Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH), auch bekannt als Mid-Infrared Photothermal-FISH (MIP-FISH), verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren und ihren Stoffwechsel zu verstehen. Diese Methodik kann für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Kartierung des Zellstoffwechsels mit Einzelzellauflösung.

Zusammenfassung

Das Verständnis der metabolischen Aktivitäten einzelner Zellen innerhalb komplexer Gemeinschaften ist entscheidend, um ihre Rolle bei menschlichen Krankheiten zu entschlüsseln. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur gleichzeitigen Zellidentifikation und Stoffwechselanalyse mit der OPTIR-FISH-Plattform durch die Kombination von rRNA-markierten FISH-Sonden und isotopenmarkierten Substraten. Die Fluoreszenzbildgebung ermöglicht die Zellidentifizierung durch die spezifische Bindung von rRNA-markierten FISH-Sonden, während die OPTIR-Bildgebung metabolische Aktivitäten innerhalb einzelner Zellen durch isotopeninduzierte Rotverschiebung in OPTIR-Spektren liefert. Unter Verwendung von Bakterien, die mit ¹³C-Glukose kultiviert wurden, als Prüfstand beschreibt das Protokoll die mikrobielle Kultur mit Isotopenmarkierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Probenvorbereitung, Optimierung des OPTIR-FISH-Bildgebungsaufbaus und Datenerfassung. Wir zeigen auch, wie man Bildanalysen durchführt und spektrale Daten auf Einzelzellebene mit hohem Durchsatz interpretiert. Die standardisierte und detaillierte Natur dieses Protokolls wird seine Übernahme durch Forscher mit unterschiedlichem Hintergrund und unterschiedlichen Disziplinen innerhalb der breiten Forschungsgemeinschaft des Einzelzellstoffwechsels erheblich erleichtern.

Einleitung

Der Zellstoffwechsel ist eine tragende Säule der Zellbiologie und steuert viele Prozesse, die die Gesundheit, Funktion und Interaktion der Zellen mit der Umwelt bestimmen. Die Analyse des Stoffwechsels auf der Ebene einzelner Zellen, insbesondere in der nativen Umgebung, liefert unschätzbare Erkenntnisse, um die heterogenen und komplexen Aktivitäten in biologischen Systemen aufzudecken¹. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Mikroorganismen, da viele Mikroben einzigartige Wachstumsanforderungen oder Umweltabhängigkeiten aufweisen, die traditionelle Anbaumethoden in Frage stellen². So können einige Arten bestimmte Nährstoffzusammensetzungen oder symbiotische Beziehungen benötigen, die in einer Laborumgebung nicht leicht repliziert werden können, so dass sie mit Standardtechniken nicht kultivierbar sind³. Darüber hinaus stellen die langen Zeiträume, die für die Kultivierung bestimmter Arten erforderlich sind, erhebliche Herausforderungen für die mikrobiologische Forschung dar, die oft über den praktischen Zeitrahmen für Studien und Analysen hinausgehen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, ermöglichen alternative Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) die Identifizierung mikrobieller Spezies, ohne dass eine Kultivierung erforderlich ist⁴, wodurch ein genauerer und ganzheitlicherer Blick auf mikrobielle Ökosysteme ermöglicht wird. Diesen analytischen Technologien fehlt jedoch die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel aufzuklären. Diese Lücke verdeutlicht die anhaltenden Herausforderungen im Bereich der Mikrobiologie: die gleichzeitige Aufgabe, die zelluläre Identität zu differenzieren und den Stoffwechsel auf Einzelzellebene aufzuklären. Fortschritte bei Techniken wie der bildgebenden Massenspektrometrie (IMS) in Verbindung mit stabilen Isotopen haben sich als leistungsfähige Werkzeuge für die Einzelzell-Stoffwechselanalyse erwiesen⁵. In diesen Experimenten wurden Zellen mit Substraten inkubiert, die Isotope wie ¹³C oder ¹⁵N enthielten. Die neu anabolisierten Biomoleküle tragen diese Isotope, so dass sie auf den m/z-Spektren unterscheidbar sind. IMS leidet jedoch unter teuren Instrumenten, komplizierter Probenvorbereitung, relativ geringem Durchsatz und Fachwissen, das für die Analyse der m/z-Spektren erforderlich ist. In Kombination mit molekularer markerspezifischer Fluoreszenzbildgebung wurden Fortschritte bei der Aufklärung des zellulären Stoffwechsels mit erhöhter Spezifität^{erzielt 6}. Dennoch gibt es nach wie vor Herausforderungen bei der Überbrückung dieser beiden Modalitäten. Der Unterschied in der Auflösung zwischen IMS und Fluoreszenzbildgebung in Kombination mit unterschiedlichen operationellen Aufbauten macht es schwierig, die Ergebnisse abzugleichen und zu korrelieren⁷.

Die Integration von schwingungsspektroskopischer Bildgebung mit der Markierung stabiler Isotope bietet eine neuartige Lösung für die Untersuchung des Einzelzellstoffwechsels. Der Einbau schwererer Isotope verlangsamt die Schwingung chemischer Bindungen, was zu rotverschobenen Peaks in den Schwingungsspektren^{führt 8}. Insbesondere bietet die Vibrationsbildgebung eine räumliche Auflösung, die mit der Fluoreszenzbildgebung vergleichbar ist, und sowohl die metabolische Quantifizierung als auch die Zellidentifizierung können in einem einzigen Setup durchgeführt werden, was die Bildregistrierung und Korrelation vereinfacht. Unsere jüngsten Arbeiten haben die Kombination einer fortschrittlichen Schwingungsbildgebungsplattform demonstriert: optisches photothermisches Infrarot (OPTIR) mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), um den Glukosestoffwechsel in Bakteriengemeinschaften zu untersuchen⁹ (Abbildung 1). OPTIR ist ein schwingungsspektroskopisches Mikroskopiesystem, das sich den photothermischen Effekt der Absorption im mittleren IR zunutze macht, indem es die Änderung des sichtbaren Lichts detektiert, was eine Auflösung im Submikrometerbereich wie in der optischen Mikroskopie bietet, jedoch mit den zusätzlichen schwingungsspektroskopischen Informationen, die aus der Absorption im mittleren IR stammen. FISH ist eine häufig verwendete Technik zur Bestimmung der Identität von Mikroorganismen auf Einzelzellebene. Die Sequenz der Oligonukleotide könnte so gestaltet werden, dass sie auf spezifische 16S-Sequenzen verschiedener Taxa abzielt, und verschiedene Fluorophore könnten an sie gebunden werden. Die spezifische Hybridisierung der designten Oligonukleotidsonden mit der Ziel-rRNA führt zu starken Fluoreszenzsignalen der Zielspezies innerhalb einzelner Zellen, und es könnte eine Mehrkanal-Fluoreszenzbildgebung durchgeführt werden, um mehrere Spezies innerhalb der Population zu identifizieren. Da sowohl OPTIR als auch Fluoreszenzbildgebung auf optischer Detektion basieren, ist die Kombination von OPTIR- und FISH-Fluoreszenz einfach zu implementieren. Die beiden Modalitäten haben die gleiche optische Auflösung für die Einzelzellanalyse und können bequem umgeschaltet werden, ohne dass eine zusätzliche Ausrichtung oder Co-Registrierung erforderlich ist.

Dieses Protokoll enthält einen detaillierten Leitfaden zur Nutzung der OPTIR-FISH-Plattform für die erweiterte Struktur-Funktions-Analyse einzelner Zellen. Wir nutzten die in ¹³C-Glukose-haltigen Medien gezüchteten Bakterienproben als Testbed und quantifizierten die de novo Proteinsynthese aus ¹³C-Glukose. Um die Fähigkeit der Plattform zur Identifizierung von Zellen zu demonstrieren, verwendeten wir Bakterienmischungen, in denen jede Spezies mit rRNA-gezielten FISH-Sonden markiert wurde. Dieser Ansatz ermöglichte die präzise Einzelzellidentifizierung spezifischer Bakterienstämme wie Escherichia coli (E. coli) und Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta) und deren Metabolismus. Dieses Protokoll bietet Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug für die gleichzeitige Erstellung von Stoffwechselprofilen und die Identifizierung von Spezies auf Einzelzellebene und verspricht, unser Verständnis von zellulären Interaktionen, Physiologie und ihrer Rolle in komplexen Umgebungen zu verbessern.

Protokoll

Die Verwendung von Bakterienproben in dieser Studie erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) der Boston University und des National Institute of Health.

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf, der in diesem Protokoll befolgt wird, ist in Abbildung 2 zusammengefasst.

1. Bakterienkultur und Isotopenmarkierung (Abbildung 2A)

HINWEIS: Das hier angegebene Beispiel dient zur Kennzeichnung einer reinen Bakterienkultur. Bei der Anwendung dieses Protokolls auf polymikrobielle Gemeinschaften müssen das Medium und die Markierungszeit entsprechend der Gemeinschaft und der Physiologie der interessierenden Organismen angepasst werden.

1. Impfen Sie den interessierenden Bakterienstamm aus einer einzigen Kolonie und kultivieren Sie ihn 3 h lang in einem nährstoffreichen Medium wie tryptische Sojabrühe (TSB) oder Luria-Bertani-Brühe (LB), um die exponentielle Wachstumsphase (log) zu erreichen. E. coli BW25113 wird in diesem Protokoll als Beispielstamm verwendet.
   HINWEIS: Die Zeit bis zum Erreichen der Log-Phase variiert je nach verwendeter Dehnung. Diese Zeit muss für jeden Stamm angepasst werden.
2. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm, um die Bakterienkonzentration abzuschätzen.
3. Bereiten Sie ein minimales Wachstumsmedium vor, das mit isotopenmarkierten Substraten ergänzt wird. Bei E. coli BW25113 ist das M9-Minimalmedium mit ¹³C-Glukose in einer Endkonzentration von 0,2 % (w/v) zu ergänzen.
   HINWEIS: Die verwendete ^13-C-Glucose(D-Glucose ^U-13C₆, 99%) wurde universell markiert, wobei alle Kohlenstoffatome durch ¹³C-Atome ersetzt wurden. Die Wahl des minimalen Wachstumsmediums hängt vom Bakterienstamm ab. Die Wahl des Isotopensubstrats hängt vom jeweiligen Stoffwechselprozess ab. Das übergeordnete Ziel besteht darin, dass das Isotopensubstrat im Vergleich zu ihren unmarkierten Gegenstücken als Hauptnahrungsquelle dient.
4. Die Bakterien werden in dem minimalen Wachstumsmedium, das das isotopenmarkierte Substrat enthält, auf eine Endkonzentration von 5 × 10⁵ KBE/ml verdünnt.
   HINWEIS: In der Regel wird ein hohes Verdünnungsverhältnis wie 1:100 verwendet, und der unmarkierte Nährwert aus dem reichhaltigen Medium wird vernachlässigbar. Um eine vollständige Entfernung des nährstoffreichen Mediums zu gewährleisten, könnte alternativ eine Waschung mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C und Resuspension in PBS durchgeführt werden, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation und abschließender Resuspension in dem minimalen Wachstumsmedium.
5. Züchten Sie Bakterienproben in einem orbitalen Schüttelinkubator unter optimalen Wachstumsbedingungen. Stellen Sie den orbitalen Schüttelinkubator im Allgemeinen auf eine Drehzahl von 220 U/min und eine Temperatur von 37 °C ein und platzieren Sie die Kulturröhrchen mit einer losen Kappe für die aerobe Inkubation. Bei E. coli reichen in der Regel 24 h aerobe Inkubation bei 37 °C aus, um eine maximale Markierung von ¹³°C zu erreichen.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt vom interessierenden Stoffwechselprozess ab. Eine längere Inkubationszeit führt in der Regel zu einer höheren Isotopenmarkierung. Eine Messung der Wachstumskurve unter den gleichen Bedingungen mit einem unmarkierten Substrat könnte Aufschluss über die Bestimmung der geeigneten Entnahmezeitpunkte geben.
6. Sammeln Sie Bakterienzellen zu den gewünschten Zeitpunkten durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C.
7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in einem gleichen Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Fixieren Sie die Zellen 10 min bei Raumtemperatur (RT) oder 2 h bei 4 °C in PFA-Lösung. Für die Langzeitlagerung waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 50 % (v/v) PBS und 96 % Ethanol und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.

2. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Abbildung 2B)

1. Hybridisieren Sie E. coli-Zellen mit der Gam42a 10-Oligonukleotidsonde, die mit einem Cyanin5 (Cy5)-Fluorophor (Gam42a-Cy5) markiert ist, und B. theta-Zellen mit der Bac303^{11-Oligonukleotidsonde}, die mit einem Cyanin3 (Cy3)-Fluorophor (Bac303-Cy3) markiert ist, gemäß einem Standard-FISH-Protokoll.
   HINWEIS: Grundlagen von rRNA-FISH zur Identifizierung: rRNA-Moleküle sind ideale Ziele von FISH, da sie ubiquitär verteilt und natürlich in mikrobiellen Zellen amplifiziert sind. rRNA enthält sowohl konservierte als auch variable Sequenzregionen, so dass die phylogenetische Tiefe der Zielgruppe durch den Konservierungsgrad der Oligonukleotidsonde bestimmt werden konnte. Durch die spezifische Bindung der designten Sonde an die Zielsequenz zeigt das markierte Fluorophor Fluoreszenzsignale für einzelne Zellen.
2. In der zuvor veröffentlichten Literatur ^12,13,14 finden Sie ein detailliertes Protokoll für die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. In den folgenden Schritten wird das Standardprotokoll für mikrobielle Zellen kurz beschrieben.
   1. Austrocknung:
      1. Zentrifugieren Sie die fixierten Zellen (100 μl) bei 14.000 x g für 10 Minuten zu einem Pellet, resuspendieren Sie sie in 100 μl 96 % Ethanol in analytischer Qualität und inkubieren Sie 1 Minute lang bei RT.
      2. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 14.000 x g für 5 min, entfernen das Ethanol und lassen das Zellpellet an der Luft trocknen.
   2. Hybridisierung: Hybridisieren Sie die Zellen in Lösung (100 μL) für 3 h bei 46 °C.
      HINWEIS: Der Hybridisierungspuffer besteht aus 900 mM NaCl, 20 mM Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan HCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,01 % Natriumdodecylsulfat, 100 ng des jeweiligen fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids und der erforderlichen Formamidkonzentration, um strenge Bedingungen zu erreichen.
   3. Zentrifuge: Unmittelbar nach der Hybridisierung werden die Proben in eine Zentrifuge mit einem auf 46 °C vorgeheizten Rotor überführt und bei 14.000 x g für 15 min bei der maximal zulässigen Temperatur (in der Regel 40 °C) zentrifugiert.
   4. Waschen und lagern:
      1. Die Proben werden 15 Minuten lang bei 48 °C in einem Puffer geeigneter Strenge gewaschen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 14.000 x g für 15 min bei der maximal zulässigen Temperatur in einer Zentrifuge mit einem auf 46 °C vorgeheizten Rotor.
      2. Zum Schluss werden die Zellen mit 500 μl eiskaltem PBS gewaschen, in 20 μl 1x PBS resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.
         HINWEIS: Die spezifische Bindung der Sonde wird durch die korrekte Hybridisierungsstringenz gewährleistet. Eine hohe Stringenz könnte durch Erhöhung der Hybridisierungstemperatur, Verringerung der Salzkonzentration oder Zugabe von denaturierendem Formamid erreicht werden. Formamid-Interferenzen mit den Wasserstoffbrücken, die Nukleinsäure-Duplexe stabilisieren. Hier werden die Temperatur und die Salzkonzentration in der Hybridisierung nicht verändert, während die Formamidkonzentration abgestimmt wird. Die optimale Formamidkonzentration für neu konzipierte Sonden wird experimentell mit Hilfe von Formamid-Dissoziationskurven¹⁰ bestimmt. Die erforderliche Formamidkonzentration für publizierte Sonden kann in der probeBase¹⁵ oder durch eine Literaturrecherche gefunden werden. Alternativ können vorhergesagte Formamid-Konzentrationen aus der In-silico-Analyse mit mathFISH¹⁶ gewonnen werden. Im Waschschritt führt eine etwas höhere Temperatur zu einer etwas strengeren Bedingung, was zu einer höheren Bindungsspezifität führt.

3. Probenvorbereitung (Abbildung 2C)

1. Reinigung und Beschichtung von Objektträgern:
   1. Verwenden Sie standardisierte CaF_{2-Objektträger} (10 mm Durchmesser und 350 μm Dicke für Kompatibilität mit dem Probenhalter des Geräts). Tauchen Sie den CaF₂ 15 Minuten lang in 70%iges Ethanol und spülen Sie ihn zweimal mit DI-Wasser aus.
   2. Die gereinigten Objektträger in 0,1%ige Poly-L-Lysin-Lösung überführen und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Spülen Sie die Objektträger einmal mit DI-Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft.
2. Tauen Sie die vorbereiteten Zellproben bei RT auf, während sie vor Licht geschützt sind.
3. Um übermäßige Salzkristalle aus PBS während der Probentrocknung zu vermeiden, befolgen Sie die Schritte 3.3.1 bis 3.3.2.
   1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit deionisiertem Wasser (DI). Bei 14.000 x g für 10 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
   2. Geben Sie das ursprüngliche Volumen an DI-Wasser wieder hinzu und wirbeln Sie vorsichtig vortexen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und fügen Sie erneut das DI-Wasser hinzu.
4. (Fakultativ) Bei Mischproben wird von jeder Probe das gleiche Volumen übertragen und in ein Zentrifugenröhrchen gemischt.
5. Die bakteriellen Zellproben durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 min konzentrieren und den Überstand entfernen.
6. Die restliche Lösung ~30 s lang vorsichtig vortexen und 1-2 μl Lösung auf den vorbereiteten CaF_{2-Objektträger} geben. Trocknen Sie die Probe 30 Minuten lang an der Luft, während sie vor Licht geschützt ist.
   HINWEIS: Nach dem Trocknen an der Luft sollte ein kleiner runder Punkt auf dem Objektträger erscheinen. Durch den "Kaffeering"-Effekt hätten die Ränder des Punktes eine höhere Dichte an Bakterienzellen. Dieser Zentrifugenschritt dient dazu, eine geeignete Dichte für eine effiziente Einzelzell-Bakterienbildgebung zu erreichen. Die ideale Konzentration sollte unter dem Mikroskop zu einer gleichmäßigen und dichten Schicht einzelner Bakterienzellen führen. Wenn nach der Zentrifuge ein klares Pellet vorhanden ist, das mit bloßem Auge zu sehen ist, entfernen Sie den Überstand, so dass die Lösung nach dem Wirbel fast klar aussieht. An der Kontrollprobe könnte ein Schnelltest durchgeführt werden, um das Volumen der Überstandsentfernung abzuschätzen. Ein Array von Tröpfchen mit unterschiedlichen Mengen an verbleibendem Überstand könnte auf dem Objektträger des Mikroskops abgeschieden werden, um das optimale Verdünnungsvolumen unter dem Hellfeldmikroskop zu untersuchen. Wenn nach der Zentrifugation kein sichtbares Pellet vorhanden ist, entfernen Sie den größten Teil des Überstands, um die Proben so weit wie möglich zu konzentrieren. Der Trick besteht darin, das Zentrifugenrohr mit dem Scharnier nach außen in einem Festwinkelrotor so zu positionieren, dass das Pellet auf der gleichen Seite des Rohrscharniers erscheint. Darüber hinaus können die Pipettengrößen (P1000, P200, P10) abgespeckt werden, um die Präzision bei der Entfernung des Überstands zu erhöhen und das Pellet intakt zu halten.
7. Montieren Sie den Objektträger in einem mitgelieferten Probenhalter und verwenden Sie kleine Punkte aus Polyesterband, um den Objektträger während der Messung zu sichern.

4. OPTIR-FISH-Bildgebung

HINWEIS: Die Fluoreszenzbildgebung und die OPTIR-Bildgebung werden auf dem OPTIR-System durchgeführt.

1. Geometrie des Systems:
   1. Verwenden Sie mit diesem Protokoll die Gegenausbreitung einer Pumpe im mittleren IR-Bereich und einer sichtbaren Sonde sowie eine Rückwärtsdetektion (epi) von sichtbarem Licht.
   2. Um das sichtbare Licht zu fokussieren und zurückreflektiertes und gestreutes sichtbares Licht zu sammeln, verwenden Sie ein Luftobjektiv (50 x 0,8 NA). Um das Licht im mittleren IR-Bereich zu fokussieren, verwenden Sie ein Cassegrain-Objektiv (40 x 0,78 NA).
   3. Stellen Sie sicher, dass das System auch mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmodul mit mehreren Fluoreszenzfiltersätzen ausgestattet ist. Wählen Sie für die in diesem Protokoll verwendeten Fluorophore das grün fluoreszierende Protein (GFP)-Filterset für die Cy3-Detektion und das Alexa Fluor 647-Filterset für die Cy5-Detektion.
2. Bereiten Sie sich auf Messungen vor:
   1. Schalten Sie das System ein und öffnen Sie die Gerätesteuerungssoftware. Schalten Sie nach der Initialisierung den Schieberegler Counterprop und Fluoreszenz auf die Position Ein.
   2. Stellen Sie das Objektiv auf 50x ein, und führen Sie dann den automatischen Hintergrund aus, um das IR-Leistungsspektrum zu erfassen. Verwenden Sie das Leistungsspektrum, um erfasste Probenspektren zu normalisieren oder OPTIR-Bilder mit unterschiedlichen Wellenzahlen zu normalisieren. Dadurch wird der Einfluss von Unterschieden zwischen der Laserleistung im mittleren IR auf die Datenanalyse und -quantifizierung ausgeschlossen.
      HINWEIS: Die Erfassung von IR-Leistungsspektren für die Normalisierung ist für die nachgelagerte quantitative Analyse unerlässlich, da die gemessene Intensität linear mit der IR-Leistung zusammenhängt. Nach dem Ausführen des automatischen Hintergrunds normalisiert die Software die OPTIR-Spektren und OPTIR-Bilder automatisch auf die IR-Leistungsspektren für den Benutzer. Durch das Spülen des Systems mit N₂ kann der Einfluss von Wasserdampf minimiert und die Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten erhöht werden.
3. Um das Sample zu laden, verwenden Sie die Schaltfläche "Entladen", um den Sample-Tisch nach außen zu verschieben. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, z. B. 10-fach, um den Probenbereich zu lokalisieren und zu dem Bereich mit optimaler Probendichte zu navigieren. Fokussieren Sie die Probe, indem Sie die Objektivhöhe in der Steuerungssoftware einstellen. Ändern Sie die Zielauswahl auf 50x.
4. Bilderfassung
   HINWEIS: Die verwendeten Proben sind: i) E. coli (¹³C-Glukose inkubiert); ii) E. coli (¹²C-Glukose inkubiert); iii) B. theta (¹²C-Glukose inkubiert); iv) Mischung aus E. coli (¹³C-Glukose inkubiert) und B. theta (¹²C-Glukose inkubiert).
   1. Hellfeldbilder (Abbildung 2D): Bringen Sie die Probe in den Fokus, indem Sie sich die Hellfeldbilder ansehen.
   2. Fluoreszenzbilder (Abbildung 2E): Ändern Sie den Filtersatz, indem Sie auf die Schaltfläche für den Filternamen klicken (GFP für Cy3 und Alexa Fluor 647 für Cy5), um Fluorophore zu erkennen, die mit den entworfenen FISH-Sonden verbunden sind, und erfassen Sie sequenziell Fluoreszenzbildgebung mit dem Fluoreszenzmodul in der Software. Passen Sie die Lichtintensität und die Belichtungszeit an, um einen angemessenen Signalkontrast zu erhalten, bevor Sie die Fluorophore bleichen.
      HINWEIS: Da die bei OPTIR-Messungen verwendete Sonde Photofluorophore photobleichen kann, sollten Fluoreszenzbilder immer vor OPTIR-Bildern aufgenommen werden. Für Bedenken hinsichtlich der Wirkung von fluoreszierenden Markern auf die OPTIR-Detektion verweisen wir auf eine zuvor veröffentlichte Arbeit, die zeigte, dass FISH mit Cy5-Fluorophor die folgende Quantifizierung auf der Grundlage von OPTIR-Bildern nicht beeinflusst, da Cy5 im Vergleich zum bakteriellen Zielprotein⁹ klein und in der Häufigkeit gering ist.
   3. OPTIR-Bilder (Abbildung 2F):
      1. Bestimmen Sie die normale Peak- und isotopeninduzierte rotverschobene Peakposition. Im Falle der Proteinsynthese aus ¹³C-Glukose wird der normale Amid-I-Peak bei etwa 1656 cm-1 und der rotverschobene Peak bei etwa 1612 ^cm-1 nachgewiesen (Abbildung 3A).
         HINWEIS: Die normale Peakposition hängt von der interessierenden biochemischen Komponente und/oder dem Stoffwechselprodukt ab. Die verschobene Peakposition hängt auch davon ab, welches Isotop für die Markierung verwendet wird. Diese beiden Wellenzahlen könnten auch experimentell bestimmt werden, indem die vollständigen Spektren von unmarkierten und maximal markierten Zellen gemessen werden (siehe Schritt 4.5)
      2. Stellen Sie die Wellenlänge der IR-Pumpe mit der Software auf 1656 ^cm-1 ein. Ändern Sie die Sondenleistung und die Detektorverstärkung entsprechend, um eine Sättigung des DC-Signals (8 V) zu vermeiden. Passen Sie die Höhe des unteren Cassegrain-Objektivs fein ab, um das AC-Signal zu maximieren.
         HINWEIS: Die typische IR-Leistung an der Probe beträgt etwa 5 mW, und die Sondenleistung an der Probe beträgt je nach Probe etwa 3-15 mW. Sowohl die IR- als auch die Sondenleistung können mit der Steuerungssoftware angepasst werden, um den Leistungspegel zu optimieren und einen hohen Bildkontrast zu gewährleisten und gleichzeitig eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
      3. Stellen Sie OPTIR-Bilder auf 200 x 200 Pixel ein und stellen Sie die Abtastrate auf 100 μm/s ein. Stellen Sie die Schrittweite in X- und Y-Richtung auf 150 nm ein, sodass die Bildgröße etwa 30 x 30 μm² beträgt.
      4. Erfassen Sie das Bild.
      5. Stimmen Sie die Wellenlänge der IR-Pumpe auf 1612 ^cm-1 ab und nehmen Sie ein Bild aus demselben Sichtfeld bei dieser Wellenzahl auf.
      6. Stellen Sie für jede Probe mindestens drei Sichtfelder für die statistische Analyse dar.
5. (Fakultativ) Spektrale Messung: Wenn nach der Bildaufnahme ein räumliches Merkmal von Interesse lokalisiert wird, führen Sie die spektrale Messung durch.
   1. Positionen auswählen: Wählen Sie einen einzelnen Punkt aus oder geben Sie ein Array von Punkten für die Analyse im Spektralmodul der Software an.
   2. Stellen Sie den Parameter für die spektrale Abtastung ein. Wählen Sie je nach Bedarf den Wellenzahlabdeckungsbereich, die Scangeschwindigkeit und den Datenausgabeabstand aus.
      HINWEIS: Wenn sich die Scangeschwindigkeit und der Datenausgabeabstand von denen unterscheiden, die im Schritt der Hintergrunderfassung (Schritt 4.2) verwendet wurden, ist für eine korrekte Normalisierung ein neuer Hintergrund erforderlich, der auf den aktuellen spektralen Scanparametern basiert.
   3. Stellen Sie die Co-Mittelungszahl ein und starten Sie die Spektralmessung. Die Erhöhung der Co-Mittelung erhöht auch das Signal-Rausch-Verhältnis der Spektren, erfordert jedoch längere Erfassungszeiten.
      HINWEIS: Wenn während der Co-Mittelwertbildung eine signifikante Fluktuation beobachtet wird, kann dies auf eine durch Lasererwärmung induzierte Instabilität der Probe hinweisen. Dies kann oft durch Verringern der IR-Leistung und/oder Verringern der sichtbaren Sondenleistung behoben werden.

5. Datenverarbeitung und -analyse auf Einzelzellebene

1. Quantifizierung der metabolischen Synthese aus Isotopensubstraten (Abbildung 2G)
   HINWEIS: Die folgende Quantifizierung des metabolischen Einbaus aus Isotopensubstraten basiert auf OPTIR-Bildern mit zwei Wellenzahlen, die den normalen und verschobenen Peaks der Zielmakromoleküle entsprechen. Im Vergleich zu einem vollständigen hyperspektralen Stack könnte die Zwei-Wellenzahl-Bildgebung den Zeitaufwand für jedes FOV erheblich reduzieren und den Durchsatz verbessern, während der für die Quantifizierung des Metabolismus entscheidende Isotopeneffekt vollständig wiedererfasst wird.
   1. Subtrahieren Sie das verschobene Peak-OPTIR-Bild vom normalen Peak-OPTIR-Bild, um eine visuelle Karte der Syntheseaktivitäten von Isotopensubstraten zu erhalten. Als Demonstration (Abbildung 3C) für E. coli , die mit ¹³C-Glukose kultiviert wurden, deuten die positiven Pixel im Bild (1656 ^{cm-1-1612 cm-1}) auf einen aktiven Einbau von ¹³C in Proteine hin, daher auf ein höheres Proteinsyntheseniveau.
      HINWEIS: Die Subtraktion kann mit der ImageJ Image Calculator-Funktion durchgeführt werden. Alternativ kann die Subtraktion problemlos in einer beliebigen bevorzugten Programmiersprache für die Stapelverarbeitung durchgeführt werden.
   2. Quantifizierung der einzelligen Stoffwechselaktivität
      1. Ermitteln Sie Koeffizienten (dargestellt durch h in Abbildung 2G) aus unmarkierten und vollständig markierten Referenzproben. Da sich der isotopeninduzierte rotverschobene Peak teilweise mit dem normalen Peak überlappen würde, tragen sowohl unmarkierte als auch markierte (neu synthetisierte aus dem isotopenmarkierten Substrat synthetisierte) Proben zu den OPTIR-Signalen am normalen und verschobenen Peak bei. Quantifizieren Sie diese verschiedenen Beiträge unter Verwendung der normalisierten OPTIR-Signalintensität am normalen und verschobenen Peak von unmarkierten und vollständig markierten Referenzproben.
         HINWEIS: Für Referenzproben werden unmarkierte Referenzproben ohne isotopenmarkiertes Substrat gezüchtet (oder inkubiert). Vollständig markierte Referenzproben werden in der Regel mit der höchsten Konzentration an isotopenmarkiertem Substrat und der längsten Kultivierungszeit gezüchtet.
      2. Für die Einzelzellanalyse erhalten Sie Einzelzellmasken basierend auf den Hellfeldbildern.
         HINWEIS: Hier können verschiedene Techniken der Bildverarbeitung angewendet werden, um diese Maske zu erzeugen, einschließlich verschiedener Partikeldetektion wie Blob-Analyse und Zellsegmentierungsmethoden wie Watershed.
      3. Messen Sie die OPTIR-Signalintensität von einzelnen Zellen. Wenden Sie die erfasste Einzelzellmaske auf die beiden OPTIR-Bilder (bei normalem Peak und verschobenem Peak) an und mitteln Sie für jede einzelne Zelle die Pixelwerte im Bereich der Einzelzellmaske. Für die Quantifizierung wird der gemittelte Wert aus einzelnen Zellen verwendet.
      4. Berechnen Sie für jede Zelle den relativen Beitrag von unmarkierten und markierten Biokomponenten auf der Grundlage der Koeffizienten aus Schritt 5.1.2.1 und der Signale aus Schritt 5.1.2.3.
         HINWEIS: Ein Isotopenverdrängungsverhältnis ist definiert als der relative Beitrag der markierten Biokomponenten zur Summe der markierten und unmarkierten Biokomponenten (Abbildung 2G). Dieses Verhältnis sollte im Bereich von 0 bis 1 liegen. Das Isotopenersatzverhältnis ist linear proportional zum Verhältnis von ¹³C-Glukose zu ¹²C-Glukose (mit einer festen Gesamtglukosemenge)⁹. Für E. coli-Zellen wurde eine hohe Nachweisempfindlichkeit von 5% ¹³C-Glucose nachgewiesen.
2. Identifizierung von Bakterienspezies anhand von Mehrkanal-Fluoreszenzbildern (Abbildung 2H)
   1. Führen Sie die mehrfarbigen Fluoreszenzkanäle zusammen, um mit ImageJ (Image > Color > Merge Channels) eine visuelle Führung für verschiedene Bakterienarten zu erstellen.
   2. Generieren Sie für die Einzelzellanalyse für jeden Fluoreszenzkanal einen Satz von Regionen von Interesse (Regions of Interest, ROIs) für einzelne Zellen.
      HINWEIS: Hier können verschiedene Techniken der Bildverarbeitung angewendet werden, um die Maske zu generieren, einschließlich verschiedener Methoden zur automatischen Schwellenwertierung und Zellsegmentierung.
3. Korrelation von FISH-Identitäten und OPTIR-Stoffwechselaktivitäten (Abbildung 2I)
   1. Verknüpfen Sie die bakteriellen Identitäten auf Einzelzellebene aus FISH-Fluoreszenzbildern direkt mit den metabolischen Aktivitäten aus OPTIR-Bildern, indem Sie die Positionen der ROIs korrelieren.
   2. Führen Sie statistische Analysen durch, um die Stoffwechselaktivitäten verschiedener Arten zu vergleichen.
      HINWEIS: Masken werden getrennt von Fluoreszenzbildern und OPTIR-Bildern generiert, da die Stoffwechselaktivitäten für alle Zellen aus OPTIR-Bildern analysiert werden konnten, während unbekannte Zellen auf keinem der Fluoreszenzkanäle angezeigt wurden. So wird sichergestellt, dass alle Zellen in die Stoffwechselanalyse einbezogen werden können. Wenn es eine große Anzahl unidentifizierter Zellen gibt, müssen möglicherweise verschiedene FISH-Sonden in Betracht gezogen werden, die auf die rRNA verschiedener Taxa von Interesse abzielen.

Ergebnisse

Der allgemeine Arbeitsablauf für die einzelzellige mikrobielle Stoffwechselanalyse mit genetischer Identifizierung mittels OPTIR-FISH ist zusammengefasst in Abbildung 2. Die repräsentativen Ergebnisse, die die Fähigkeit von OPTIR zur molekularen metabolischen Bildgebung demonstrieren, sind in Abbildung 3. In diesem Beispiel wurden E. coli-Zellen verwendet, die mit ¹²C- oder ¹³C-Glukose für 24 h. Die Ein...

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung der OPTIR-FISH-Plattform zur gleichzeitigen Identifizierung mikrobieller Spezies und zur Quantifizierung der metabolischen Aktivitäten mit Einzelzellauflösung beschrieben. Zu den kritischen Schritten gehören Kulturen mit stabiler Isotopenmarkierung zur Untersuchung spezifischer Stoffwechselaktivitäten und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Identifizierung von mikrobiellen Zielspezies. Mehrkanal-Flu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G