光学光热红外荧光原位杂交 （OPTIR-FISH）

摘要

在这里，我们提出了一种使用光学光热红外荧光 原位 杂交 （OPTIR-FISH），也称为中红外光热 FISH （MIP-FISH） 的方案，以识别单个细胞并了解它们的代谢。该方法可广泛应用于各种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。

摘要

了解复杂群落中单个细胞的代谢活动对于揭示它们在人类疾病中的作用至关重要。在这里，我们提出了一种全面的方案，通过结合 rRNA 标记的 FISH 探针和同位素标记的底物，使用 OPTIR-FISH 平台同时进行细胞鉴定和代谢分析。荧光成像通过结合 rRNA 标记的 FISH 探针提供细胞鉴定，而 OPTIR 成像通过同位素诱导的 OPTIR 光谱红移提供单细胞内的代谢活动。该方案使用用 ¹³C-葡萄糖培养的细菌作为测试床，概述了微生物培养与同位素标记、荧光 原 位杂交 （FISH）、样品制备、OPTIR-FISH 成像设置的优化和数据采集。我们还演示了如何以高通量在单细胞水平上进行图像分析和解释光谱数据。该方案的标准化和详细性质将极大地促进其被广泛的单细胞代谢研究界中来自不同背景和学科的研究人员采用。

引言

细胞代谢是细胞生物学的基础支柱，指导着决定细胞健康、功能和与环境相互作用的许多过程。在单个细胞水平上分析代谢，特别是在天然环境中，为揭示生物系统中的异质性和复杂活动提供了宝贵的见解¹。这在微生物研究中尤为重要，因为许多微生物表现出独特的生长要求或环境依赖性，这对传统培养方法提出了挑战²。例如，一些物种可能需要特定的营养成分或共生关系，而这些关系在实验室环境中不容易复制，因此使它们无法通过标准技术进行培养³。此外，某些物种的培养时间较长，这给微生物学研究带来了重大挑战，往往超出了研究和分析的实际时间框架。为了规避这些限制，聚合酶链反应和荧光 原 位杂交 （FISH） 等替代方法允许在不需要培养的情况下识别微生物物种⁴，这可以实现对微生物生态系统的更准确和整体的看法。然而，这些分析技术缺乏阐明细胞代谢的能力。这一差距凸显了微生物学领域持续面临的挑战：在单细胞水平上区分细胞身份和阐明代谢的并发任务。成像质谱 （IMS） 等技术的进步与稳定同位素相结合已成为单细胞代谢分析的强大工具⁵。在这些实验中，细胞与含有同位素（如 ¹³C 或 ¹⁵N）的底物一起孵育。新合成代谢的生物分子....

研究方案

本研究中细菌标本的使用符合波士顿大学机构审查委员会 （IRB） 和美国国立卫生研究院的指导方针。

注意： 图 2 总结了本协议中遵循的一般工作流程。

1. 细菌培养和同位素标记（图 2A）

注意：此处给出的示例用于标记纯细菌培养物。如果将此方案应用于多微生物群落，则必须根据相关生物体的群落和生理学调整培养基和标记时间。

1. 从单个菌落中接种感兴趣的细菌菌株，并在营养丰富的培养基中预培养，例如胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 或 Luria-Bertani 肉汤 （LB） 3 小时，以达到指数生长期 （log） 阶段。 大肠杆菌 BW25113 在该协议中用作示例菌株。
   注意：达到对数阶段的时间将根据使用的菌株而变化。这个时间需要根据每个菌株进行调整。
2. 测量 600 nm 处的光密度以估计细菌浓度。
3. 准备补充有同位素标记底物的最小生长培养基。对于 大肠杆菌 BW25113，在 M9 基础培养基中补充终浓度为 0.2% （w/....

讨论

在这里，我们描述了应用 OPTIR-FISH 平台以单细胞分辨率同时鉴定微生物种类和定量代谢活性的详细方案。关键步骤包括用于研究特定代谢活性的稳定同位素标记培养和用于识别目标微生物种类的荧光 原位 杂交。可以在同一台显微镜上依次进行选定波数的多通道荧光成像和 OPTIR 成像。我们展示了如何定量分析这些图像以揭示复杂群落中不同物种的代谢活动水平。该.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G