Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo usando hibridização in situ de fluorescência infravermelha óptica (OPTIR-FISH), também conhecida como FISH fototérmica de infravermelho médio (MIP-FISH), para identificar células individuais e entender seu metabolismo. Essa metodologia pode ser amplamente aplicada para diversas aplicações, incluindo o mapeamento do metabolismo celular com resolução de célula única.

Resumo

Compreender as atividades metabólicas de células individuais dentro de comunidades complexas é fundamental para desvendar seu papel na doença humana. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para identificação celular simultânea e análise metabólica com a plataforma OPTIR-FISH, combinando sondas FISH marcadas com rRNA e substratos marcados com isótopos. A imagem de fluorescência fornece a identificação celular pela ligação específica de sondas FISH marcadas com rRNA, enquanto a imagem OPTIR fornece atividades metabólicas dentro de células individuais por desvio para o vermelho induzido por isótopos nos espectros OPTIR. Usando bactérias cultivadas com ¹³C-glicose como banco de testes, o protocolo descreve a cultura microbiana com marcação isotópica, hibridização in situ fluorescente (FISH), preparação de amostras, otimização da configuração de imagem OPTIR-FISH e aquisição de dados. Também demonstramos como realizar análises de imagens e interpretar dados espectrais no nível de célula única com alto rendimento. A natureza padronizada e detalhada deste protocolo facilitará muito sua adoção por pesquisadores de diversas origens e disciplinas dentro da ampla comunidade de pesquisa de metabolismo de célula única.

Introdução

O metabolismo celular é um pilar fundamental na biologia celular, orientando muitos processos que determinam a saúde, a função e a interação das células com o meio ambiente. A análise do metabolismo no nível celular individual, particularmente nos ambientes nativos, fornece informações valiosas para revelar as atividades heterogêneas e complexas nos sistemas biológicos¹. Isso é especialmente crucial no estudo de microrganismos, pois muitos micróbios exibem requisitos de crescimento exclusivos ou dependências ambientais que desafiam os métodos tradicionais de cultivo². Por exemplo, alguma....

Protocolo

O uso de amostras bacterianas neste estudo está de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Boston e do Instituto Nacional de Saúde.

NOTA: O fluxo de trabalho geral seguido neste protocolo está resumido na Figura 2.

1. Cultura bacteriana e marcação de isótopos (Figura 2A)

NOTA: O exemplo dado aqui é para rotular uma cultura bacteriana pura. Se aplicar este protocolo a comunidades polimicrobianas, o meio e o tempo de ....

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para aplicação da plataforma OPTIR-FISH para identificação simultânea de espécies microbianas e quantificação de atividades metabólicas na resolução de célula única. As etapas críticas incluem cultura com marcação de isótopos estáveis para estudar atividades metabólicas específicas e hibridização in situ fluorescente para identificar espécies microbianas alvo. A imagem de fluorescência multicanal e a imagem OPTIR e.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G