Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

Özet

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Özet

Karmaşık topluluklar içindeki tek tek hücrelerin metabolik aktivitelerini anlamak, insan hastalıklarındaki rollerini ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Burada, rRNA etiketli FISH problarını ve izotop etiketli substratları birleştirerek OPTIR-FISH platformu ile eşzamanlı hücre tanımlama ve metabolik analiz için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Floresan görüntüleme, rRNA etiketli FISH problarının spesifik bağlanması ile hücre tanımlaması sağlarken, OPTIR görüntüleme, OPTIR spektrumlarında izotop kaynaklı kırmızıya kayma ile tek hücreler içinde metabolik aktiviteler sağlar. Test yatağı olarak ¹³C-glikoz ile kültürlenmiş bakterileri kullanan protokol, izotopik etiketleme, floresan in situ hibridizasyon (FISH), numune hazırlama, OPTIR-FISH görüntüleme kurulumunun optimizasyonu ve veri toplama ile mikrobiyal kültürü ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, görüntü analizinin nasıl gerçekleştirileceğini ve spektral verilerin yüksek verimle tek hücre düzeyinde nasıl yorumlanacağını da gösteriyoruz. Bu protokolün standartlaştırılmış ve ayrıntılı doğası, geniş tek hücreli metabolizma araştırma topluluğu içindeki farklı geçmişlere ve disiplinlere sahip araştırmacılar tarafından benimsenmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Giriş

Hücresel metabolizma, hücre biyolojisinde temel bir dayanak olarak durur ve hücre sağlığını, işlevini ve çevre ile etkileşimi belirleyen birçok süreci yönlendirir. Metabolizmayı bireysel hücre düzeyinde, özellikle doğal ortamlarda analiz etmek, biyolojik sistemlerdeki heterojen ve karmaşık aktiviteleri ortaya çıkarmak için paha biçilmez bilgiler sağlar¹. Bu, özellikle mikroorganizmaların incelenmesinde çok önemlidir, çünkü birçok mikrop, geleneksel yetiştirme yöntemlerine meydan okuyan benzersiz büyüme gereksinimleri veya çevresel bağımlılıklar sergiler². Örneğin, bazı türler, laboratuva....

Protokol

Bu çalışmada bakteri örneklerinin kullanımı, Boston Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün yönergelerine uygundur.

NOT: Bu protokolde izlenen genel iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir.

1. Bakteri kültürü ve izotop etiketleme (Şekil 2A)

NOT: Burada verilen örnek, saf bir bakteri kültürünü etiketlemek içindir. Bu protokol polimikrobiyal topluluklara uygulanıyorsa, ortam ve etiketleme süresi, topluluğa ve ilgilenilen organizmaların....

Tartışmalar

Burada, mikrobiyal türlerin eşzamanlı olarak tanımlanması ve metabolik aktivitelerin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesi için OPTIR-FISH platformunu uygulamak için ayrıntılı bir protokol tanımladık. Kritik adımlar, spesifik metabolik aktiviteleri incelemek için kararlı izotop etiketlemeli kültürü ve hedef mikrobiyal türleri tanımlamak için yerinde floresan hibridizasyonunu içerir. Çok kanallı floresan görüntüleme ve seçilen dalga sayıları.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G