Оптическая фототермическая инфракрасно-флуоресцентная гибридизация in situ (OPTIR-FISH)

Резюме

В данной работе мы представляем протокол с использованием оптической фототермической инфракрасной флуоресцентной гибридизации in situ (OPTIR-FISH), также известной как фототермическая FISH В СРЕДНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ (MIP-FISH), для идентификации отдельных клеток и понимания их метаболизма. Эта методология может быть широко применена для различных приложений, включая картирование клеточного метаболизма с разрешением для одной клетки.

Аннотация

Понимание метаболической активности отдельных клеток в сложных сообществах имеет решающее значение для разгадки их роли в заболеваниях человека. В этой статье мы представляем комплексный протокол для одновременной идентификации клеток и метаболического анализа с помощью платформы OPTIR-FISH путем объединения зондов FISH, меченных рРНК, и субстратов, меченных изотопами. Флуоресцентная визуализация обеспечивает идентификацию клеток по специфическому связыванию зондов FISH, меченных рРНК, в то время как визуализация OPTIR обеспечивает метаболическую активность в отдельных клетках за счет изотопного красного смещения в спектрах OPTIR. Используя бактерии, культивируемые с ¹³С-глюкозой в качестве испытательного стенда, протокол описывает микробную культуру с изотопным мечением, флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), пробоподготовкой, оптимизацией установки визуализации OPTIR-FISH и сбором данных. Мы также демонстрируем, как выполнять анализ изображений и интерпретировать спектральные данные на уровне отдельных ячеек с высокой пропускной способностью. Стандартизированный и подробный характер этого протокола значительно облегчит его принятие исследователями из различных областей и дисциплин в рамках широкого сообщества исследователей метаболизма одиночных клеток.

Введение

Клеточный метаболизм является основополагающим столпом клеточной биологии, управляя многими процессами, определяющими здоровье, функционирование и взаимодействие клеток с окружающей средой. Анализ метаболизма на уровне отдельных клеток, особенно в естественной среде, дает бесценную информацию для выявления гетерогенных и сложных активностей в^{биологических системах.} Это особенно важно при изучении микроорганизмов, так как многие микробы проявляют уникальные требования к росту или зависимости от окружающей среды, которые бросают вызов^{традиционным методам} выращивания. Например, некоторые виды могут нуждаться в определенном составе питательных веществ или симбиотических отношениях, которые нелегко воспроизвести в лабораторных условиях, что делает их непригодными для культивирования с помощью^{стандартных методов.} Кроме того, длительные периоды, необходимые для выращивания определенных видов, создают значительные проблемы для микробиологических исследований, часто выходящие за рамки практических временных рамок для изучения и анализа. Чтобы обойти эти ограничения, альтернативные методы, такие как полимеразная цепная реакция и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), позволяют идентифицировать виды микроорганизмов без необходимости культивирования4^, что позволяет получить более точное и целостное представление о микробных экосистемах. Однако эти аналитические технологии не способны пролить свет на клеточный метаболизм. Этот пробел подчеркивает текущие проблемы в области микробиологии: параллельную задачу дифференциации клеточной идентичности и выяснения метаболизма на уровне отдельных клеток. Достижения в таких методах, как масс-спектрометрия визуализации (IMS) в сочетании со стабильными изотопами, стали мощными инструментами для метаболического анализа отдельных клеток^. В этих экспериментах клетки инкубировали с субстратами, содержащими изотопы, такие как ¹³C или ¹⁵N. Недавно анаболизированные биомолекулы переносят эти изотопы, что делает их различимыми в m/z спектрах. Тем не менее, IMS страдает от дорогостоящих приборов, сложной подготовки образцов, относительно низкой производительности и опыта, необходимого для анализа m/z спектров. В сочетании с флуоресцентной визуализацией, специфичной для молекулярных маркеров, были достигнуты успехи в выяснении клеточного метаболизма с повышенной специфичностью⁶. Тем не менее, сохраняются проблемы на пути к объединению этих двух модальностей. Разница в разрешении между IMS и флуоресцентной визуализацией в сочетании с различными операционными настройками затрудняет согласование и корреляцию результатов⁷.

Интеграция вибрационной спектроскопической визуализации с мечением стабильных изотопов предлагает новое решение для изучения метаболизма одиночных клеток. Включение более тяжелых изотопов замедляет вибрацию химических связей, что приводит к появлению пиков в колебательных спектрах с красным смещением⁸. Примечательно, что вибрационная визуализация обеспечивает пространственное разрешение, сравнимое с флуоресцентной визуализацией, а как метаболическое количественное определение, так и идентификация клеток могут быть выполнены в одной установке, что упрощает регистрацию и корреляцию изображений. Наша недавняя работа продемонстрировала комбинацию усовершенствованной платформы вибрационной визуализации: оптического фототермического инфракрасного излучения (OPTIR) с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) для исследования метаболизма глюкозы в бактериальных сообществах⁹ (Рисунок 1). OPTIR — это система вибрационной спектроскопической микроскопии, которая использует фототермический эффект поглощения в среднем ИК-диапазоне путем обнаружения изменения видимого света, что обеспечивает субмикронное разрешение, как в оптической микроскопии, но с дополнительной вибрационной спектроскопической информацией, поступающей от поглощения в среднем ИК-диапазоне. FISH является широко используемым методом для определения идентичности микроорганизмов на уровне отдельных клеток. Последовательность олигонуклеотидов может быть сконструирована таким образом, чтобы нацеливаться на конкретные последовательности 16S различных таксонов, и к ней могут быть прикреплены различные флуорофоры. Специфическая гибридизация разработанных олигонуклеотидных зондов с целевой рРНК приводит к сильным флуоресцентным сигналам целевых видов в отдельных клетках, и многоканальная флуоресцентная визуализация может быть выполнена для идентификации нескольких видов в популяции. Поскольку и OPTIR, и флуоресцентная визуализация основаны на оптическом детектировании, сочетание флуоресценции OPTIR и FISH является простым в реализации. Эти два метода имеют одинаковое оптическое разрешение для анализа одиночных клеток и могут быть удобно переключаемы без необходимости дополнительной юстировки или совместной регистрации.

Этот протокол представляет собой подробное руководство по использованию платформы OPTIR-FISH для расширенного анализа структуры и функции одной клетки. В качестве испытательного стенда мы использовали образцы бактерий, выращенных в ¹³С-глюкозосодержащих средах, и количественно оценили синтез белка de novo из ¹³С-глюкозы. Чтобы продемонстрировать способность платформы идентифицировать клетки, мы использовали бактериальные смеси, в которых каждый вид был помечен с помощью зондов FISH, нацеленных на рРНК. Этот подход способствовал точной идентификации отдельных клеток специфических бактериальных штаммов, таких как Escherichia coli (E. coli) и Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), и их метаболизма. Этот протокол предлагает исследователям мощный инструмент для одновременного метаболического профилирования и идентификации видов на уровне отдельных клеток, обещая улучшить наше понимание клеточных взаимодействий, физиологии и их роли в сложных средах.

протокол

Использование образцов бактерий в данном исследовании осуществляется в соответствии с рекомендациями Институционального наблюдательного совета (IRB) Бостонского университета и Национального института здравоохранения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс, используемый в этом протоколе, кратко представлен на рисунке 2.

1. Бактериальная культура и мечение изотопов (рисунок 2A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный здесь пример предназначен для маркировки чистой бактериальной культуры. При применении данного протокола к полимикробным сообществам среда и время мечения должны быть скорректированы в соответствии с сообществом и физиологией интересующих организмов.

1. Инокулируйте интересующий штамм бактерий из одной колонии и предварительной культуры в богатую питательными веществами среду, такую как триптический соевый бульон (TSB) или бульон Лурии-Бертани (LB), в течение 3 часов, чтобы достичь фазы экспоненциального роста (log). Кишечная палочка BW25113 используется в качестве примера штамма в этом протоколе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время достижения фазы логарифма будет варьироваться в зависимости от используемого штамма. Это время нужно адаптировать для каждого штамма.
2. Измерьте оптическую плотность на длине волны 600 нм, чтобы оценить концентрацию бактерий.
3. Приготовьте минимальную питательную среду с изотопно мечеными субстратами. Для E . coli BW25113 добавляйте в среду M9 minimal ¹³C-глюкозу в конечной концентрации 0,2% (w/v).
   Примечание: Используемая 13-С-глюкоза (D-глюкоза ^U-13_С-6, 99%) была универсально маркирована, где все атомы углерода были заменены на ¹³атомов С. Выбор минимальной питательной среды будет зависеть от штамма бактерий. Выбор изотопного субстрата будет зависеть от конкретного интересующего метаболического процесса. Общая цель состоит в том, чтобы изотопный субстрат служил основным источником питания по сравнению с их немечеными аналогами.
4. Разведите бактерии в минимальной питательной среде, содержащей изотопно меченный субстрат, до конечной концентрации 5 × 10⁵ КОЕ/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется высокий коэффициент разбавления, например, 1:100, и немаркированное питательное вещество из богатой среды становится незначительным. В качестве альтернативы, чтобы обеспечить полное удаление богатой питательными веществами среды, можно провести промывку 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) путем центрифугирования при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C и ресуспендирования в PBS с последующим вторым центрифугированием и окончательной ресуспендированием в минимальной питательной среде.
5. Выращивайте образцы бактерий в орбитальном встряхивающем инкубаторе в оптимальных условиях роста. Как правило, установите орбитальный встряхивающий инкубатор на скорость 220 об/мин и температуру 37 °C, а для аэробной инкубации поместите пробирки для культивирования под наклоном со свободной крышкой. Для E. coli 24 ч аэробной инкубации при 37 °C обычно достаточно для достижения максимальной маркировки ^{в 13}°C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от интересующего метаболического процесса. Более длительное время инкубации обычно приводит к более высокому изотопному мечению. Измерение кривой роста в тех же условиях с немаркированным субстратом может дать представление об определении подходящих временных точек сбора.
6. Соберите бактериальные клетки в желаемые моменты времени путем центрифугирования при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
7. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в равном объеме 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Зафиксируйте ячейки в растворе PFA на 10 мин при комнатной температуре (RT) или на 2 ч при 4 °C. Для длительного хранения клетки дважды промыть PBS, повторно суспендировать клетки в 1 мл 50% (v/v) PBS и 96% этанола и хранить при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

2. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) (Рисунок 2B)

1. Гибридизовать клетки E. coli с олигонуклеотидным зондом Gam42a¹⁰ , меченным флуорофором цианина5 (Cy5) (Gam42a-Cy5), и клетки B. theta с олигонуклеотидным зондом Bac303¹¹ , меченным флуорофором цианина3 (Cy303-Cy3), следуя стандартному протоколу FISH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Основы рРНК-FISH для идентификации: Молекулы рРНК являются идеальными мишенями для FISH, поскольку они повсеместно распространяются и естественным образом амплифицируются в микробных клетках. рРНК также содержит как консервативные, так и вариабельные участки последовательности, так что филогенетическая глубина целевой группы может быть определена по степени сохранения олигонуклеотидного зонда. При специфическом связывании разработанного зонда с целевой последовательностью, меченый флуорофор показывает флуоресцентные сигналы для отдельных клеток.
2. Обратитесь к ранее опубликованной литературе 12,13,14 для получения подробного протокола флуоресцентной гибридизации in situ. Приведенные ниже шаги кратко описывают стандартный протокол для микробных клеток.
   1. Обезвоживание:
      1. Центрифугируйте неподвижные элементы (100 μл) при 14 000 x g в течение 10 минут до гранулирования, ресуспендируйте в 100 μл 96% этанола аналитического качества и инкубируйте в течение 1 минуты при RT.
      2. Затем снова центрифугируйте ячейки при давлении 14 000 x g в течение 5 минут, удалите этанол и дайте грануле клетки высохнуть на воздухе.
   2. Гибридизация: Гибридизируйте клетки в растворе (100 мкл) в течение 3 ч при 46 °C.
      Буфер для гибридизации состоит из 900 мМ NaCl, 20 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометана HCl, 1 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты, 0,01% додецилсульфата натрия, 100 нг соответствующего флуоресцентно меченного олигонуклеотида и необходимой концентрации формамида для получения строгих условий.
   3. Центрифуга: Сразу после гибридизации поместите образцы в центрифугу с ротором, предварительно нагретым до 46 °C, и центрифугуйте при 14 000 x g в течение 15 минут при максимально допустимой температуре (обычно 40 °C).
   4. Стирать и хранить:
      1. Промойте образцы в буфере подходящей жесткости в течение 15 минут при температуре 48 °C. Затем центрифугируйте ячейки при давлении 14 000 x g в течение 15 мин при максимально допустимой температуре в центрифуге с ротором, предварительно нагретым до 46 °C.
      2. Наконец, промойте ячейки 500 μL ледяного PBS, повторно суспендируйте их в 20 μL 1x PBS и храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Специфическое связывание зонда обеспечивается правильной строгостью гибридизации. Высокая жесткость может быть достигнута за счет повышения температуры гибридизации, снижения концентрации соли или добавления денатурантного формамида. Формамид интерферирует с водородными связями, которые стабилизируют дуплексы нуклеиновых кислот. При этом температура и концентрация соли не изменяются при гибридизации при настройке концентрации формамида. Оптимальная концентрация формамида для новых зондов определена экспериментально с помощью кривых диссоциации формамида¹⁰. Требуемую концентрацию формамида для опубликованных зондов можно найти в ProbeBase¹⁵ или с помощью поиска в литературе. В качестве альтернативы, прогнозируемые концентрации формамида могут быть получены с помощью анализа in silico с использованием mathFISH¹⁶. На этапе стирки немного более высокая температура приводит к несколько более строгим условиям, что приводит к более высокой специфичности связывания.

3. Подготовка образца (Рисунок 2C)

1. Очистка и нанесение покрытий на горки:
   1. Используйте стандартизированные предметные стекла CaF₂ (диаметром 10 мм и толщиной 350 мкм для совместимости с держателем образца прибора). Погрузите CaF₂ в 70% этанол на 15 минут и дважды промойте деионизированной водой.
   2. Очищенные предметные стекла перевести в 0,1% раствор поли-L-лизина и инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте предметные стекла один раз деионизированной водой и высушите на воздухе.
2. Размораживание подготовленных образцов клеток в режиме лучевой терапии в защищенном от света месте.
3. Чтобы избежать чрезмерного количества кристаллов соли из PBS во время сушки образца, выполните шаги 3.3.1-3.3.2.
   1. Дважды промойте ячейки деионизированной водой (DI). Центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
   2. Добавьте обратно исходный объем воды DI и осторожно перемешайте. Повторите центрифугирование и снова добавьте жидкость для промывки водой DI.
4. (Дополнительный) Для образцов смеси переведите одинаковый объем из каждого образца и смешайте в одной центрифужной пробирке.
5. Сконцентрируйте образцы бактериальных клеток путем центрифугирования при давлении 14 000 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
6. Аккуратно перемешайте оставшийся раствор в течение ~30 с и добавьте 1-2 мкл раствора на подготовленное предметное стекло CaF₂ . Высушите образец на воздухе в течение 30 минут в защищенном от света месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После сушки на предметном стекле должна появиться небольшая круглая точка. Из-за эффекта «кофейного кольца» края точки будут иметь более высокую плотность бактериальных клеток. Этот этап центрифуги заключается в достижении соответствующей плотности для эффективной бактериальной визуализации одиночных клеток. Идеальная концентрация должна приводить к образованию однородного и плотного слоя отдельных бактериальных клеток под микроскопом. Если есть прозрачная гранула, которую можно увидеть невооруженным глазом после центрифуги, удалите надосадочную жидкость так, чтобы после вихря раствор выглядел почти прозрачным. На контрольном образце можно провести быстрый тест для оценки объема удаления надосадочной жидкости. Массив капель с различным количеством остаточной надосадочной жидкости может быть нанесен на предметное стекло микроскопа для изучения оптимального объема разбавления под светлопольным микроскопом. Если после центрифугирования не остается видимых гранул, удалите большую часть надосадочной жидкости, чтобы сконцентрировать образцы в наибольшей степени. Хитрость заключается в том, чтобы расположить центрифужную трубку с шарниром снаружи в роторе с фиксированным углом наклона таким образом, чтобы гранула оказалась на той же стороне шарнира пробирки. Кроме того, уменьшите размеры пипеток (P1000, P200, P10) для повышения точности во время удаления надосадочной жидкости, чтобы сохранить гранулу в целости.
7. Установите предметное стекло в прилагаемый держатель для образцов и используйте небольшие точки полиэфирной ленты для фиксации предметного стекла во время измерения.

4. Визуализация OPTIR-FISH

ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная визуализация и визуализация OPTIR будут выполняться на системе OPIL.

1. Геометрия системы:
   1. Используйте встречное распространение накачки в среднем ИК-диапазоне и видимого зонда, обратное (эпи) обнаружение видимого света с этим протоколом.
   2. Чтобы сфокусировать видимый свет и собрать обратно отраженный и рассеянный видимый свет, используйте воздушный объектив (50x 0,8 NA). Чтобы сфокусировать свет в среднем ИК-диапазоне, используйте объектив Кассегрена (40x 0,78 НА).
   3. Убедитесь, что система также оснащена широкопольным эпифлуоресцентным модулем с несколькими наборами флуоресцентных фильтров. Для флуорофоров, используемых в этом протоколе, выберите набор фильтров зеленого флуоресцентного белка (GFP) для обнаружения Cy3 и набор фильтров Alexa Fluor 647 для обнаружения Cy5.
2. Подготовьтесь к измерениям:
   1. Включите систему и откройте программное обеспечение для управления прибором. После инициализации переключите ползунок Counterprop and Fluorescence в положение вкл.
   2. Установите целевое значение 50x, а затем выполните автоматический фоновый режим , чтобы получить спектр мощности ИК. Используйте спектр мощности для нормализации полученных спектров выборки или нормализации изображений OPTIR с различными волновыми числами. Это исключит влияние разницы в мощности лазера в среднем ИК-диапазоне на анализ и количественное определение данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение спектров ИК-мощности для нормализации является обязательным условием для последующего количественного анализа, поскольку измеряемая интенсивность линейно связана с мощностью ИК-излучения. После выполнения функции автоматического фона программное обеспечение автоматически нормализует спектры OPTIR и изображения OPTIR в соответствии со спектрами мощности ИК-диапазона для пользователей. Продувка системы с помощью N₂ может свести к минимуму влияние водяного пара и повысить воспроизводимость между экспериментами.
3. Чтобы загрузить образец, используйте кнопку «Выгрузить », чтобы переместить предметный столик образца. Используйте объектив с малым увеличением, например 10-кратный, чтобы найти область образца и перейти к области с оптимальной плотностью образца. Сфокусируйте образец, отрегулировав высоту объектива в управляющем программном обеспечении. Измените выбор цели на 50x.
4. Получение изображений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые образцы: i) кишечная палочка (¹³С-глюкоза инкубирована); ii) кишечная палочка (¹²С-глюкоза в инкубации); iii) B. theta (¹²С-глюкоза в инкубации); iv) смесь E. coli (¹³С-глюкозы в инкубации) и B. theta (¹²С-глюкозы в инкубации).
   1. Изображения в светлом поле (Рисунок 2D): Сфокусируйте образец, посмотрев на изображения в светлом поле.
   2. Флуоресцентные изображения (Рисунок 2E): Измените набор фильтров, нажав кнопку с названием фильтра (GFP для Cy3 и Alexa Fluor 647 для Cy5), чтобы обнаружить флуорофоры, связанные с разработанными зондами FISH, и последовательно получить флуоресцентную визуализацию с помощью модуля флуоресценции в программном обеспечении. Отрегулируйте интенсивность света и время экспозиции, чтобы получить достаточный контраст сигнала, прежде чем отбеливать флуорофоры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку зонд, используемый при измерениях OPTIR, может фотоотбеливать флуорофоры, всегда получайте флуоресцентные изображения до получения изображений OPTIR. Для беспокойства по поводу влияния флуоресцентных маркеров на обнаружение OPTIR обратитесь к ранее опубликованной работе, которая продемонстрировала, что FISH с флуорофором Cy5 не влияет на последующее количественное определение на основе изображений OPTIR, поскольку Cy5 имеет небольшой размер и низкую распространенность по сравнению с целевым бактериальным белком⁹.
   3. Изображения OPTIR (Рисунок 2F):
      1. Определите нормальный пик и положение пика с красным смещением, вызванное изотопами. В случае синтеза белка из ¹³С-глюкозы нормальный пик амида I обнаруживается на отметке около 1656 см-1, а пик с красным смещением находится на отметке около 1612 ^см-1 (рис. 3А).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальное положение пика зависит от биохимического компонента и/или продукта метаболизма, который представляет интерес. Смещенное положение пика также зависит от того, какой изотоп используется для мечения. Эти два волновых числа также могут быть экспериментально определены путем измерения полных спектров немеченых и максимально меченых ячеек (см. шаг 4.5)
      2. Настройте длину волны ИК-накачки на 1656 ^см-1 с помощью программного обеспечения. Измените мощность пробника и коэффициент усиления детектора соответствующим образом, чтобы избежать насыщения сигнала постоянного тока (8 В). Точно отрегулируйте нижнюю высоту объектива Кассегрена, чтобы максимизировать сигнал переменного тока.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная мощность ИК-излучения на образце составляет около 5 мВт, а мощность зонда на образце составляет около 3-15 мВт, в зависимости от образца. Мощность ИК-излучения и датчика можно регулировать с помощью управляющего программного обеспечения для оптимизации уровня мощности для обеспечения высокой контрастности изображения при отсутствии повреждения ячеек.
      3. Установите OPTIR изображения размером 200 x 200 пикселей и установите скорость сканирования равной 100 мкм/с. Установите размер шага в направлениях X и Y на 150 нм, чтобы размер изображения составлял около 30 x 30^мкм2.
      4. Получите изображение.
      5. Настройте длину волны ИК-накачки на 1612 ^см-1 и получите изображение из того же поля зрения на этом волновом числе.
      6. Для каждого образца необходимо отобразить не менее трех полей зрения для статистического анализа.
5. (Дополнительный) Спектральное измерение: Если после получения изображения обнаружен интересующий пространственный объект, выполните спектральное измерение.
   1. Выбор местоположений: Выберите одну точку или укажите массив точек для анализа в модуле Spectral программного обеспечения.
   2. Установите параметр спектрального сканирования. Выберите диапазон охвата волновых чисел, скорость сканирования и расстояние между выходными данными в зависимости от требований.
      ПРИМЕЧАНИЕ: если скорость сканирования и расстояние между выходными данными отличаются от тех, которые использовались на этапе сбора данных (шаг 4.2), для правильной нормализации требуется новый фон на основе текущих параметров спектрального сканирования.
   3. Установите число совместного усреднения и начните спектральное измерение. Увеличение совместного усреднения также увеличивает соотношение сигнал/шум спектров, но требует более длительного времени регистрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время совместного усреднения наблюдаются значительные колебания, это может указывать на нестабильность образца, вызванную лазерным нагревом. Эту проблему часто можно решить, уменьшив мощность ИК-излучения и/или уменьшив видимую мощность пробника.

5. Обработка и анализ данных на уровне одной ячейки

1. Количественная оценка метаболического синтеза из изотопных субстратов (рисунок 2G)
   Примечание: Последующая количественная оценка метаболического включения из изотопных субстратов основана на двухволновых изображениях OPTIR, соответствующих нормальным и смещенным пикам целевых макромолекул. По сравнению с полным гиперспектральным стеком, двухволновая визуализация может значительно сократить время, необходимое для каждого поля зрения, и повысить производительность при полном захвате изотопного эффекта, критического для количественной оценки метаболизма.
   1. Вычитание смещенного пикового изображения OPTIR из обычного пикового изображения OPTIR создает визуальную карту активности синтеза изотопных субстратов. В качестве демонстрации (рис. 3C), для E. coli, культивированной с ¹³C-глюкозой, положительные пиксели на изображении (1656 cm-1-1612 ^cm-1) указывают на активное включение ¹³C в белки, следовательно, на более высокий уровень синтеза белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вычитание может быть выполнено с помощью функции ImageJ Image Calculator. В качестве альтернативы, вычитание может быть легко выполнено на любом предпочитаемом языке программирования для пакетной обработки.
   2. Количественная оценка метаболической активности отдельных клеток
      1. Получите коэффициенты (представленные как h на рисунке 2G) из неразмеченных и полностью размеченных эталонных образцов. Поскольку индуцированный изотопами пик с красным смещением будет частично перекрываться с нормальным пиком, как немеченные, так и меченые (вновь синтезированные из изотопно меченого субстрата) образцы будут вносить свой вклад в сигналы OPTIR на нормальном и смещенном пике. Количественно оцените эти различные вклады с помощью нормализованной интенсивности сигнала OPTIR на нормальном и смещенном пике из неразмеченных и полностью размеченных эталонных образцов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для эталонных образцов немеченые эталонные образцы выращиваются (или инкубируются) без какой-либо изотопно меченной субстрата. Полностью меченые эталонные образцы обычно выращиваются с самой высокой концентрацией изотопно меченного субстрата с самым длительным временем выращивания.
      2. Для анализа отдельных клеток получите маски для отдельных клеток на основе изображений в светлом поле.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания этой маски здесь могут быть применены различные методы обработки изображений, включая различные методы обнаружения частиц, такие как анализ блобов, и методы сегментации клеток, такие как водораздел.
      3. Измерьте интенсивность сигнала OPTIR от отдельных ячеек. Примените полученную одноклеточную маску к двум изображениям OPTIR (на нормальном пике и смещенном пике) и для каждой отдельной ячейки усредните значения пикселей в области маски одной клетки. Усредненное значение из отдельных ячеек будет использоваться для количественной оценки.
      4. Для каждой клетки рассчитайте относительный вклад немеченных и меченых биокомпонентов на основе коэффициентов из шага 5.1.2.1 и сигналов из шага 5.1.2.3.
         Примечание: Коэффициент изотопного замещения определяется как относительный вклад меченых биокомпонентов в сумму как меченых, так и немеченых биокомпонентов (рисунок 2G). Это соотношение должно находиться в диапазоне от 0 до 1. Коэффициент изотопного замещения линейно пропорционален соотношению ¹³С-глюкозы к ¹²С-глюкозе (при фиксированном общем количестве глюкозы)⁹. Высокая чувствительность обнаружения 5% ¹³С-глюкозы была продемонстрирована для клеток E. coli .
2. Идентификация видов бактерий по многоканальным флуоресцентным изображениям (Рисунок 2H)
   1. Объедините многоцветные флуоресцентные каналы для создания визуального руководства для различных видов бактерий с помощью ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
   2. Для анализа отдельных клеток для каждого флуоресцентного канала сгенерируйте набор областей интереса (ROI) для отдельных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь могут быть применены различные методы обработки изображений для создания маски, включая различные методы автоматического порогирования и методы сегментации ячеек.
3. Корреляция идентичности FISH и метаболической активности OPTIR (Рисунок 2I)
   1. Свяжите идентичность бактерий на уровне отдельных клеток из флуоресцентных изображений FISH непосредственно с метаболической активностью из изображений OPTIR путем корреляции положений ROI.
   2. Выполняйте статистический анализ для сравнения метаболической активности различных видов.
      Примечание: Маски генерируются отдельно от флуоресцентных изображений и изображений OPIR, потому что метаболическая активность всех клеток может быть проанализирована по изображениям OPTIR, в то время как неизвестные клетки не будут отображаться ни в одном из флуоресцентных каналов. Это гарантирует, что все клетки могут быть включены в метаболический анализ. При наличии большого количества неидентифицированных клеток может потребоваться рассмотрение различных зондов FISH, нацеленных на рРНК различных таксонов, представляющих интерес.

Результаты

Общий рабочий процесс микробного метаболического анализа одиночных клеток с генетической идентификацией с помощью OPTIR-FISH обобщен в Рисунок 2. Репрезентативные результаты, демонстрирующие возможности OPTIR по метаболической визуализации отдельных кле?...

Обсуждение

В данной работе мы подробно описали протокол применения платформы OPTIR-FISH для одновременной идентификации микробных видов и количественной оценки метаболической активности при разрешении одной клетки. Важнейшие этапы включают культивирование со стабильными изотоп?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G