדמת: אינפרא-אדום פוטותרמי אופטי (OPTIR) עם הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) כדי לחקור את חילוף החומרים של גלוקוז בקהילות חיידקים9 (איור 1). OPTIR היא מערכת מיקרוסקופיה ספקטרוסקופית תנודתית הרותמת את האפקט הפוטותרמי של בליעת אינפרא-אדום בינוני על ידי גילוי שינוי האור הנראה, המספק רזולוציה תת-מיקרומטרית כמו במיקרוסקופ אופטי אך עם מידע ספקטרוסקופי רטט נוסף שמקורו בבליעה של אינפרא-אדום אמצעי. FISH היא טכניקה נפוצה לקביעת זהות המיקרואורגניזם ברמת התא היחיד. רצף האוליגונוקלאוטידים יכול להיות מתוכנן כך שיתמקד ברצפי 16S ספציפיים של טקסים שונים, וניתן יהיה לחבר פלואורופורים שונים. הכלאה ספציפית של בדיקות האוליגונוקלאוטיד המתוכננות עם rRNA המטרה מובילה לאותות פלואורסצנטיים חזקים של מיני מטרה בתוך תאים בודדים, וניתן לבצע הדמיה פלואורסצנטית רב-ערוצית כדי לזהות מינים מרובים בתוך האוכלוסייה. מכיוון שגם OPTIR וגם דימות פלואורסצנטי מבוססים על זיהוי אופטי, שילוב של פלואורסצנטיות OPTIR ו- FISH הוא פשוט ליישום. שתי השיטות חולקות את אותה רזולוציה אופטית לאנליזה של תא בודד וניתן להחליף ביניהן בנוחות ללא צורך ביישור נוסף או רישום משותף.

פרוטוקול זה מציג מדריך מפורט למינוף פלטפורמת OPTIR-FISH לניתוח מתקדם של מבנה-פונקציה של תא יחיד. השתמשנו בדגימות החיידקים שגדלו ב-13מדיה המכילה גלוקוז C כמצע בדיקה וכימתנו סינתזת חלבון דה נובו מ-13C-glucose. כדי להדגים את היכולת של הפלטפורמה לזהות תאים, השתמשנו בתערובות חיידקים שבהן כל מין סומן באמצעות בדיקות FISH ממוקדות rRNA. גישה זו אפשרה זיהוי מדויק של זני חיידקים ספציפיים, כגון Escherichia coli (E. coli) ו-Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), ואת חילוף החומרים שלהם. פרוטוקול זה מציע לחוקרים כלי רב עוצמה ליצירת פרופיל מטבולי סימולטני ולזיהוי מינים ברמת התא הבודד, ומבטיח לקדם את הבנתנו את האינטראקציות התאיות, הפיזיולוגיה ותפקידן בסביבות מורכבות.

Protocol

השימוש בדגימות חיידקים במחקר זה הוא בהתאם להנחיות מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת בוסטון והמכון הלאומי לבריאות.

הערה: זרימת העבודה הכללית המבוצעת בפרוטוקול זה מסוכמת באיור 2.

1. תרבית חיידקים ותיוג איזוטופים (איור 2A)

הערה: הדוגמה שניתנה כאן היא לתיוג תרבית חיידקים טהורה. אם מיישמים פרוטוקול זה על קהילות פולימיקרוביאליות, יש להתאים את המדיום ואת זמן התיוג בהתאם לקהילה ולפיזיולוגיה של האורגניזמים המעניינים.

  1. חסן את זן החיידקים המעניין ממושבה אחת וקדם-תרבות במדיום עשיר בחומרים מזינים כגון ציר סויה טריפטי (TSB) או מרק לוריא-ברטאני (LB) במשך 3 שעות כדי להגיע לשלב הצמיחה המעריכית (יומן). אי קולי BW25113 משמש כזן לדוגמה בפרוטוקול זה.
    הערה: הזמן להגיע לשלב היומן ישתנה בהתאם לזן שבשימוש. הזמן הזה צריך להיות מותאם לכל זן.
  2. מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר כדי להעריך את ריכוז החיידקים.
  3. הכינו מצע גידול מינימלי בתוספת מצעים בעלי תווית איזוטופית. עבור E. coli BW25113, יש להשלים את המדיום המינימלי M9 עם 13C-גלוקוז בריכוז סופי של 0.2% (w/v).
    הערה: 13C-glucose בשימוש (D-glucose U−13C6, 99%) היה מסומן באופן אוניברסלי, שבו כל אטומי הפחמן הוחלפו עם 13אטומי C. הבחירה של מדיום גידול מינימלי יהיה תלוי זן חיידקי. הבחירה של מצע איזוטופ יהיה תלוי בתהליך מטבולי ספציפי של עניין. המטרה הכוללת היא שהמצע האיזוטופי ישמש כמקור התזונתי העיקרי בהשוואה למקביליהם הלא מסומנים.
  4. לדלל חיידקים במצע הגידול המינימלי המכיל את המצע המסומן איזוטופית לריכוז סופי של 5 × 105 CFU/mL.
    הערה: בדרך כלל משתמשים ביחס דילול גבוה כמו 1:100, והתזונה הלא מסומנת מהמדיום העשיר הופכת לזניחה. לחלופין, כדי להבטיח הסרה מלאה של המדיום העשיר בחומרים מזינים, שטיפה עם מלח חוצץ פוספט 1x (PBS) יכולה להתבצע על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ומתלה ב PBS ואחריו צנטריפוגה שנייה והשעיה סופית במדיום הגידול המינימלי.
  5. לגדל דגימות חיידקים באינקובטור רעד מסלולי, בתנאי גידול אופטימליים. באופן כללי, הגדר את אינקובטור הרעידות המסלוליות למהירות של 220 סל"ד וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ומקם את צינורות התרבית מוטים עם מכסה רופף לדגרה אירובית. עבור E. coli, 24 שעות של דגירה אירובית ב 37 ° C הוא בדרך כלל מספיק כדי להגיע תיוג מקסימלי של 13C.
    הערה: זמן הדגירה תלוי בתהליך המטבולי של עניין. זמן דגירה ארוך יותר מוביל בדרך כלל לתיוג איזוטופי גבוה יותר. מדידת עקומת גדילה באותו מצב עם מצע לא מסומן יכולה לספק תובנה לגבי קביעת נקודות זמן האיסוף המתאימות.
  6. לאסוף תאי חיידקים בנקודות הזמן הרצויות על ידי צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  7. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש בנפח שווה של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב- PBS. תקן את התאים בתמיסת PFA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או שעתיים ב- 4 ° C. לאחסון לטווח ארוך, שטפו את התאים פעמיים עם PBS, השהו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של 50% (v/v) של PBS ו-96% אתנול, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.

2. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) (איור 2B)

  1. הכלאה של תאי E. coli עם בדיקת האוליגונוקלאוטיד Gam42a10 המסומנת עם ציאנין5 (Cy5) פלואורופור (Gam42a-Cy5) ותאי B. theta עם בדיקת האוליגונוקלאוטיד Bac30311 המסומנת בציאנין3 (Cy3) פלואורופור (Bac303-Cy3), בהתאם לפרוטוקול FISH סטנדרטי.
    הערה: יסודות rRNA-FISH לזיהוי: מולקולות rRNA הן מטרות אידיאליות של FISH מכיוון שהן מופצות בכל מקום ומועצמות באופן טבעי בתוך תאים מיקרוביאליים. rRNA מכיל גם אזורי רצף שמורים ומשתנים, כך שהעומק הפילוגנטי של קבוצת היעד יכול להיקבע על ידי מידת השימור של בדיקת האוליגונוקלאוטידים. על ידי קשירה ספציפית של הגשושית המתוכננת לרצף המטרה, הפלואורופור המתויג מראה אותות פלואורסצנטיים עבור תאים בודדים.
  2. עיין בספרות 12,13,14 שפורסמה בעבר לפרוטוקול מפורט להכלאה פלואורסצנטית באתר. השלבים הבאים מתארים בקצרה את הפרוטוקול הסטנדרטי עבור תאים מיקרוביאליים.
    1. התייבשות:
      1. צנטריפוגה את התאים הקבועים (100 μL) ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות כדי כדור, resuspend ב 100 μL של 96% אתנול ברמה אנליטית, ולדגור במשך 1 דקות ב RT.
      2. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים שוב ב 14,000 x גרם במשך 5 דקות, להסיר את האתנול, ולתת לגלולה התא להתייבש באוויר.
    2. הכלאה: הכלאה של התאים בתמיסה (100 מיקרוליטר) למשך 3 שעות ב-46°C.
      הערה: מאגר ההכלאה מורכב מ-900 mM NaCl, 20 mM Tris-(hydroxymethyl)-amino methane HCl, 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid, 0.01% נתרן דודצילסולפט, 100 ng של אוליגונוקלאוטיד המסומן פלואורסצנטית בהתאמה וריכוז פורממיד נדרש כדי להשיג תנאים מחמירים.
    3. צנטריפוגה: מיד לאחר ההכלאה, מעבירים את הדגימות לצנטריפוגה עם רוטור שחומם מראש ב 46 ° C וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה המרבית המותרת (בדרך כלל 40 ° C).
    4. לשטוף ולאחסן:
      1. שטפו את הדגימות במאגר של מחמירות מתאימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 48°C. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב 14,000 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורה המקסימלית המותרת בצנטריפוגה עם רוטור שחומם מראש ב 46 ° C.
      2. לבסוף, לשטוף את התאים עם 500 μL של PBS קר כקרח, להשעות אותם ב 20 μL של 1x PBS, ולאחסן אותם ב 4 ° C עד לשימוש נוסף.
        הערה: הקשירה הספציפית של הגשושית מובטחת על ידי החמרת הכלאה נכונה. החמרה גבוהה יכולה להיות מושגת על ידי הגדלת טמפרטורת ההכלאה, הפחתת ריכוז המלח, או הוספת פורממיד דנטורנטי. פורממיד מפריע לקשרי המימן המייצבים דופלקסים של חומצות גרעין. כאן, הטמפרטורה וריכוז המלח אינם משתנים בהכלאה בעת כוונון ריכוז הפורממיד. ריכוז הפורממיד האופטימלי עבור גשושיות שתוכננו לאחרונה נקבע באופן ניסיוני באמצעות עקומות דיסוציאציה פורממיד10. את ריכוז הפורממיד הנדרש לבדיקות שפורסמו ניתן למצוא בבדיקה15 או בחיפוש ספרותי. לחלופין, ניתן לקבל ריכוזי פורממיד חזויים מניתוח in-silico באמצעות mathFISH16. בשלב הכביסה, טמפרטורה מעט גבוהה יותר מובילה למצב מעט מחמיר יותר, מה שמוביל לספציפיות קשירה גבוהה יותר.

3. הכנת הדגימה (איור 2C)

  1. ניקוי שקופיות וציפוי:
    1. השתמש בשקופיות CaF2 סטנדרטיות (קוטר 10 מ"מ ועובי 350 מיקרומטר לתאימות עם מחזיק דגימת המכשיר). יש לטבול את CaF2 באתנול 70% למשך 15 דקות ולשטוף פעמיים במי DI.
    2. העבירו את המגלשות המנוקות לתמיסת פולי-L-ליזין 0.1% ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. שטפו את המגלשות פעם אחת במי DI וייבשו באוויר.
  2. הפשירו את דגימות התאים המוכנות ב-RT בעודן מוגנות מפני אור.
  3. כדי למנוע גבישי מלח מוגזמים מ-PBS במהלך ייבוש הדגימה, בצע את השלבים 3.3.1-3.3.2.
    1. שטפו את התאים פעמיים במים שעברו דה-יוניזציה (DI). צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant.
    2. הוסף בחזרה את הנפח המקורי של מי DI ומערבולות בעדינות. חזור על הצנטריפוגה והוסף שוב את שטיפת המים DI.
  4. (אופציונלי) עבור דגימות תערובת, להעביר את אותו נפח מכל דגימה ולערבב לתוך צינור צנטריפוגה אחד.
  5. רכז את דגימות תאי החיידק באמצעות צנטריפוגה במהירות של 14,000 x גרם למשך 10 דקות והסר את הסופרנטנט.
  6. מערבלים בעדינות את התמיסה הנותרת עבור ~ 30 שניות ומוסיפים 1-2 μL של תמיסה על שקופית CaF2 המוכנה. יבשו את הדגימה באוויר למשך 30 דקות כשהיא מוגנת מפני אור.
    הערה: נקודה עגולה קטנה אמורה להופיע בשקופית לאחר ייבוש באוויר. בשל אפקט "טבעת הקפה", קצוות הנקודה יהיו בעלי צפיפות גבוהה יותר של תאי חיידקים. שלב צנטריפוגה זה הוא להגיע לצפיפות מתאימה להדמיה יעילה של חיידקים חד-תאיים. הריכוז האידיאלי אמור להוביל לשכבה אחידה וצפופה של תאי חיידקים בודדים מתחת למיקרוסקופ. אם יש גלולה שקופה שניתן לראות בעין בלתי לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט כך שלאחר המערבולת, התמיסה נראית כמעט ברורה. ניתן לבצע בדיקה מהירה על דגימת הבקרה כדי להעריך את נפח הסרת הסופרנאטנטים. מערך של טיפות עם כמויות שונות של סופרנאטנט שנותר יכול להיות מונח על מגלשת זכוכית המיקרוסקופ כדי לבחון את נפח הדילול האופטימלי מתחת למיקרוסקופ שדה בהיר. אם אין גלולה נראית לעין לאחר הצנטריפוגה, הסר את רוב הסופרנאטנט כדי לרכז את הדגימות במידה הרבה ביותר. הטריק הוא למקם את צינור הצנטריפוגה עם הציר מבחוץ ברוטור בעל זווית קבועה, כך שהגלולה תופיע באותו צד של ציר הצינור. בנוסף, דרגו את גודל הפיפט (P1000, P200, P10) לדיוק מוגבר במהלך הסרת סופרנאטנט כדי לשמור על שלמות הכדורית.
  7. הרכיבו את השקופית במחזיק מדגם שסופק והשתמשו בנקודות קטנות של סרט פוליאסטר כדי לאבטח את השקופית במהלך המדידה.

4. הדמיית OPTIR-FISH

הערה: הדמיה פלואורסצנטית והדמיית OPTIR יבוצעו במערכת OPTIR.

  1. גיאומטריית המערכת:
    1. השתמש בהתפשטות נגדית של משאבת אינפרא-אדום אמצעית ובדיקה גלויה, זיהוי לאחור (epi) של אור נראה באמצעות פרוטוקול זה.
    2. כדי למקד את האור הנראה ולאסוף אור נראה המוחזר ומפוזר, השתמש במטרת אוויר (50x 0.8NA). כדי למקד את האור האמצעי-אינפרא-אדום, השתמש במטרה Cassegrain (40x 0.78NA).
    3. ודא שהמערכת מצוידת גם במודול אפי-פלואורסצנטי רחב שדה עם ערכות מסנן פלואורסצנטיות מרובות. עבור הפלואורופורים המשמשים בפרוטוקול זה, בחר את מסנן החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) המוגדר לזיהוי Cy3 ואת מסנן Alexa Fluor 647 המוגדר לזיהוי Cy5.
  2. התכוננו למדידות:
    1. הפעל את המערכת ופתח את תוכנת בקרת המכשירים. לאחר האתחול, העבר את המחוון Counterprop ו - Fluorescence למצב מופעל.
    2. הגדר את היעד להיות 50x ולאחר מכן בצע רקע אוטומטי כדי להשיג את ספקטרום הספק IR. השתמש בספקטרום העוצמה כדי לנרמל את ספקטרום הדגימות הנרכשות או לנרמל תמונות OPTIR במספרי גל שונים. זה לא יכלול את ההשפעה של הבדלי עוצמת לייזר באמצע IR על ניתוח נתונים וכימות נתונים.
      הערה: רכישת ספקטרום הספק IR לנורמליזציה היא הכרחית לניתוח כמותי במורד הזרם מכיוון שהעוצמה הנמדדת קשורה באופן ליניארי להספק IR. לאחר ביצוע רקע אוטומטי, התוכנה תנרמל את ספקטרום OPTIR ואת תמונות OPTIR לספקטרום כוח IR באופן אוטומטי עבור משתמשים. טיהור המערכת עם N2 יכול למזער את ההשפעה של אדי מים ולהגדיל את יכולת הרבייה בין ניסויים.
  3. לטעינת הדגימה, השתמשו בלחצן 'בטל טעינה ' כדי להזיז את שלב הדגימה החוצה. השתמש במטרה להגדלה נמוכה, כגון 10x, כדי לאתר את אזור הדגימה ולנווט לאזור בעל צפיפות הדגימה המיטבית. מקד את הדגימה על-ידי התאמת הגובה האובייקטיבי בתוכנת הבקרה. שנה את בחירת המטרה ל- 50x.
  4. רכישת תמונות
    הערה: הדגימות המשמשות הן: i ) E. coli (13C-גלוקוז מודגר); ii) E. coli (12C-גלוקוז מודגר); 3) B. theta (12C-גלוקוז מודגר); iv) תערובת של E. coli (13C-glucose inducated) ו-B. theta (12C-glucose inducated).
    1. תמונות שדה בהיר (איור 2D): מקדו את הדגימה על-ידי התבוננות בתמונות השדה הבהיר.
    2. תמונות פלואורסצנטיות (איור 2E): שנו את ערכת המסננים על-ידי לחיצה על לחצן שם המסנן (GFP עבור Cy3 ו-Alexa Fluor 647 עבור Cy5) כדי לזהות פלואורופורים הקשורים לגשושיות FISH המתוכננות ולרכוש הדמיה פלואורסצנטית ברצף באמצעות מודול הפלואורסצנטיות בתוכנה. כוונן את עוצמת האור ואת זמן החשיפה כדי לקבל ניגודיות אות מספקת לפני הלבנת הפלואורופורים.
      הערה: מאחר שהגשושית המשמשת במדידות OPTIR עשויה לבצע פוטואקונומיקה פלואורופורים, רכשו תמיד תמונות פלואורסצנטיות לפני תמונות OPTIR. לדאגה לגבי ההשפעה של סמנים פלואורסצנטיים על זיהוי OPTIR, עיין בעבודה שפורסמה בעבר שהראתה כי FISH עם פלואורופור Cy5 אינו משפיע על הכימות הבא המבוסס על תמונות OPTIR מכיוון ש- Cy5 קטן בגודלו ונמוך בשפע בהשוואה לחלבון חיידקיהמטרה 9.
    3. תמונות OPTIR (איור 2F):
      1. קבע את מיקום השיא הנורמלי ואת מיקום השיא המוסט לאדום המושרה על ידי איזוטופים. במקרה של סינתזת חלבונים מגלוקוז C 13, שיא האמיד I הנורמלי מזוהה בסביבות 1656 ס"מ-1, והשיא המוסט לאדום הוא בסביבות 1612 ס"מ-1 (איור 3A).
        הערה: מיקום השיא הנורמלי תלוי במרכיב הביוכימי ו / או בתוצר המטבולי המעניין. מיקום השיא המשתנה תלוי גם באיזוטופ המשמש לתיוג. שני מספרי גל אלה יכולים גם להיקבע באופן ניסיוני על ידי מדידת הספקטרום המלא של תאים ללא תווית וסימון מקסימלי (ראה שלב 4.5)
      2. כוונן את אורך הגל של משאבת IR ל- 1656 cm-1 באמצעות התוכנה. שנה את כוח הבדיקה ואת רווח הגלאי בהתאם כדי למנוע רוויה של אות DC (8 V). כוונן את גובה המטרה Cassegrain התחתון כדי למקסם את אות AC.
        הערה: עוצמת IR טיפוסית בדגימה היא בסביבות 5 mW, ועוצמת הבדיקה בדגימה היא בסביבות 3-15 mW, בהתאם לדגימה. ניתן לכוונן הן את עוצמת האינפרא-אדום והן את עוצמת הבדיקה באמצעות תוכנת הבקרה כדי למטב את רמת ההספק כדי להבטיח ניגודיות תמונה גבוהה תוך הימנעות מפגיעה בתאים.
      3. הגדר תמונות OPTIR כך שיכילו 200 x 200 פיקסלים והגדר את קצב הסריקה ל- 100 מיקרומטר לשנייה. הגדר את גודל הצעד בכיווני X ו- Y ל- 150 ננומטר כך שגודל התמונה יהיה כ- 30 x 30 מיקרומטר2.
      4. רכוש את התמונה.
      5. כוונן את אורך הגל של משאבת IR ל- 1612 cm-1 וקבל תמונה מאותו שדה ראייה במספר גל זה.
      6. עבור כל מדגם, צלם לפחות שלושה שדות ראייה לניתוח סטטיסטי.
  5. (אופציונלי) מדידה ספקטרלית: לאחר רכישת תמונה, אם ממוקמת תכונה מרחבית מעניינת, בצע את המדידה הספקטרלית.
    1. בחר מיקומים: בחר נקודה בודדת או ציין מערך נקודות לניתוח במודול הספקטרלי של התוכנה.
    2. הגדר פרמטר סריקה ספקטרלית. בחר את טווח כיסוי מספרי הגל, מהירות הסריקה והמרווח בין פלט הנתונים בהתאם לדרישות.
      הערה: אם מהירות הסריקה והמרווח בין פלט הנתונים שונים בהשוואה לאלה המשמשים בשלב רכישת הרקע (שלב 4.2), יש צורך ברקע חדש המבוסס על פרמטרי הסריקה הספקטרליים הנוכחיים לצורך נורמליזציה נכונה.
    3. הגדר את המספר הממוצע המשותף והתחל מדידה ספקטרלית. הגדלת הממוצע המשותף גם מגדילה את האות לרעש של ספקטרום, אך דורשת זמני רכישה ארוכים יותר.
      הערה: אם נצפתה תנודה משמעותית במהלך הממוצע המשותף, הדבר עשוי להצביע על חוסר יציבות דגימה הנגרמת על ידי חימום לייזר. לעתים קרובות ניתן לטפל בכך על ידי הורדת עוצמת ה- IR ו / או הורדת עוצמת הבדיקה הנראית לעין.

5. עיבוד וניתוח נתונים ברמת התא הבודד

  1. כימות סינתזה מטבולית ממצעים איזוטופיים (איור 2G)
    הערה: הכימות הבא של שילוב מטבולי ממצעים איזוטופיים מבוסס על תמונות OPTIR בעלות שני מספרי גל המתאימים לפסגות הנורמליות והמוזזות של מקרומולקולות המטרה. בהשוואה למחסנית היפרספקטרלית מלאה, הדמיה של שני מספרי גל יכולה להפחית באופן משמעותי את הזמן הדרוש לכל FOV ולשפר את התפוקה תוך לכידה מחדש מלאה של האפקט האיזוטופי הקריטי לכימות חילוף החומרים.
    1. חיסור תמונת OPTIR של שיא ההזזה מהשיא הרגיל תמונת OPTIR יוצרת מפה חזותית של פעילויות סינתזה ממצעי איזוטופים. כהדגמה (איור 3C), עבור E. coli בתרבית עם 13C-glucose, הפיקסלים החיוביים בתמונה (1656 cm-1-1612 cm-1) מצביעים על שילוב פעיל של 13C בחלבונים, ולכן רמת סינתזת חלבונים גבוהה יותר.
      הערה: ניתן לבצע את החיסור באמצעות הפונקציה ImageJ Image Calculator. לחלופין, החיסור יכול להתבצע בקלות בכל שפת תכנות מועדפת לעיבוד אצווה.
    2. כימות הפעילות המטבולית של תא בודד
      1. קבל מקדמים (המיוצגים על-ידי h באיור 2G) מדגימות ייחוס ללא תווית ותווית מלאה. מכיוון שהשיא המושרה על ידי איזוטופים בהסחה לאדום יחפוף חלקית עם הפסגה הנורמלית, הן דגימות ללא תווית והן עם תווית (מסונתזות לאחרונה מהמצע המסומן איזוטופית) יתרמו לאותות OPTIR בשיא הנורמלי והמוסט . כמת תרומות שונות אלה באמצעות עוצמת אות OPTIR המנורמלת בשיא הנורמלי והמוסט מדגימות ייחוס לא מסומנות ומסומנות במלואן.
        הערה: עבור דגימות ייחוס, דגימות ייחוס ללא תווית גדלות (או מודגרות) ללא כל מצע מסומן איזוטופית. דגימות ייחוס עם תווית מלאה גדלות בדרך כלל עם הריכוז הגבוה ביותר של מצע מסומן איזוטופית עם זמן הגידול הארוך ביותר.
      2. לניתוח תא בודד, השג מסיכות של תא בודד בהתבסס על תמונות השדה הבהיר.
        הערה: ניתן ליישם כאן טכניקות שונות בעיבוד תמונה כדי ליצור מסיכה זו, כולל זיהוי חלקיקים שונים כמו ניתוח כתמים ושיטות פילוח תאים כמו קו פרשת מים.
      3. מדוד את עוצמת אות OPTIR מתאים בודדים. החילו את מסיכת התא היחיד שנרכשה על שתי תמונות OPTIR (בשיא רגיל ובשיא שהוזז), ולכל תא בודד, בצעו ממוצע של ערכי הפיקסלים באזור המסיכה של התא הבודד. הערך הממוצע מתאים בודדים ישמש בכימות.
      4. עבור כל תא, חשב את התרומה היחסית של רכיבים ביולוגיים לא מסומנים ומסומנים בהתבסס על המקדמים משלב 5.1.2.1 והאותות משלב 5.1.2.3.
        הערה: יחס החלפה איזוטופית מוגדר כתרומה היחסית של רכיבי ביו מסומנים על פני סכום הרכיבים הביולוגיים המסומנים והלא מסומנים (איור 2G). יחס זה צריך ליפול בטווח של 0 עד 1. יחס ההחלפה האיזוטופית הוא ביחס ליניארי ליחס של 13C-גלוקוז ל-12C-גלוקוז (עם כמות גלוקוז כוללת קבועה)9. הודגמה רגישות גבוהה לגילוי של 5% 13C-גלוקוז עבור תאי E. coli .
  2. זיהוי מיני חיידקים מתמונות פלואורסצנטיות רב-ערוציות (איור 2H)
    1. מזג את ערוצי הפלואורסצנטיות מרובי הצבעים כדי ליצור הדרכה חזותית עבור מיני חיידקים שונים באמצעות ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
    2. עבור ניתוח תא בודד, עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, צור קבוצה של אזורי עניין (ROIs) עבור תאים בודדים.
      הערה: ניתן ליישם כאן טכניקות שונות בעיבוד תמונה כדי ליצור את המסיכה, כולל שיטות סף אוטומטי שונות ושיטות פילוח תאים.
  3. מתאם בין זהויות דגים ופעילויות מטבוליות של OPTIR (איור 2I)
    1. קשר את הזהויות החיידקיות ברמת התא הבודד מתמונות פלואורסצנטיות של FISH ישירות לפעילויות המטבוליות מתמונות OPTIR על ידי מתאם בין מיקומי החזר ההשקעה.
    2. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות את הפעילות המטבולית של מינים שונים.
      הערה: מסיכות נוצרות בנפרד מתמונות פלואורסצנטיות ומתמונות OPTIR מכיוון שניתן לנתח פעילויות מטבוליות עבור כל התאים מתמונות OPTIR, בעוד שתאים לא ידועים לא יופיעו באף אחד מערוצי הפלואורסצנציה. זה מבטיח כי כל התאים יכולים להיכלל בניתוח מטבולי. אם יש מספר גדול של תאים לא מזוהים, ייתכן שיהיה צורך לשקול בדיקות FISH שונות המכוונות ל-rRNA של טקסים שונים בעלי עניין.

תוצאות

זרימת העבודה הכללית לניתוח מטבולי מיקרוביאלי חד-תאי עם זיהוי גנטי על ידי OPTIR-FISH מסוכמת ב תרשים 2. התוצאות המייצגות המדגימות את יכולת ההדמיה המטבולית של תא בודד של OPTIR מוצגות ב תרשים 3. דוגמה זו השתמשה בתאי E. coli מודגרים עם 12C- או 13C- ...

Discussion

במאמר זה תיארנו פרוטוקול מפורט ליישום פלטפורמת OPTIR-FISH לזיהוי סימולטני של מיני חיידקים וכימות של פעילויות מטבוליות ברזולוציה של תא בודד. השלבים הקריטיים כוללים תרבית עם תיוג איזוטופים יציב לחקר פעילויות מטבוליות ספציפיות והכלאה פלואורסצנטית באתרה לזיהוי מיני מיקר...

Disclosures

י.ב. הוא יועץ במשרה חלקית בחברת ספקטרוסקופיה פוטותרמית.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות R35GM136223, R01AI141439 J.X.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96% EthanolThermoScientificT032021000
Calcium FluorideCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE9884-100G
formamideThermoScientific17899
Luria-Bertani broth Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Minimal Salts 5xSIGMAM6030-1KG
OPTIR instrumentPhotothermal Spectroscopy Corp.mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBSThermoScientificJ19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v) Sigma-AldrichP8920-500ML
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-25G
Sodium dodecyl sulfateSigma-AldrichL3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%ThermoScientificA11379.18
Trypic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G

References

  1. Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
  2. Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
  3. Epstein, S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  4. Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -. Q., Yang, J. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).
  5. Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).
  6. Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis. Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).
  7. Porta Siegel, T., et al. Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues. Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).
  8. Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species. Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).
  9. Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -. X. Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells. Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).
  10. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -. H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions. System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).
  11. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -. H. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).
  12. Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. Molecular Microbial Ecology. , (2004).
  13. Bridger, J. M., Volpi, E. V. . Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).
  14. Wang, D. O., et al. A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes. RNA. 18 (1), 166-175 (2012).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).
  16. Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).
  17. Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy. Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).
  18. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering. Nat Commun. 12 (1), 7097 (2021).
  19. Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -. X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci Adv. 7 (20), (2021).
  20. Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -. X. Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications. J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).
  21. Du, J., Wang, H., Wei, L. Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes. ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).
  22. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Phys Biol. 16 (4), 041003 (2019).
  23. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  24. Bai, Y., et al. Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems. Nat Commun. 15 (1), 350 (2024).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Ge, X., et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119 (2022).
  27. Bai, Y., et al. Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption. Sci Adv. 5 (7), 7127 (2019).
  28. Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -. X. High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering. J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).
  29. Lin, H., et al. Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat Commun. 12 (1), 3052 (2021).
  30. Fu, P., et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat Photon. 17, 330-337 (2023).
  31. Tamamitsu, M., et al. Mid-infrared widefield nanoscopy. arXiv. , (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204OPTIR FISHFISH RRNAOPTIR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved