Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH), auch bekannt als Mid-Infrared Photothermal-FISH (MIP-FISH), verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren und ihren Stoffwechsel zu verstehen. Diese Methodik kann für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Kartierung des Zellstoffwechsels mit Einzelzellauflösung.

Zusammenfassung

Das Verständnis der metabolischen Aktivitäten einzelner Zellen innerhalb komplexer Gemeinschaften ist entscheidend, um ihre Rolle bei menschlichen Krankheiten zu entschlüsseln. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur gleichzeitigen Zellidentifikation und Stoffwechselanalyse mit der OPTIR-FISH-Plattform durch die Kombination von rRNA-markierten FISH-Sonden und isotopenmarkierten Substraten. Die Fluoreszenzbildgebung ermöglicht die Zellidentifizierung durch die spezifische Bindung von rRNA-markierten FISH-Sonden, während die OPTIR-Bildgebung metabolische Aktivitäten innerhalb einzelner Zellen durch isotopeninduzierte Rotverschiebung in OPTIR-Spektren liefert. Unter Verwendung von Bakterien, die mit ¹³C-Glukose kultiviert wurden, als Prüfstand beschreibt das Protokoll die mikrobielle Kultur mit Isotopenmarkierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Probenvorbereitung, Optimierung des OPTIR-FISH-Bildgebungsaufbaus und Datenerfassung. Wir zeigen auch, wie man Bildanalysen durchführt und spektrale Daten auf Einzelzellebene mit hohem Durchsatz interpretiert. Die standardisierte und detaillierte Natur dieses Protokolls wird seine Übernahme durch Forscher mit unterschiedlichem Hintergrund und unterschiedlichen Disziplinen innerhalb der breiten Forschungsgemeinschaft des Einzelzellstoffwechsels erheblich erleichtern.

Einleitung

Der Zellstoffwechsel ist eine tragende Säule der Zellbiologie und steuert viele Prozesse, die die Gesundheit, Funktion und Interaktion der Zellen mit der Umwelt bestimmen. Die Analyse des Stoffwechsels auf der Ebene einzelner Zellen, insbesondere in der nativen Umgebung, liefert unschätzbare Erkenntnisse, um die heterogenen und komplexen Aktivitäten in biologischen Systemen aufzudecken¹. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Mikroorganismen, da viele Mikroben einzigartige Wachstumsanforderungen oder Umweltabhängigkeiten aufweisen, die traditionelle Anbaumethoden in Frage stellen^2<....

Protokoll

Die Verwendung von Bakterienproben in dieser Studie erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) der Boston University und des National Institute of Health.

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf, der in diesem Protokoll befolgt wird, ist in Abbildung 2 zusammengefasst.

1. Bakterienkultur und Isotopenmarkierung (Abbildung 2A)

HINWEIS: Das hier angegebene Beispiel dient zur Kennzeichnung einer reinen Bakterienkultur. Bei der ....

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung der OPTIR-FISH-Plattform zur gleichzeitigen Identifizierung mikrobieller Spezies und zur Quantifizierung der metabolischen Aktivitäten mit Einzelzellauflösung beschrieben. Zu den kritischen Schritten gehören Kulturen mit stabiler Isotopenmarkierung zur Untersuchung spezifischer Stoffwechselaktivitäten und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Identifizierung von mikrobiellen Zielspezies. Mehrkanal-Flu.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G