Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

Résumé

Ici, nous présentons un protocole utilisant l’hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH), également connue sous le nom de FISH PHOTOTHERMIQUE DANS L’INFRAROUGE MOYEN (MIP-FISH), pour identifier les cellules individuelles et comprendre leur métabolisme. Cette méthodologie peut être largement appliquée à diverses applications, notamment la cartographie du métabolisme cellulaire avec une résolution unicellulaire.

Résumé

Comprendre les activités métaboliques des cellules individuelles au sein de communautés complexes est essentiel pour démêler leur rôle dans la maladie humaine. Ici, nous présentons un protocole complet d’identification cellulaire et d’analyse métabolique simultanées avec la plateforme OPTIR-FISH en combinant des sondes FISH marquées à ARNr et des substrats marqués par isotope. L’imagerie par fluorescence permet l’identification cellulaire par la liaison spécifique de sondes FISH marquées à ARNr, tandis que l’imagerie OPTIR fournit des activités métaboliques au sein de cellules individuelles par décalage vers le rouge induit par les isotopes sur les spectres OPTIR. En utilisant des bactéries cultivées avec ^{du 13}C-glucose comme banc d’essai, le protocole décrit la culture microbienne avec marquage isotopique, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), la préparation des échantillons, l’optimisation de la configuration d’imagerie OPTIR-FISH et l’acquisition de données. Nous montrons également comment effectuer une analyse d’images et interpréter des données spectrales au niveau d’une cellule unique avec un débit élevé. La nature normalisée et détaillée de ce protocole facilitera grandement son adoption par des chercheurs de divers horizons et disciplines au sein de la vaste communauté de recherche sur le métabolisme unicellulaire.

Introduction

Le métabolisme cellulaire est un pilier fondamental de la biologie cellulaire, guidant de nombreux processus qui déterminent la santé, la fonction et l’interaction des cellules avec l’environnement. L’analyse du métabolisme au niveau des cellules individuelles, en particulier dans les environnements natifs, fournit des informations inestimables pour révéler les activités hétérogènes et complexes des systèmes biologiques¹. Ceci est particulièrement crucial dans l’étude des micro-organismes, car de nombreux microbes présentent des exigences de croissance uniques ou des dépendances environnementales qui remettent ....

Protocole

L’utilisation d’échantillons bactériens dans cette étude est conforme aux directives de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Boston et du National Institute of Health.

REMARQUE : Le flux de travail général suivi dans ce protocole est résumé à la figure 2.

1. Culture bactérienne et marquage isotopique (figure 2A)

REMARQUE : L’exemple donné ici concerne l’étiquetage d’une culture bactérienne pure. Si l’on applique ce protocole à des communautés po....

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole détaillé pour l’application de la plateforme OPTIR-FISH pour l’identification simultanée des espèces microbiennes et la quantification des activités métaboliques à la résolution de la cellule unique. Les étapes critiques comprennent la culture avec marquage d’isotopes stables pour l’étude d’activités métaboliques spécifiques et l’hybridation in situ en fluorescence pour identifier les espèces microbiennes cibles. L?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G