Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza la hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH), también conocida como FOL fototérmico de infrarrojo medio (MIP-FISH), para identificar células individuales y comprender su metabolismo. Esta metodología se puede aplicar ampliamente para diversas aplicaciones, incluido el mapeo del metabolismo celular con resolución de una sola célula.

Resumen

Comprender las actividades metabólicas de las células individuales dentro de comunidades complejas es fundamental para desentrañar su papel en las enfermedades humanas. Aquí, presentamos un protocolo completo para la identificación celular simultánea y el análisis metabólico con la plataforma OPTIR-FISH mediante la combinación de sondas FISH marcadas con ARNr y sustratos marcados con isótopos. Las imágenes de fluorescencia proporcionan la identificación celular mediante la unión específica de sondas FISH marcadas con ARNr, mientras que las imágenes OPTIR proporcionan actividades metabólicas dentro de células individuales mediante el desplazamiento al rojo inducido por isótopos en los espectros OPTIR. Utilizando bacterias cultivadas con ¹³C-glucosa como banco de pruebas, el protocolo describe el cultivo microbiano con marcaje isotópico, hibridación fluorescente in situ (FISH), preparación de muestras, optimización de la configuración de imágenes OPTIR-FISH y adquisición de datos. También demostramos cómo realizar análisis de imágenes e interpretar datos espectrales a nivel de una sola celda con un alto rendimiento. La naturaleza estandarizada y detallada de este protocolo facilitará en gran medida su adopción por parte de investigadores de diversos orígenes y disciplinas dentro de la amplia comunidad de investigación del metabolismo de una sola célula.

Introducción

El metabolismo celular es un pilar fundamental en la biología celular, ya que dirige muchos procesos que determinan la salud, la función y la interacción de las células con el medio ambiente. El análisis del metabolismo a nivel de célula individual, particularmente dentro de los entornos nativos, proporciona información invaluable para revelar las actividades heterogéneas y complejas en^{los sistemas} biológicos. Esto es especialmente crucial en el estudio de los microorganismos, ya que muchos microbios exhiben requisitos de crecimiento únicos o dependencias ambientales que desafían^{los métodos de....}

Protocolo

El uso de muestras bacterianas en este estudio está de acuerdo con las directrices de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Boston y el Instituto Nacional de Salud.

NOTA: El flujo de trabajo general seguido en este protocolo se resume en la Figura 2.

1. Cultivo bacteriano y marcaje de isótopos (Figura 2A)

NOTA: El ejemplo que se da aquí es para etiquetar un cultivo bacteriano puro. Si se aplica este protocolo a comunidades polimicrobianas....

Discusión

Aquí, describimos un protocolo detallado para la aplicación de la plataforma OPTIR-FISH para la identificación simultánea de especies microbianas y la cuantificación de actividades metabólicas a la resolución de una sola célula. Los pasos críticos incluyen el cultivo con marcaje de isótopos estables para estudiar actividades metabólicas específicas y la hibridación fluorescente in situ para identificar especies microbianas objetivo. Las imágenes de fluorescencia mu.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G