Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo usando hibridização in situ de fluorescência infravermelha óptica (OPTIR-FISH), também conhecida como FISH fototérmica de infravermelho médio (MIP-FISH), para identificar células individuais e entender seu metabolismo. Essa metodologia pode ser amplamente aplicada para diversas aplicações, incluindo o mapeamento do metabolismo celular com resolução de célula única.

Resumo

Compreender as atividades metabólicas de células individuais dentro de comunidades complexas é fundamental para desvendar seu papel na doença humana. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para identificação celular simultânea e análise metabólica com a plataforma OPTIR-FISH, combinando sondas FISH marcadas com rRNA e substratos marcados com isótopos. A imagem de fluorescência fornece a identificação celular pela ligação específica de sondas FISH marcadas com rRNA, enquanto a imagem OPTIR fornece atividades metabólicas dentro de células individuais por desvio para o vermelho induzido por isótopos nos espectros OPTIR. Usando bactérias cultivadas com ¹³C-glicose como banco de testes, o protocolo descreve a cultura microbiana com marcação isotópica, hibridização in situ fluorescente (FISH), preparação de amostras, otimização da configuração de imagem OPTIR-FISH e aquisição de dados. Também demonstramos como realizar análises de imagens e interpretar dados espectrais no nível de célula única com alto rendimento. A natureza padronizada e detalhada deste protocolo facilitará muito sua adoção por pesquisadores de diversas origens e disciplinas dentro da ampla comunidade de pesquisa de metabolismo de célula única.

Introdução

O metabolismo celular é um pilar fundamental na biologia celular, orientando muitos processos que determinam a saúde, a função e a interação das células com o meio ambiente. A análise do metabolismo no nível celular individual, particularmente nos ambientes nativos, fornece informações valiosas para revelar as atividades heterogêneas e complexas nos sistemas biológicos¹. Isso é especialmente crucial no estudo de microrganismos, pois muitos micróbios exibem requisitos de crescimento exclusivos ou dependências ambientais que desafiam os métodos tradicionais de cultivo². Por exemplo, algumas espécies podem exigir composições específicas de nutrientes ou relações simbióticas que não são facilmente replicadas em um ambiente de laboratório, tornando-as não cultiváveis por técnicas padrão³. Além disso, os longos períodos necessários para o cultivo de certas espécies representam desafios significativos para a pesquisa microbiológica, muitas vezes estendendo-se além dos prazos práticos para estudo e análise. Para contornar essas limitações, métodos alternativos, como a reação em cadeia da polimerase e a hibridização in situ fluorescente (FISH), permitem a identificação de espécies microbianas sem a necessidade de cultivo⁴, o que pode alcançar uma visão mais precisa e holística dos ecossistemas microbianos. No entanto, essas tecnologias analíticas carecem da capacidade de elucidar o metabolismo celular. Essa lacuna destaca os desafios contínuos no campo da microbiologia: a tarefa simultânea de diferenciar a identidade celular e elucidar o metabolismo no nível de uma única célula. Avanços em técnicas como espectrometria de massa de imagem (IMS) acoplada a isótopos estáveis surgiram como ferramentas poderosas para análise metabólica de célula única⁵. Nesses experimentos, as células foram incubadas com substratos contendo isótopos como ¹³C ou ¹⁵N. As biomoléculas recém-anabolizadas carregam esses isótopos, tornando-os distinguíveis nos espectros m / z. No entanto, o IMS sofre de instrumentação cara, preparação complicada de amostras, rendimento relativamente baixo e experiência necessária para analisar os espectros m / z. Quando combinado com imagens de fluorescência específicas de marcadores moleculares, avanços foram feitos na elucidação do metabolismo celular com maior especificidade⁶. No entanto, persistem desafios para unir essas duas modalidades. A diferença de resolução entre IMS e imagens de fluorescência, combinada com diferentes configurações operacionais, dificulta o alinhamento e a correlação dos achados⁷.

A integração da imagem espectroscópica vibracional com a marcação de isótopos estáveis oferece uma nova solução para o estudo do metabolismo de uma única célula. A incorporação de isótopos mais pesados retarda a vibração das ligações químicas, levando a picos de desvio para o vermelho nos espectros vibracionais⁸. Notavelmente, a imagem vibracional fornece uma resolução espacial comparável à imagem de fluorescência, e tanto a quantificação metabólica quanto a identificação celular podem ser realizadas em uma única configuração, simplificando o registro e a correlação da imagem. Nosso trabalho recente demonstrou a combinação de uma plataforma avançada de imagem vibracional: infravermelho fototérmico óptico (OPTIR) com hibridização in situ fluorescente (FISH) para sondar o metabolismo da glicose em comunidades bacterianas⁹ (Figura 1). O OPTIR é um sistema de microscopia espectroscópica vibracional que aproveita o efeito fototérmico da absorção do infravermelho médio, detectando a mudança da luz visível, que fornece resolução submicrométrica como na microscopia óptica, mas com as informações espectroscópicas vibracionais adicionais originadas da absorção do infravermelho médio. FISH é uma técnica comumente usada para determinar a identidade do microrganismo no nível de uma única célula. A sequência de oligonucleotídeos pode ser projetada para atingir sequências 16S específicas de diferentes táxons, e diferentes fluoróforos podem ser anexados. A hibridização específica das sondas de oligonucleotídeos projetadas com o rRNA alvo leva a fortes sinais de fluorescência de espécies-alvo dentro de células individuais, e imagens de fluorescência multicanal podem ser realizadas para identificar várias espécies dentro da população. Como as imagens OPTIR e de fluorescência são baseadas na detecção óptica, a combinação de fluorescência OPTIR e FISH é simples de implementar. As duas modalidades compartilham a mesma resolução óptica para análise de célula única e podem ser alternadas convenientemente sem a necessidade de alinhamento adicional ou co-registro.

Este protocolo apresenta um guia detalhado para aproveitar a plataforma OPTIR-FISH para análise avançada de função de estrutura de célula única. Usamos as amostras bacterianas cultivadas em ¹³meios contendo C-glicose como banco de testes e quantificamos a síntese proteica de novo a partir de ¹³C-glicose. Para demonstrar a capacidade da plataforma de identificar células, usamos misturas bacterianas nas quais cada espécie foi marcada usando sondas FISH direcionadas a rRNA. Essa abordagem facilitou a identificação precisa de uma única célula de cepas bacterianas específicas, como Escherichia coli (E. coli) e Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), e seu metabolismo. Este protocolo oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para perfis metabólicos simultâneos e identificação de espécies no nível de uma única célula, prometendo avançar nossa compreensão das interações celulares, fisiologia e seus papéis em ambientes complexos.

Protocolo

O uso de amostras bacterianas neste estudo está de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Boston e do Instituto Nacional de Saúde.

NOTA: O fluxo de trabalho geral seguido neste protocolo está resumido na Figura 2.

1. Cultura bacteriana e marcação de isótopos (Figura 2A)

NOTA: O exemplo dado aqui é para rotular uma cultura bacteriana pura. Se aplicar este protocolo a comunidades polimicrobianas, o meio e o tempo de marcação devem ser ajustados de acordo com a comunidade e a fisiologia dos organismos de interesse.

1. Inocule a cepa bacteriana de interesse de uma única colônia e pré-cultura em um meio rico em nutrientes, como caldo de soja tríptico (TSB) ou caldo Luria-Bertani (LB) por 3 h para atingir a fase de crescimento exponencial (log). E. coli BW25113 é usado como uma cepa de exemplo neste protocolo.
   NOTA: O tempo para atingir a fase logarítmica varia de acordo com a tensão em uso. Este tempo precisa ser adaptado para cada cepa.
2. Meça a densidade óptica a 600 nm para estimar a concentração bacteriana.
3. Prepare um meio de crescimento mínimo suplementado com substratos marcados isotopicamente. Para E. coli BW25113, suplementar o meio mínimo M9 com ¹³C-glicose a uma concentração final de 0,2% (p/v).
   NOTA: A ¹³C-glicose usada (D-glicose ^U-13C₆, 99%) foi universalmente marcada, onde todos os átomos de carbono foram substituídos por ¹³átomos de C. A escolha do meio de crescimento mínimo dependerá da cepa bacteriana. A escolha do substrato isotópico dependerá do processo metabólico específico de interesse. O objetivo geral é que o substrato isotópico sirva como a principal fonte de nutrição em comparação com suas contrapartes não rotuladas.
4. Diluir as bactérias no meio de crescimento mínimo que contém o substrato marcado isotopicamente até uma concentração final de 5 ×^{10 5} UFC/ml.
   NOTA: Normalmente, uma alta taxa de diluição como 1:100 é usada, e a nutrição não rotulada do meio rico torna-se insignificante. Alternativamente, para garantir a remoção completa do meio rico em nutrientes, uma lavagem com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pode ser realizada por centrifugação a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C e ressuspensão em PBS seguida por uma segunda centrifugação e ressuspensão final no meio de crescimento mínimo.
5. Cultive amostras bacterianas em uma incubadora de agitação orbital sob condições ideais de crescimento. Em geral, ajuste a incubadora de agitação orbital para uma velocidade de 220 rpm e uma temperatura de 37 ° C e coloque os tubos de cultura inclinados com uma tampa solta para incubação aeróbica. Para E. coli, 24 h de incubação aeróbica a 37 °C geralmente são suficientes para atingir a rotulagem máxima de ¹³C.
   NOTA: O tempo de incubação depende do processo metabólico de interesse. Um tempo de incubação mais longo geralmente leva a uma maior marcação isotópica. Uma medição da curva de crescimento sob a mesma condição com um substrato não rotulado pode fornecer informações sobre como determinar os pontos de tempo de coleta apropriados.
6. Colete células bacterianas nos pontos de tempo desejados por centrifugação a 14.000 x g por 10 min a 4 ° C.
7. Remova o sobrenadante e ressuspenda em um volume igual de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS. Fixar as células em solução de PFA durante 10 min à temperatura ambiente (RT) ou 2 h a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, lave as células duas vezes com PBS, ressuspenda as células em 1 mL de 50% (v / v) de PBS e etanol a 96% e armazene a -20 ° C até uso posterior.

2. Hibridização in situ fluorescente (FISH) (Figura 2B)

1. Hibridizar células de E. coli com a sonda de oligonucleotídeo Gam42a¹⁰ marcada com um fluoróforo de cianina5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) e células de B. theta com a sonda de oligonucleotídeo Bac303¹¹ marcada com um fluoróforo de cianina3 (Cy3) (Bac303-Cy3), seguindo um protocolo FISH padrão.
   NOTA: Fundamentos do rRNA-FISH para identificação: As moléculas de rRNA são alvos ideais do FISH, pois são distribuídas de forma ubíqua e naturalmente amplificadas dentro das células microbianas. O rRNA também contém regiões de sequência conservadas e variáveis, de modo que a profundidade filogenética do grupo-alvo pode ser determinada pelo grau de conservação da sonda de oligonucleotídeos. Por ligação específica da sonda projetada à sequência alvo, o fluoróforo marcado mostra sinais fluorescentes para células individuais.
2. Consulte a literatura publicada anteriormente 12,13,14 para o protocolo detalhado de hibridização in situ de fluorescência. As etapas abaixo descrevem brevemente o protocolo padrão para células microbianas.
   1. Desidratação:
      1. Centrifugue as células fixas (100 μL) a 14.000 x g por 10 min para granular, ressuspenda em 100 μL de etanol de grau analítico a 96% e incube por 1 min em RT.
      2. Em seguida, centrifugue as células novamente a 14.000 x g por 5 min, remova o etanol e deixe o pellet da célula secar ao ar.
   2. Hibridização: Hibridizar as células em solução (100 μL) por 3 h a 46 °C.
      NOTA: O tampão de hibridização consiste em 900 mM de NaCl, 20 mM de Tris-(hidroximetil)-amino metano HCl, 1 mM de ácido etilenodiamina tetracético, 0,01% de dodecilsulfato de sódio, 100 ng do respectivo oligonucleotídeo marcado com fluorescência e concentração de formamida necessária para obter condições rigorosas.
   3. Centrífuga: Imediatamente após a hibridização, transfira as amostras para uma centrífuga com rotor pré-aquecido a 46 °C e centrifugue a 14.000 x g por 15 min na temperatura máxima permitida (geralmente 40 °C).
   4. Lave e armazene:
      1. Lavar as amostras num tampão de rigor adequado durante 15 min a 48 °C. Em seguida, centrifugue as células a 14.000 x g por 15 min à temperatura máxima permitida em uma centrífuga com rotor pré-aquecido a 46 °C.
      2. Finalmente, lave as células com 500 μL de PBS gelado, ressuspenda-as em 20 μL de PBS 1x e armazene-as a 4 ° C até o uso posterior.
         NOTA: A ligação específica da sonda é garantida pelo rigor de hibridização correto. O alto rigor pode ser alcançado aumentando a temperatura de hibridização, diminuindo a concentração de sal ou adicionando formamida desnaturante. A formamida interfere nas ligações de hidrogênio que estabilizam os duplex de ácidos nucleicos. Aqui, a temperatura e a concentração de sal não são modificadas na hibridização durante o ajuste da concentração de formamida. A concentração ideal de formamida para sondas recém-projetadas é determinada experimentalmente usando curvas de dissociação de formamida¹⁰. A concentração de formamida necessária para sondas publicadas pode ser encontrada em probeBase¹⁵ ou por uma pesquisa bibliográfica. Alternativamente, as concentrações previstas de formamida podem ser obtidas a partir de análises in-silico usando mathFISH¹⁶. Na etapa de lavagem, uma temperatura ligeiramente mais alta leva a uma condição um pouco mais rigorosa, o que leva a uma maior especificidade de ligação.

3. Preparo da amostra (Figura 2C)

1. Limpeza e revestimento da lâmina:
   1. Use lâminas CaF₂ padronizadas (10 mm de diâmetro e 350 μm de espessura para compatibilidade com o porta-amostras do instrumento). Mergulhe o CaF₂ em etanol a 70% por 15 min e enxágue duas vezes com água DI.
   2. Transfira as lâminas limpas para uma solução de poli-L-lisina a 0,1% e incube durante a noite a 4 °C. Enxágue as lâminas uma vez com água DI e seque ao ar.
2. Descongele as amostras de células preparadas em RT enquanto protegidas da luz.
3. Para evitar cristais de sal excessivos do PBS durante a secagem da amostra, siga as etapas 3.3.1-3.3.2.
   1. Lave as células duas vezes com água deionizada (DI). Centrifugue a 14.000 x g por 10 min e remova o sobrenadante.
   2. Adicione de volta o volume original de água DI e vortex suavemente. Repita a centrifugação e adicione a lavagem com água DI novamente.
4. (Opcional) Para amostras de mistura, transfira o mesmo volume de cada amostra e misture em um tubo de centrífuga.
5. Concentre as amostras de células bacterianas por centrifugação a 14.000 x g por 10 min e remova o sobrenadante.
6. Vortex suavemente a solução restante por ~ 30 s e adicione 1-2 μL de solução na lâmina CaF₂ preparada. Seque a amostra ao ar por 30 min enquanto protegida da luz.
   NOTA: Um pequeno ponto redondo deve aparecer na lâmina após a secagem ao ar. Devido ao efeito "anel de café", as bordas do ponto teriam uma densidade maior de células bacterianas. Esta etapa de centrífuga é para atingir uma densidade apropriada para imagens bacterianas eficientes de célula única. A concentração ideal deve levar a uma camada uniforme e densa de células bacterianas individuais sob o microscópio. Se houver um pellet transparente que possa ser visto a olho nu após a centrifugação, remova o sobrenadante para que, após o vórtice, a solução pareça quase límpida. Um teste rápido pode ser realizado na amostra de controle para estimar o volume de remoção do sobrenadante. Uma série de gotículas com diferentes quantidades de sobrenadante restante pode ser depositada na lâmina de vidro do microscópio para examinar o volume ideal de diluição sob o microscópio de campo claro. Se não houver pellets visíveis após a centrifugação, remova a maior parte do sobrenadante para concentrar as amostras ao máximo. O truque é posicionar o tubo da centrífuga com a dobradiça do lado de fora em um rotor de ângulo fixo para que o pellet apareça no mesmo lado da dobradiça do tubo. Além disso, reduza os tamanhos das pipetas (P1000, P200, P10) para aumentar a precisão durante a remoção do sobrenadante para manter o pellet intacto.
7. Monte a lâmina em um sample suporte fornecido e use pequenos pontos de fita de poliéster para prender a lâmina durante a medição.

4. Imagem OPTIR-FISH

NOTA: A imagem de fluorescência e a imagem OPTIR serão realizadas no sistema OPTIR.

1. Geometria do sistema:
   1. Use contrapropagação de bomba de infravermelho médio e sonda visível, detecção reversa (epi) de luz visível com este protocolo.
   2. Para focar a luz visível e coletar a luz visível refletida e dispersa, use uma objetiva de ar (50x 0.8NA). Para focar a luz infravermelha média, use uma objetiva Cassegrain (40x 0.78NA).
   3. Certifique-se de que o sistema também esteja equipado com um módulo de epifluorescência de campo amplo com vários conjuntos de filtros de fluorescência. Para os fluoróforos usados neste protocolo, selecione o conjunto de filtros de proteína fluorescente verde (GFP) para detecção de Cy3 e o conjunto de filtros Alexa Fluor 647 para detecção de Cy5.
2. Prepare-se para as medições:
   1. Ligue o sistema e abra o software de controle do instrumento. Após a inicialização, alterne o controle deslizante Contraprop e Fluorescência para a posição ligado.
   2. Defina o objetivo como 50x e, em seguida, execute o plano de fundo automático para adquirir o espectro de potência de infravermelho. Use o espectro de potência para normalizar os espectros de amostra adquiridos ou normalizar as imagens OPTIR em diferentes números de onda. Isso excluirá o efeito das diferenças de potência do laser infravermelho médio na análise e quantificação de dados.
      NOTA: A aquisição de espectros de potência IR para normalização é imperativa para a análise quantitativa downstream, pois a intensidade medida está linearmente relacionada à potência IR. Depois de executar o plano de fundo automático, o software normalizará os espectros OPTIR e as imagens OPTIR para os espectros de potência IR automaticamente para os usuários. A purga do sistema com N₂ pode minimizar a influência do vapor d'água e aumentar a reprodutibilidade entre os experimentos.
3. Para carregar a amostra, use o botão Descarregar para mover o estágio de amostra para fora. Use uma objetiva de baixa ampliação, como 10x, para localizar a área de amostra e navegar até a região que tem a densidade de amostra ideal. Focalize a amostra ajustando a altura da objetiva no software de controle. Altere a seleção do objetivo para 50x.
4. Aquisição de imagem
   NOTA: As amostras utilizadas são: i) E. coli (¹³C-glicose incubada); ii) E. coli (¹²C-glicose incubada); iii) B. theta (¹²C-glicose incubada); iv) mistura de E. coli (¹³C-glicose incubada) e B. theta (¹²C-glicose incubada).
   1. Imagens de campo claro (Figura 2D): Traga a amostra em foco observando as imagens de campo claro.
   2. Imagens de fluorescência (Figura 2E): Altere o conjunto de filtros clicando no botão de nome do filtro (GFP para Cy3 e Alexa Fluor 647 para Cy5) para detectar fluoróforos associados às sondas FISH projetadas e adquirir imagens de fluorescência sequencialmente usando o módulo de fluorescência no software. Ajuste a intensidade da luz e o tempo de exposição para obter contraste de sinal adequado antes de branquear os fluoróforos.
      NOTA: Como a sonda usada nas medições OPTIR pode fotobranquear fluoróforos, sempre adquira imagens de fluorescência antes das imagens OPTIR. Para se preocupar com o efeito dos marcadores fluorescentes na detecção de OPTIR, consulte um trabalho publicado anteriormente que demonstrou que o FISH com fluoróforo Cy5 não afeta a seguinte quantificação com base em imagens OPTIR, pois Cy5 é pequeno em tamanho e baixo em abundância em comparação com a proteína bacteriana alvo⁹.
   3. Imagens OPTIR (Figura 2F):
      1. Determine o pico normal e a posição do pico desviado para o vermelho induzido por isótopos. No caso da síntese de proteínas a partir da ¹³C-glicose, o pico normal da amida I é detectado em torno de 1656 cm-1, e o pico desviado para o vermelho é em torno de 1612 ^cm-1 (Figura 3A).
         NOTA: A posição normal do pico depende do componente bioquímico e/ou produto metabólico de interesse. A posição de pico deslocada também depende de qual isótopo é usado para rotulagem. Esses dois números de onda também podem ser determinados experimentalmente medindo os espectros completos de células não marcadas e marcadas ao máximo (consulte a etapa 4.5)
      2. Ajuste o comprimento de onda da bomba IR para 1656 ^cm-1 usando o software. Modifique a potência da sonda e o ganho do detector de acordo para evitar a saturação do sinal CC (8 V). Ajuste a altura da objetiva inferior do Cassegrain para maximizar o sinal CA.
         NOTA: A potência IR típica na amostra é de cerca de 5 mW e a potência da sonda na amostra é de cerca de 3-15 mW, dependendo da amostra. Tanto o IR quanto a potência da sonda podem ser ajustados usando o software de controle para otimizar o nível de potência para garantir alto contraste de imagem, evitando danos às células.
      3. Defina as imagens OPTIR para conter 200 x 200 pixels e defina a taxa de varredura para 100 μm/s. Defina o tamanho do passo nas direções X e Y para 150 nm, de modo que o tamanho da imagem seja de cerca de 30 x 30 μm².
      4. Adquira a imagem.
      5. Ajuste o comprimento de onda da bomba IR para 1612 ^cm-1 e adquira uma imagem do mesmo campo de view neste número de onda.
      6. Para cada amostra, imagem de pelo menos três campos de visão para análise estatística.
5. (Opcional) Medição espectral: Após a aquisição da imagem, se uma característica espacial de interesse for localizada, execute a medição espectral.
   1. Selecionar locais: Escolha um único ponto ou especifique uma matriz de pontos para análise no módulo Espectral do software.
   2. Defina o parâmetro de varredura espectral. Selecione a faixa de cobertura do número de onda, a velocidade de varredura e o espaçamento de saída de dados com base nos requisitos.
      NOTA: se a velocidade de varredura e o espaçamento de saída de dados forem diferentes em comparação com os usados na etapa de aquisição em segundo plano (etapa 4.2), um novo plano de fundo com base nos parâmetros de varredura espectral atuais é necessário para a normalização correta.
   3. Defina o número de co-média e inicie a medição espectral. O aumento da co-média também aumenta a relação sinal-ruído dos espectros, mas requer tempos de aquisição mais longos.
      NOTA: Se for observada uma flutuação significativa durante a co-média, isso pode indicar instabilidade da amostra induzida pelo aquecimento do laser. Isso geralmente pode ser resolvido diminuindo a potência de infravermelho e/ou diminuindo a potência visível da sonda.

5. Processamento e análise de dados no nível de célula única

1. Quantificar a síntese metabólica a partir de substratos isotópicos (Figura 2G)
   NOTA: A seguinte quantificação da incorporação metabólica de substratos isotópicos é baseada em imagens OPTIR de dois números de onda correspondentes aos picos normais e deslocados das macromoléculas alvo. Em comparação com uma pilha hiperespectral completa, a imagem de dois números de onda pode reduzir muito o tempo necessário para cada FOV e melhorar o rendimento, ao mesmo tempo em que recaptura totalmente o efeito isotópico crítico para a quantificação do metabolismo.
   1. Subtrair a imagem OPTIR de pico deslocada da imagem OPTIR de pico normal gera um mapa visual das atividades de síntese de substratos isotópicos. Como demonstração (Figura 3C), para E. coli cultivada com ¹³C-glicose, os pixels positivos na imagem (1656 ^{cm-1-1612 cm-1}) indicam incorporação ativa de ¹³C em proteínas, portanto, um maior nível de síntese proteica.
      NOTA: A subtração pode ser realizada usando a função ImageJ Image Calculator. Alternativamente, a subtração pode ser facilmente realizada em qualquer linguagem de programação preferida para processamento em lote.
   2. Quantificação da atividade metabólica de uma única célula
      1. Obtenha coeficientes (representados por h na Figura 2G) de amostras de referência não rotuladas e totalmente rotuladas. Como o pico desviado para o vermelho induzido por isótopos se sobrepõe parcialmente ao pico normal, tanto as amostras não marcadas quanto as marcadas (recém-sintetizadas a partir do substrato marcado isotopicamente) contribuirão para os sinais OPTIR no pico normal e deslocado. Quantifique essas diferentes contribuições usando a intensidade do sinal OPTIR normalizado no pico normal e deslocado de amostras de referência não rotuladas e totalmente marcadas.
         NOTA: Para amostras de referência, amostras de referência não rotuladas são cultivadas (ou incubadas) sem qualquer substrato rotulado isotopicamente. As amostras de referência totalmente marcadas são geralmente cultivadas com a maior concentração de substrato marcado isotopicamente com o maior tempo de cultivo.
      2. Para análise de célula única, obtenha máscaras de célula única com base nas imagens de campo claro.
         NOTA: Várias técnicas de processamento de imagem podem ser aplicadas aqui para gerar essa máscara, incluindo diferentes detecções de partículas, como análise de bolhas, e métodos de segmentação de células, como bacias hidrográficas.
      3. Meça a intensidade do sinal OPTIR a partir de células individuais. Aplique a máscara de célula única adquirida às duas imagens OPTIR (no pico normal e no pico deslocado) e, para cada célula única, calcule a média dos valores de pixel na região da máscara de célula única. O valor médio de células individuais será usado na quantificação.
      4. Para cada célula, calcule a contribuição relativa de biocomponentes não rotulados e rotulados com base nos coeficientes da etapa 5.1.2.1 e nos sinais da etapa 5.1.2.3.
         NOTA: Uma taxa de substituição isotópica é definida como a contribuição relativa dos biocomponentes rotulados sobre a soma dos biocomponentes rotulados e não rotulados (Figura 2G). Essa proporção deve estar na faixa de 0 a 1. A razão de reposição isotópica é linearmente proporcional à razão de ¹³C-glicose para ¹²C-glicose (com uma quantidade fixa de glicose total)⁹. Uma alta sensibilidade de detecção de 5% de ¹³C-glicose foi demonstrada para células de E. coli .
2. Identifique espécies bacterianas a partir de imagens de fluorescência multicanal (Figura 2H)
   1. Mescle os canais de fluorescência multicoloridos para criar orientação visual para diferentes espécies bacterianas usando ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
   2. Para análise de célula única, para cada canal de fluorescência, gere um conjunto de regiões de interesse (ROIs) para células individuais.
      NOTA: Várias técnicas de processamento de imagem podem ser aplicadas aqui para gerar a máscara, incluindo diferentes métodos de limite automático e métodos de segmentação de células.
3. Correlacionar identidades FISH e atividades metabólicas OPTIR (Figura 2I)
   1. Vincule as identidades bacterianas de nível de célula única das imagens de fluorescência FISH diretamente às atividades metabólicas das imagens OPTIR, correlacionando as posições das ROIs.
   2. Realize análises estatísticas para comparar as atividades metabólicas de diferentes espécies.
      NOTA: As máscaras são geradas separadamente das imagens de fluorescência e das imagens OPTIR porque as atividades metabólicas podem ser analisadas para todas as células das imagens OPTIR, enquanto as células desconhecidas não aparecem em nenhum dos canais de fluorescência. Isso garante que todas as células possam ser incluídas na análise metabólica. Se houver um grande número de células não identificadas, diferentes sondas FISH direcionadas ao rRNA de diferentes táxons de interesse podem precisar ser consideradas.

Resultados

O fluxo de trabalho geral para análise metabólica microbiana de célula única com identificação genética por OPTIR-FISH é resumido em Figura 2. Os resultados representativos que demonstram a capacidade de imagem metabólica de célula única do OPTIR são mostrados em Figura 3. Este exemplo usou células de E. coli incubadas com ¹²C- ou ¹³C-glicose por 24 h. A incorporação de ¹³C em prot...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para aplicação da plataforma OPTIR-FISH para identificação simultânea de espécies microbianas e quantificação de atividades metabólicas na resolução de célula única. As etapas críticas incluem cultura com marcação de isótopos estáveis para estudar atividades metabólicas específicas e hibridização in situ fluorescente para identificar espécies microbianas alvo. A imagem de fluorescência multicanal e a imagem OPTIR e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G