Оптическая фототермическая инфракрасно-флуоресцентная гибридизация in situ (OPTIR-FISH)

Резюме

В данной работе мы представляем протокол с использованием оптической фототермической инфракрасной флуоресцентной гибридизации in situ (OPTIR-FISH), также известной как фототермическая FISH В СРЕДНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ (MIP-FISH), для идентификации отдельных клеток и понимания их метаболизма. Эта методология может быть широко применена для различных приложений, включая картирование клеточного метаболизма с разрешением для одной клетки.

Аннотация

Понимание метаболической активности отдельных клеток в сложных сообществах имеет решающее значение для разгадки их роли в заболеваниях человека. В этой статье мы представляем комплексный протокол для одновременной идентификации клеток и метаболического анализа с помощью платформы OPTIR-FISH путем объединения зондов FISH, меченных рРНК, и субстратов, меченных изотопами. Флуоресцентная визуализация обеспечивает идентификацию клеток по специфическому связыванию зондов FISH, меченных рРНК, в то время как визуализация OPTIR обеспечивает метаболическую активность в отдельных клетках за счет изотопного красного смещения в спектрах OPTIR. Используя бактерии, культивируемые с ¹³С-глюкозой в качестве испытательного стенда, протокол описывает микробную культуру с изотопным мечением, флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), пробоподготовкой, оптимизацией установки визуализации OPTIR-FISH и сбором данных. Мы также демонстрируем, как выполнять анализ изображений и интерпретировать спектральные данные на уровне отдельных ячеек с высокой пропускной способностью. Стандартизированный и подробный характер этого протокола значительно облегчит его принятие исследователями из различных областей и дисциплин в рамках широкого сообщества исследователей метаболизма одиночных клеток.

Введение

Клеточный метаболизм является основополагающим столпом клеточной биологии, управляя многими процессами, определяющими здоровье, функционирование и взаимодействие клеток с окружающей средой. Анализ метаболизма на уровне отдельных клеток, особенно в естественной среде, дает бесценную информацию для выявления гетерогенных и сложных активностей в^{биологических системах.} Это особенно важно при изучении микроорганизмов, так как многие микробы проявляют уникальные требования к росту или зависимости от окружающей среды, которые бросают вызов^{традиционным методам} выращивания. Например, некоторые ви....

протокол

Использование образцов бактерий в данном исследовании осуществляется в соответствии с рекомендациями Институционального наблюдательного совета (IRB) Бостонского университета и Национального института здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс, используемый в этом протоколе, кратко представлен на рисунке 2.

1. Бактериальная культура и мечение изотопов (рисунок 2A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный здесь пример предназначен для маркировки чистой бактериальной культу....

Результаты

Общий рабочий процесс микробного метаболического анализа одиночных клеток с генетической идентификацией с помощью OPTIR-FISH обобщен в Рисунок 2. Репрезентативные результаты, демонстрирующие возможности OPTIR по метаболической визуализации отдельных кле?.......

Обсуждение

В данной работе мы подробно описали протокол применения платформы OPTIR-FISH для одновременной идентификации микробных видов и количественной оценки метаболической активности при разрешении одной клетки. Важнейшие этапы включают культивирование со стабильными изотоп?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G