Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

Résumé

Ici, nous présentons un protocole utilisant l’hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH), également connue sous le nom de FISH PHOTOTHERMIQUE DANS L’INFRAROUGE MOYEN (MIP-FISH), pour identifier les cellules individuelles et comprendre leur métabolisme. Cette méthodologie peut être largement appliquée à diverses applications, notamment la cartographie du métabolisme cellulaire avec une résolution unicellulaire.

Résumé

Comprendre les activités métaboliques des cellules individuelles au sein de communautés complexes est essentiel pour démêler leur rôle dans la maladie humaine. Ici, nous présentons un protocole complet d’identification cellulaire et d’analyse métabolique simultanées avec la plateforme OPTIR-FISH en combinant des sondes FISH marquées à ARNr et des substrats marqués par isotope. L’imagerie par fluorescence permet l’identification cellulaire par la liaison spécifique de sondes FISH marquées à ARNr, tandis que l’imagerie OPTIR fournit des activités métaboliques au sein de cellules individuelles par décalage vers le rouge induit par les isotopes sur les spectres OPTIR. En utilisant des bactéries cultivées avec ^{du 13}C-glucose comme banc d’essai, le protocole décrit la culture microbienne avec marquage isotopique, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), la préparation des échantillons, l’optimisation de la configuration d’imagerie OPTIR-FISH et l’acquisition de données. Nous montrons également comment effectuer une analyse d’images et interpréter des données spectrales au niveau d’une cellule unique avec un débit élevé. La nature normalisée et détaillée de ce protocole facilitera grandement son adoption par des chercheurs de divers horizons et disciplines au sein de la vaste communauté de recherche sur le métabolisme unicellulaire.

Introduction

Le métabolisme cellulaire est un pilier fondamental de la biologie cellulaire, guidant de nombreux processus qui déterminent la santé, la fonction et l’interaction des cellules avec l’environnement. L’analyse du métabolisme au niveau des cellules individuelles, en particulier dans les environnements natifs, fournit des informations inestimables pour révéler les activités hétérogènes et complexes des systèmes biologiques¹. Ceci est particulièrement crucial dans l’étude des micro-organismes, car de nombreux microbes présentent des exigences de croissance uniques ou des dépendances environnementales qui remettent en question les méthodes de culture traditionnelles². Par exemple, certaines espèces peuvent nécessiter des compositions nutritionnelles spécifiques ou des relations symbiotiques difficiles à reproduire en laboratoire, ce qui les rend non cultivables par les techniques standard³. De plus, les longues périodes nécessaires à la culture de certaines espèces posent des défis importants pour la recherche microbiologique, s’étendant souvent au-delà des délais pratiques d’étude et d’analyse. Pour contourner ces limitations, des méthodes alternatives telles que la réaction en chaîne par polymérase et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permettent d’identifier les espèces microbiennes sans nécessiter de culture⁴, ce qui permet d’obtenir une vue plus précise et holistique des écosystèmes microbiens. Cependant, ces technologies analytiques n’ont pas la capacité d’élucider le métabolisme cellulaire. Cette lacune met en évidence les défis actuels dans le domaine de la microbiologie : la tâche concomitante de différencier l’identité cellulaire et d’élucider le métabolisme au niveau de la cellule unique. Les progrès de techniques telles que la spectrométrie de masse par imagerie (MÉMO) couplée à des isotopes stables sont devenus des outils puissants pour l’analyse métabolique d’une seule cellule⁵. Dans ces expériences, des cellules ont été incubées avec des substrats contenant des isotopes tels que le ¹³C ou ^{le 15}N. Les biomolécules nouvellement anabolisées portent ces isotopes, ce qui les rend distinguables sur les spectres m/z. Cependant, l’IMS souffre d’une instrumentation coûteuse, d’une préparation d’échantillon compliquée, d’un débit relativement faible et de l’expertise requise pour analyser les spectres m/z. Lorsqu’il est combiné à l’imagerie de fluorescence spécifique aux marqueurs moléculaires, des progrès ont été réalisés dans l’élucidation du métabolisme cellulaire avec une spécificité accrue⁶. Néanmoins, des défis persistent pour faire le lien entre ces deux modalités. La différence de résolution entre l’IMS et l’imagerie de fluorescence, combinée à des configurations opérationnelles différentes, rend difficile l’alignement et la corrélation des résultats⁷.

L’intégration de l’imagerie spectroscopique vibrationnelle avec le marquage des isotopes stables offre une solution novatrice pour l’étude du métabolisme des cellules uniques. L’incorporation d’isotopes plus lourds ralentit la vibration des liaisons chimiques, ce qui entraîne des pics décalés vers le rouge dans les spectres vibrationnels⁸. Notamment, l’imagerie vibrationnelle fournit une résolution spatiale comparable à l’imagerie de fluorescence, et la quantification métabolique et l’identification cellulaire peuvent être effectuées dans une seule configuration, simplifiant ainsi l’enregistrement et la corrélation des images. Nos travaux récents ont démontré la combinaison d’une plateforme d’imagerie vibratoire avancée : l’infrarouge photothermique optique (OPTIR) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour sonder le métabolisme du glucose dans les communautés bactériennes⁹ (Figure 1). OPTIR est un système de microscopie spectroscopique vibrationnelle qui exploite l’effet photothermique de l’absorption dans l’infrarouge moyen en détectant le changement de lumière visible, ce qui fournit une résolution submicrométrique comme en microscopie optique, mais avec des informations spectroscopiques vibratoires supplémentaires provenant de l’absorption dans l’infrarouge moyen. La FISH est une technique couramment utilisée pour déterminer l’identité des micro-organismes au niveau de la cellule unique. La séquence d’oligonucléotides pourrait être conçue pour cibler des séquences 16S spécifiques de différents taxons, et différents fluorophores pourraient être attachés. L’hybridation spécifique des sondes oligonucléotidiques conçues avec l’ARNr cible conduit à de forts signaux de fluorescence des espèces cibles dans les cellules individuelles, et l’imagerie de fluorescence multicanal pourrait être réalisée pour identifier plusieurs espèces au sein de la population. Comme l’imagerie OPTIR et l’imagerie de fluorescence sont toutes deux basées sur la détection optique, la combinaison de la fluorescence OPTIR et FISH est simple à mettre en œuvre. Les deux modalités partagent la même résolution optique pour l’analyse d’une seule cellule et peuvent être commutées facilement sans nécessiter d’alignement ou de co-enregistrement supplémentaire.

Ce protocole présente un guide détaillé sur l’exploitation de la plateforme OPTIR-FISH pour l’analyse avancée de la structure et de la fonction d’une cellule unique. Nous avons utilisé les échantillons bactériens cultivés dans des milieux contenant ^{du 13}C-glucose comme banc d’essai et avons quantifié la synthèse de novo des protéines à partir du ¹³C-glucose. Afin de démontrer la capacité de la plateforme à identifier les cellules, nous avons utilisé des mélanges bactériens dans lesquels chaque espèce a été marquée à l’aide de sondes FISH ciblées sur l’ARNr. Cette approche a permis l’identification précise de souches bactériennes spécifiques, telles que Escherichia coli (E. coli) et Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), et leur métabolisme. Ce protocole offre aux chercheurs un outil puissant pour le profilage métabolique et l’identification simultanée des espèces au niveau de la cellule unique, promettant de faire progresser notre compréhension des interactions cellulaires, de la physiologie et de leurs rôles dans des environnements complexes.

Protocole

L’utilisation d’échantillons bactériens dans cette étude est conforme aux directives de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Boston et du National Institute of Health.

REMARQUE : Le flux de travail général suivi dans ce protocole est résumé à la figure 2.

1. Culture bactérienne et marquage isotopique (figure 2A)

REMARQUE : L’exemple donné ici concerne l’étiquetage d’une culture bactérienne pure. Si l’on applique ce protocole à des communautés polymicrobiennes, le milieu et le temps de marquage doivent être ajustés en fonction de la communauté et de la physiologie des organismes d’intérêt.

1. Inoculer la souche bactérienne d’intérêt à partir d’une seule colonie et pré-cultiver dans un milieu riche en nutriments tel que le bouillon de soja tryptique (TSB) ou le bouillon Luria-Bertani (LB) pendant 3 h pour atteindre la phase de croissance exponentielle (log). E. coli BW25113 est utilisée comme exemple de souche dans ce protocole.
   REMARQUE : Le temps pour atteindre la phase de bûche variera en fonction de la souche utilisée. Ce temps doit être adapté à chaque souche.
2. Mesurer la densité optique à 600 nm pour estimer la concentration bactérienne.
3. Préparez un milieu de croissance minimal complété par des substrats marqués isotopiquement. Pour E . coli BW25113, compléter le milieu minimal M9 avec du ¹³C-glucose à une concentration finale de 0,2 % (p/v).
   REMARQUE : Le ^13-C-glucoseutilisé (D-glucose U−¹³C₆, 99 %) a été universellement étiqueté, où tous les atomes de carbone ont été remplacés par des atomes ^{de 13}C. Le choix du milieu de croissance minimal dépendra de la souche bactérienne. Le choix du substrat isotopique dépendra du processus métabolique spécifique d’intérêt. L’objectif global est que le substrat isotopique serve de principale source de nutrition par rapport à leurs homologues non étiquetés.
4. Diluer les bactéries dans le milieu de croissance minimal contenant le substrat marqué isotopiquement jusqu’à une concentration finale de 5 × 10⁵ UFC/mL.
   REMARQUE : Habituellement, un taux de dilution élevé comme 1:100 est utilisé, et la nutrition non étiquetée du milieu riche devient négligeable. Alternativement, pour assurer l’élimination complète du milieu riche en nutriments, un lavage avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pourrait être effectué par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C et remise en suspension dans du PBS suivie d’une seconde centrifugation et d’une remise en suspension finale dans le milieu de croissance minimal.
5. Cultivez des échantillons bactériens dans un incubateur à agitation orbitale dans des conditions de croissance optimales. En général, réglez l’incubateur à agitation orbitale à une vitesse de 220 tr/min et à une température de 37 °C, et placez les tubes de culture inclinés avec un capuchon lâche pour l’incubation aérobie. Pour E. coli, 24 h d’incubation aérobie à 37 °C sont généralement suffisantes pour atteindre un marquage maximal de ¹³°C.
   REMARQUE : Le temps d’incubation dépend du processus métabolique d’intérêt. Un temps d’incubation plus long conduit généralement à un marquage isotopique plus élevé. Une mesure de la courbe de croissance dans les mêmes conditions avec un substrat non étiqueté pourrait fournir des informations pour déterminer les points de collecte appropriés.
6. Prélever les cellules bactériennes aux points temporels souhaités par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
7. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans un volume égal de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS. Fixer les cellules dans une solution de PFA pendant 10 min à température ambiante (RT) ou 2 h à 4 °C. Pour un stockage à long terme, laver les cellules deux fois avec du PBS, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de 50 % (v/v) de PBS et d’éthanol à 96 %, et les conserver à -20 °C jusqu’à nouvel ordre.

2. Hybridation in situ en fluorescence (FISH) (Figure 2B)

1. Hybridez des cellules E. coli avec la sonde oligonucléotidique Gam42a¹⁰ marquée avec un fluorophore cyanine5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) et des cellules B. thêta avec la sonde oligonucléotidique Bac303¹¹ marquée avec un fluorophore cyanine3 (Cy3) (Bac303-Cy3), selon un protocole FISH standard.
   REMARQUE : Principes fondamentaux de l’ARNr-FISH pour l’identification : Les molécules d’ARNr sont des cibles idéales pour les FISH car elles sont distribuées de manière omniprésente et naturellement amplifiées dans les cellules microbiennes. L’ARNr contient également des régions à séquence conservée et variable, de sorte que la profondeur phylogénétique du groupe cible pourrait être déterminée par le degré de conservation de la sonde oligonucléotidique. En liant spécifiquement la sonde conçue à la séquence cible, le fluorophore marqué montre des signaux fluorescents pour des cellules individuelles.
2. Se référer à la littérature précédemment publiée 12,13,14 pour le protocole détaillé pour l’hybridation in situ en fluorescence. Les étapes ci-dessous décrivent brièvement le protocole standard pour les cellules microbiennes.
   1. Déshydratation:
      1. Centrifuger les cellules fixes (100 μL) à 14 000 x g pendant 10 min pour les réduire en granulés, les remettre en suspension dans 100 μL d’éthanol à 96 % de qualité analytique et incuber pendant 1 min à RT.
      2. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules à 14 000 x g pendant 5 min, retirez l’éthanol et laissez sécher la pastille de cellule à l’air.
   2. Hybridation : Hybrider les cellules en solution (100 μL) pendant 3 h à 46 °C.
      REMARQUE : Le tampon d’hybridation se compose de 900 mM de NaCl, de 20 mM de Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane HCl, de 1 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique, de 0,01 % de dodécylsulfate de sodium, de 100 ng de l’oligonucléotide marqué par fluorescence respectif et de la concentration de formamide requise pour obtenir des conditions strictes.
   3. Centrifugeuse : Immédiatement après l’hybridation, transférez les échantillons dans une centrifugeuse avec un rotor préchauffé à 46 °C et une centrifugeuse à 14 000 x g pendant 15 min à la température maximale autorisée (généralement 40 °C).
   4. Laver et ranger :
      1. Laver les échantillons dans un tampon d’une rigueur appropriée pendant 15 min à 48 °C. Ensuite, centrifugez les cellules à 14 000 x g pendant 15 min à la température maximale autorisée dans une centrifugeuse avec un rotor préchauffé à 46 °C.
      2. Enfin, lavez les cellules avec 500 μL de PBS glacé, mettez-les en suspension dans 20 μL de 1x PBS et stockez-les à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
         REMARQUE : La liaison spécifique de la sonde est assurée par une rigueur d’hybridation correcte. Une strictivité élevée pourrait être obtenue en augmentant la température d’hybridation, en diminuant la concentration en sel ou en ajoutant du formamide dénaturant. Le formamide interfère avec les liaisons hydrogène qui stabilisent les duplex d’acide nucléique. Ici, la température et la concentration en sel ne sont pas modifiées lors de l’hybridation lors de l’ajustement de la concentration en formamide. La concentration optimale de formamide pour les sondes nouvellement conçues est déterminée expérimentalement à l’aide des courbes de dissociation du formamide¹⁰. La concentration de formamide requise pour les sondes publiées peut être trouvée dans la sonde^{Base 15} ou par une recherche documentaire. Alternativement, les concentrations estimées de formamide peuvent être obtenues à partir d’une analyse in silico à l’aide de mathFISH¹⁶. Dans l’étape de lavage, une température légèrement plus élevée conduit à une condition légèrement plus stricte, ce qui conduit à une spécificité de liaison plus élevée.

3. Préparation de l’échantillon (figure 2C)

1. Nettoyage et revêtement des lames :
   1. Utilisez des lames CaF₂ normalisées (10 mm de diamètre et 350 μm d’épaisseur pour la compatibilité avec le porte-échantillon de l’instrument). Plongez le CaF₂ dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min et rincez deux fois à l’eau DI.
   2. Transférez les lames nettoyées dans une solution de poly-L-lysine à 0,1 % et incubez pendant une nuit à 4 °C. Rincez une fois les lames à l’eau DI et séchez-les à l’air.
2. Décongelez les échantillons cellulaires préparés à RT à l’abri de la lumière.
3. Pour éviter la présence excessive de cristaux de sel de PBS pendant le séchage de l’échantillon, suivez les étapes 3.3.1 et 3.3.2.
   1. Lavez les cellules deux fois avec de l’eau déminéralisée (DI). Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.
   2. Rajoutez le volume d’origine d’eau DI et tourbillonnez doucement. Répétez la centrifugation et ajoutez à nouveau le lavage à l’eau DI.
4. (Facultatif) Pour les échantillons de mélange, transférez le même volume de chaque échantillon et mélangez dans un tube à centrifuger.
5. Concentrer les échantillons de cellules bactériennes par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
6. Agiter doucement la solution restante pendant ~30 s et ajouter 1 à 2 μL de solution sur la lame de CaF₂ préparée. Faites sécher l’échantillon à l’air libre pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.
   REMARQUE : Un petit point rond doit apparaître sur la lame après le séchage à l’air. En raison de l’effet « anneau de café », les bords du point auraient une densité plus élevée de cellules bactériennes. Cette étape de centrifugation consiste à atteindre une densité appropriée pour une imagerie bactérienne unicellulaire efficace. La concentration idéale devrait conduire à une couche uniforme et dense de cellules bactériennes individuelles au microscope. S’il y a une pastille claire qui peut être vue à l’œil nu après la centrifugeuse, retirez le surnageant de sorte qu’après le vortex, la solution semble presque claire. Un test rapide pourrait être effectué sur l’échantillon de contrôle pour estimer le volume d’élimination du surnageant. Un ensemble de gouttelettes contenant différentes quantités de surnageant restant pourrait être déposé sur la lame de verre du microscope afin d’examiner le volume de dilution optimal sous le microscope à fond clair. S’il n’y a pas de pastille visible après la centrifugation, prélever la majeure partie du surnageant afin de concentrer les échantillons au maximum. L’astuce consiste à positionner le tube de centrifugation avec la charnière à l’extérieur dans un rotor à angle fixe de sorte que la pastille apparaisse du même côté de la charnière du tube. De plus, réduisez les tailles de pipettes (P1000, P200, P10) pour une précision accrue lors de l’élimination du surnageant afin de garder la pastille intacte.
7. Montez la lame dans un porte-échantillon fourni et utilisez de petits points de ruban adhésif en polyester pour fixer la lame pendant la mesure.

4. Imagerie OPTIR-FISH

REMARQUE : L’imagerie de fluorescence et l’imagerie OPTIR seront effectuées sur le système OPTIR.

1. Géométrie du système :
   1. Utilisez la contre-propagation de la pompe à infrarouge moyen et de la sonde visible, la détection arrière (epi) de la lumière visible avec ce protocole.
   2. Pour focaliser la lumière visible et collecter la lumière visible réfléchie et diffusée, utilisez un objectif aérien (50x 0,8NA). Pour focaliser la lumière infrarouge moyenne, utilisez un objectif Cassegrain (40x 0,78NA).
   3. Assurez-vous que le système est également équipé d’un module d’épifluorescence à champ large avec plusieurs jeux de filtres de fluorescence. Pour les fluorophores utilisés dans ce protocole, sélectionnez le jeu de filtres à protéines fluorescentes vertes (GFP) pour la détection Cy3 et le jeu de filtres Alexa Fluor 647 pour la détection Cy5.
2. Préparez-vous aux mesures :
   1. Mettez le système sous tension et ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument. Après l’initialisation, basculez les curseurs Contre-prop et Fluorescence sur la position Activé.
   2. Fixez l’objectif à 50x, puis effectuez l’arrière-plan automatique pour acquérir le spectre de puissance IR. Utilisez le spectre de puissance pour normaliser les spectres d’échantillons acquis ou normaliser les images OPTIR à différents numéros d’onde. Cela exclura l’effet des différences de puissance laser dans l’infrarouge moyen sur l’analyse et la quantification des données.
      REMARQUE : L’acquisition de spectres de puissance IR pour la normalisation est impérative pour l’analyse quantitative en aval, car l’intensité mesurée est linéairement liée à la puissance IR. Après avoir effectué l’arrière-plan automatique, le logiciel normalisera automatiquement les spectres OPTIR et les images OPTIR aux spectres de puissance IR pour les utilisateurs. La purge du système avec du N₂ peut minimiser l’influence de la vapeur d’eau et augmenter la reproductibilité entre les expériences.
3. Pour charger l’échantillon, utilisez le bouton Décharger pour déplacer l’étage d’échantillon. Utilisez un objectif à faible grossissement tel que 10x pour localiser la zone de l’échantillon et naviguer vers la région qui a la densité d’échantillon optimale. Focalisez l’échantillon en ajustant la hauteur de l’objectif dans le logiciel de contrôle. Changez la sélection de l’objectif à 50x.
4. Acquisition d’images
   REMARQUE : Les échantillons utilisés sont les suivants : i) E. coli (¹³C-glucose incubés) ; ii) E. coli (¹²C-glucose incubés) ; iii) B. thêta (¹²C-glucose incubés) ; iv) mélange d’E. coli (¹³C-glucose incubé) et de B. thêta (¹²C-glucose incubé).
   1. Images en fond clair (Figure 2D) : Faites la mise au point sur l’échantillon en regardant les images en fond clair.
   2. Images de fluorescence (Figure 2E) : modifiez le jeu de filtres en cliquant sur le bouton de nom du filtre (GFP pour Cy3 et Alexa Fluor 647 pour Cy5) pour détecter les fluorophores associés aux sondes FISH conçues et acquérir l’imagerie de fluorescence de manière séquentielle à l’aide du module de fluorescence du logiciel. Ajustez l’intensité lumineuse et le temps d’exposition pour obtenir un contraste de signal adéquat avant de blanchir les fluorophores.
      REMARQUE : Étant donné que la sonde utilisée dans les mesures OPTIR peut photoblanchir les fluorophores, acquérez toujours des images de fluorescence avant les images OPTIR. Pour toute question concernant l’effet des marqueurs fluorescents sur la détection d’OPTIR, se référer à un travail précédemment publié qui a démontré que FISH avec fluorophore Cy5 n’affecte pas la quantification suivante basée sur les images OPTIR, car Cy5 est de petite taille et peu abondant par rapport à la protéine bactérienne cible⁹.
   3. Images OPTIR (Figure 2F) :
      1. Déterminez la position normale du pic et du pic décalé vers le rouge induit par les isotopes. Dans le cas de la synthèse des protéines à partir du ¹³C-glucose, le pic normal de l’amide I est détecté à environ 1656 cm-1, et le pic décalé vers le rouge est à environ 1612 ^cm-1 (Figure 3A).
         REMARQUE : La position normale du pic dépend du composant biochimique et/ou du produit métabolique d’intérêt. La position décalée du pic dépend également de l’isotope utilisé pour le marquage. Ces deux nombres d’onde pourraient également être déterminés expérimentalement en mesurant les spectres complets de cellules non marquées et marquées au maximum (voir étape 4.5)
      2. Réglez la longueur d’onde de la pompe IR à 1656 ^cm-1 à l’aide du logiciel. Modifiez la puissance de la sonde et le gain du détecteur en conséquence pour éviter la saturation du signal DC (8 V). Ajustez la hauteur inférieure de l’objectif Cassegrain pour maximiser le signal AC.
         REMARQUE : La puissance IR typique au niveau de l’échantillon est d’environ 5 mW et la puissance de la sonde au niveau de l’échantillon est d’environ 3 à 15 mW, selon l’échantillon. La puissance de l’IR et de la sonde peut être ajustée à l’aide du logiciel de contrôle pour optimiser le niveau de puissance afin d’assurer un contraste d’image élevé tout en évitant d’endommager les cellules.
      3. Réglez les images OPTIR pour qu’elles contiennent 200 x 200 pixels et réglez la vitesse de balayage sur 100 μm/s. Réglez la taille du pas dans les directions X et Y sur 150 nm afin que la taille de l’image soit d’environ 30 x 30 μm².
      4. Acquérez l’image.
      5. Réglez la longueur d’onde de la pompe IR sur 1612 ^cm-1 et acquérez une image du même champ de vision à ce numéro d’onde.
      6. Pour chaque échantillon, imagez au moins trois champs de vision à des fins d’analyse statistique.
5. (Facultatif) Mesure spectrale : Après l’acquisition de l’image, si une caractéristique spatiale d’intérêt est localisée, effectuez la mesure spectrale.
   1. Sélectionner les emplacements : choisissez un seul point ou spécifiez un tableau de points à analyser dans le module Spectral du logiciel.
   2. Définissez le paramètre de balayage spectral. Sélectionnez la plage de couverture du numéro d’onde, la vitesse de balayage et l’espacement des données en fonction des besoins.
      REMARQUE : si la vitesse de balayage et l’espacement des données de sortie sont différents de ceux utilisés dans l’étape d’acquisition de l’arrière-plan (étape 4.2), un nouvel arrière-plan basé sur les paramètres de balayage spectral actuels est nécessaire pour une normalisation correcte.
   3. Réglez le nombre de co-moyenne et lancez la mesure spectrale. L’augmentation de la co-moyenne augmente également le rapport signal/bruit des spectres, mais nécessite des temps d’acquisition plus longs.
      REMARQUE : Si une fluctuation significative est observée pendant le co-étalage, cela peut indiquer une instabilité de l’échantillon induite par l’échauffement laser. Ce problème peut souvent être résolu en réduisant la puissance IR et/ou la puissance visible de la sonde.

5. Traitement et analyse des données au niveau de la cellule unique

1. Quantifier la synthèse métabolique à partir de substrats isotopiques (Figure 2G)
   REMARQUE : La quantification suivante de l’incorporation métabolique à partir de substrats isotopiques est basée sur des images OPTIR à deux numéros d’onde correspondant aux pics normaux et décalés des macromolécules cibles. Par rapport à une pile hyperspectrale complète, l’imagerie à deux numéros d’onde pourrait réduire considérablement le temps nécessaire pour chaque FOV et améliorer le débit tout en recapturant pleinement l’effet isotopique essentiel à la quantification du métabolisme.
   1. Soustraire l’image OPTIR du pic décalé de l’image OPTIR du pic normal pour générer une carte visuelle des activités de synthèse à partir des substrats isotopiques. À titre de démonstration (Figure 3C), pour E. coli cultivé avec ^{du 13}C-glucose, les pixels positifs dans l’image (1656 ^{cm-1-1612 cm-1}) indiquent une incorporation active du ¹³C dans les protéines, donc un niveau de synthèse protéique plus élevé.
      REMARQUE : La soustraction peut être effectuée à l’aide de la fonction ImageJ Image Calculator. Alternativement, la soustraction pourrait facilement être effectuée dans n’importe quel langage de programmation préféré pour le traitement par lots.
   2. Quantification de l’activité métabolique d’une cellule unique
      1. Obtenir les coefficients (représentés par h dans la figure 2G) à partir d’échantillons de référence non étiquetés et entièrement étiquetés. Comme le pic décalé vers le rouge induit par l’isotope chevaucherait partiellement le pic normal, les échantillons non marqués et marqués (nouvellement synthétisés à partir du substrat marqué isotopiquement) contribueront aux signaux OPTIR au niveau du pic normal et décalé. Quantifiez ces différentes contributions à l’aide de l’intensité normalisée du signal OPTIR au pic normal et décalé à partir d’échantillons de référence non étiquetés et entièrement étiquetés.
         REMARQUE : Pour les échantillons de référence, les échantillons de référence non étiquetés sont cultivés (ou incubés) sans aucun substrat marqué isotopiquement. Les échantillons de référence entièrement étiquetés sont généralement cultivés avec la plus forte concentration de substrat marqué isotopiquement avec le temps de culture le plus long.
      2. Pour l’analyse de cellules uniques, obtenez des masques de cellules uniques basés sur les images en fond clair.
         REMARQUE : Diverses techniques de traitement d’images pourraient être appliquées ici pour générer ce masque, y compris différentes méthodes de détection de particules comme l’analyse des gouttes et des méthodes de segmentation cellulaire comme le bassin versant.
      3. Mesurez l’intensité du signal OPTIR à partir de cellules individuelles. Appliquez le masque de cellule unique acquis aux deux images OPTIR (au pic normal et au pic décalé) et, pour chaque cellule unique, calculez la moyenne des valeurs de pixel dans la région du masque de cellule unique. La valeur moyenne des cellules individuelles sera utilisée pour la quantification.
      4. Pour chaque cellule, calculez la contribution relative des composants biologiques non étiquetés et marqués en fonction des coefficients de l’étape 5.1.2.1 et des signaux de l’étape 5.1.2.3.
         REMARQUE : Un rapport de remplacement isotopique est défini comme la contribution relative des composants biologiques marqués sur la somme des composants biologiques marqués et non marqués (Figure 2G). Ce rapport doit être compris entre 0 et 1. Le rapport de remplacement isotopique est linéairement proportionnel au rapport ^13-C-glucoseà ¹²C-glucose (avec une quantité totale fixe de glucose)⁹. Une sensibilité de détection élevée de 5 % de ¹³C-glucose a été démontrée pour les cellules E. coli .
2. Identifier les espèces bactériennes à partir d’images de fluorescence multicanaux (Figure 2H)
   1. Fusionnez les canaux de fluorescence multicolores pour créer un guidage visuel pour différentes espèces bactériennes à l’aide d’ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
   2. Pour l’analyse de cellules uniques, pour chaque canal de fluorescence, générez un ensemble de régions d’intérêt (ROI) pour des cellules individuelles.
      REMARQUE : Diverses techniques de traitement d’image peuvent être appliquées ici pour générer le masque, y compris différentes méthodes de seuillage automatique et méthodes de segmentation cellulaire.
3. Corréler les identités FISH et les activités métaboliques d’OPTIR (Figure 2I)
   1. Reliez directement les identités bactériennes au niveau de la cellule unique à partir des images de fluorescence FISH aux activités métaboliques des images OPTIR en corrélant les positions des ROI.
   2. Effectuer des analyses statistiques pour comparer les activités métaboliques de différentes espèces.
      REMARQUE : Les masques sont générés séparément à partir des images de fluorescence et des images OPTIR, car les activités métaboliques pourraient être analysées pour toutes les cellules à partir des images OPTIR, tandis que les cellules inconnues n’apparaîtraient sur aucun des canaux de fluorescence. Cela garantit que toutes les cellules pourraient être incluses dans l’analyse métabolique. S’il y a un grand nombre de cellules non identifiées, il peut être nécessaire d’envisager différentes sondes FISH ciblant l’ARNr de différents taxons d’intérêt.

Résultats

Le flux de travail général pour l’analyse métabolique microbienne unicellulaire avec identification génétique par OPTIR-FISH est résumé dans Graphique 2. Les résultats représentatifs démontrant la capacité d’imagerie métabolique unicellulaire d’OPTIR sont présentés dans Graphique 3. Cet exemple a utilisé des cellules E. coli incubées avec ¹²C- ou ¹³C-glucose pendant 24 h. L’incorpora...

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole détaillé pour l’application de la plateforme OPTIR-FISH pour l’identification simultanée des espèces microbiennes et la quantification des activités métaboliques à la résolution de la cellule unique. Les étapes critiques comprennent la culture avec marquage d’isotopes stables pour l’étude d’activités métaboliques spécifiques et l’hybridation in situ en fluorescence pour identifier les espèces microbiennes cibles. L?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G