光学光热红外荧光原位杂交 （OPTIR-FISH）

摘要

在这里，我们提出了一种使用光学光热红外荧光 原位 杂交 （OPTIR-FISH），也称为中红外光热 FISH （MIP-FISH） 的方案，以识别单个细胞并了解它们的代谢。该方法可广泛应用于各种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。

摘要

了解复杂群落中单个细胞的代谢活动对于揭示它们在人类疾病中的作用至关重要。在这里，我们提出了一种全面的方案，通过结合 rRNA 标记的 FISH 探针和同位素标记的底物，使用 OPTIR-FISH 平台同时进行细胞鉴定和代谢分析。荧光成像通过结合 rRNA 标记的 FISH 探针提供细胞鉴定，而 OPTIR 成像通过同位素诱导的 OPTIR 光谱红移提供单细胞内的代谢活动。该方案使用用 ¹³C-葡萄糖培养的细菌作为测试床，概述了微生物培养与同位素标记、荧光 原 位杂交 （FISH）、样品制备、OPTIR-FISH 成像设置的优化和数据采集。我们还演示了如何以高通量在单细胞水平上进行图像分析和解释光谱数据。该方案的标准化和详细性质将极大地促进其被广泛的单细胞代谢研究界中来自不同背景和学科的研究人员采用。

引言

细胞代谢是细胞生物学的基础支柱，指导着决定细胞健康、功能和与环境相互作用的许多过程。在单个细胞水平上分析代谢，特别是在天然环境中，为揭示生物系统中的异质性和复杂活动提供了宝贵的见解¹。这在微生物研究中尤为重要，因为许多微生物表现出独特的生长要求或环境依赖性，这对传统培养方法提出了挑战²。例如，一些物种可能需要特定的营养成分或共生关系，而这些关系在实验室环境中不容易复制，因此使它们无法通过标准技术进行培养³。此外，某些物种的培养时间较长，这给微生物学研究带来了重大挑战，往往超出了研究和分析的实际时间框架。为了规避这些限制，聚合酶链反应和荧光 原 位杂交 （FISH） 等替代方法允许在不需要培养的情况下识别微生物物种⁴，这可以实现对微生物生态系统的更准确和整体的看法。然而，这些分析技术缺乏阐明细胞代谢的能力。这一差距凸显了微生物学领域持续面临的挑战：在单细胞水平上区分细胞身份和阐明代谢的并发任务。成像质谱 （IMS） 等技术的进步与稳定同位素相结合已成为单细胞代谢分析的强大工具⁵。在这些实验中，细胞与含有同位素（如 ¹³C 或 ¹⁵N）的底物一起孵育。新合成代谢的生物分子携带这些同位素，使其在 m/z 光谱上可以区分。然而，IMS 存在仪器昂贵、样品制备复杂、通量相对较低以及分析 m/z 谱图所需的专业知识等问题。当与分子标志物特异性荧光成像相结合时，在阐明细胞代谢方面取得了进展，特异性更高⁶。然而，在弥合这两种模式方面仍然存在挑战。IMS 和荧光成像之间的分辨率差异，再加上不同的操作设置，使得难以对齐和关联结果⁷。

振动光谱成像与稳定同位素标记的整合为单细胞代谢的研究提供了一种新的解决方案。较重同位素的掺入减慢了化学键的振动，导致振动光谱中出现红移峰⁸。值得注意的是，振动成像提供的空间分辨率可与荧光成像相媲美，并且代谢定量和细胞鉴定都可以在一次设置中完成，从而简化了图像配准和相关性。我们最近的工作证明了先进的振动成像平台：光学光热红外 （OPTIR） 与荧光 原位 杂交 （FISH） 的结合，以探测细菌群落中的葡萄糖代谢⁹ （图 1）。OPTIR 是一种振动光谱显微镜系统，它通过检测可见光变化来利用中红外吸收的光热效应，这提供了与光学显微镜一样的亚微米分辨率，但具有来自中红外吸收的额外振动光谱信息。FISH 是一种在单细胞水平上确定微生物身份的常用技术。寡核苷酸序列可以设计为靶向不同分类群的特异性 16S 序列，并且可以连接不同的荧光团。设计的寡核苷酸探针与靶 rRNA 的特异性杂交导致单个细胞内靶物种的强烈荧光信号，并且可以进行多通道荧光成像以识别群体中的多个物种。由于 OPTIR 和荧光成像都基于光学检测，因此将 OPTIR 和 FISH 荧光相结合很容易实现。这两种模式共享相同的光学分辨率，用于单细胞分析，并且可以方便地切换，而无需额外的对准或共同配准。

该协议提供了利用 OPTIR-FISH 平台进行高级单细胞结构-功能分析的详细指南。我们使用在含 ¹³C-葡萄糖的培养基中生长的细菌样品作为测试床，并从 ¹³C-葡萄糖定量蛋白质合成。为了证明该平台识别细胞的能力，我们使用了细菌混合物，其中每个物种都使用 rRNA 靶向 FISH 探针进行标记。这种方法有助于精确鉴定特定细菌菌株，例如大肠杆菌 （E. coli） 和拟杆菌 thetaiotaomicron （B. theta） 及其代谢。该协议为研究人员提供了一个强大的工具，可以在单细胞水平上同时进行代谢分析和物种鉴定，有望促进我们对细胞相互作用、生理学及其在复杂环境中的作用的理解。

研究方案

本研究中细菌标本的使用符合波士顿大学机构审查委员会 （IRB） 和美国国立卫生研究院的指导方针。

注意： 图 2 总结了本协议中遵循的一般工作流程。

1. 细菌培养和同位素标记（图 2A）

注意：此处给出的示例用于标记纯细菌培养物。如果将此方案应用于多微生物群落，则必须根据相关生物体的群落和生理学调整培养基和标记时间。

1. 从单个菌落中接种感兴趣的细菌菌株，并在营养丰富的培养基中预培养，例如胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 或 Luria-Bertani 肉汤 （LB） 3 小时，以达到指数生长期 （log） 阶段。 大肠杆菌 BW25113 在该协议中用作示例菌株。
   注意：达到对数阶段的时间将根据使用的菌株而变化。这个时间需要根据每个菌株进行调整。
2. 测量 600 nm 处的光密度以估计细菌浓度。
3. 准备补充有同位素标记底物的最小生长培养基。对于 大肠杆菌 BW25113，在 M9 基础培养基中补充终浓度为 0.2% （w/v） 的 ¹³C-葡萄糖。
   注意：使用的 ¹³个 C-葡萄糖（D-葡萄糖 ^U-13C_6,99%）是通用标记的，其中所有碳原子都被 ¹³个 C 原子取代。最小生长培养基的选择将取决于细菌菌株。同位素底物的选择将取决于感兴趣的特定代谢过程。总体目标是与未标记的同位素底物相比，同位素底物将成为主要的营养来源。
4. 在含有同位素标记底物的最小生长培养基中将细菌稀释至终浓度为 5 × 10⁵ CFU/mL。
   注意：通常，使用高稀释比，如 1：100，来自丰富培养基的未标记营养变得可以忽略不计。或者，为了确保完全去除营养丰富的培养基，可以通过在 4°C 下以 14,000 x g 离心 10 分钟并在 PBS 中重悬，然后第二次离心并最终重悬于最小生长培养基中，用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 进行洗涤。
5. 在最佳生长条件下，在轨道振荡培养箱中培养细菌样品。通常，将轨道振荡培养箱设置为220 rpm的速度和37 °C的温度，并将培养管倾斜放置，并用松散的盖子进行有氧孵育。对于 大肠杆菌，在 37 °C 下有氧孵育 24 小时通常足以达到 ¹³C 的最大标记。
   注意：孵育时间取决于感兴趣的代谢过程。较长的孵育时间通常会导致较高的同位素标记。在相同条件下使用未标记的底物进行生长曲线测量可以为确定适当的收集时间点提供见解。
6. 通过在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 10 分钟，在所需时间点收集细菌细胞。
7. 去除上清液并重悬于等体积的 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS 溶液中。将细胞在 PFA 溶液中在室温 （RT） 下固定 10 分钟或在 4 °C 下固定 2 小时。 对于长期储存，用 PBS 洗涤细胞两次，将细胞重悬于 1 mL 50% （v/v） PBS 和 96% 乙醇中，并在 -20 °C 下储存直至进一步使用。

2. 荧光 原 位杂交 （FISH）（图 2B）

1. 按照标准 FISH 方案，将大 肠杆菌 细胞与用花青素 5 （Cy5） 荧光团 （Gam42a-Cy5） 标记的 Gam42a¹⁰ 寡核苷酸探针杂交，将 B. theta 细胞与用花青素 3 （Cy3） 荧光团 （Bac303-Cy3） 标记的 Bac303¹¹ 寡核苷酸探针杂交。
   注：用于鉴定的 rRNA-FISH 的基本原理：rRNA 分子是 FISH 的理想靶标，因为它们在微生物细胞内普遍分布并自然扩增。rRNA 还包含保守序列区域和可变序列区域，因此可以通过寡核苷酸探针的保守程度来确定靶组的系统发育深度。通过设计的探针与靶序列的特异性结合，标记的荧光团显示单个细胞的荧光信号。
2. 有关荧光原位杂交的详细方案，请参阅先前发表的文献 12,13,14。以下步骤简要描述了微生物细胞的标准方案。
   1. 脱水：
      1. 将固定的细胞 （100 μL） 以 14,000 x g 离心 10 分钟以沉淀，重悬于 100 μL 96% 分析级乙醇中，并在室温下孵育 1 分钟。
      2. 随后，再次以 14,000 x g 离心细胞 5 分钟，除去乙醇，让细胞沉淀在空气中干燥。
   2. 杂交：将细胞在溶液 （100 μL） 中在 46 °C 下杂交 3 小时。
      注：杂交缓冲液由 900 mM NaCl、20 mM Tris-（羟甲基）-氨基甲烷盐酸盐、1 mM 乙二胺四乙酸、0.01% 十二烷基硫酸钠、100 ng 相应的荧光标记寡核苷酸和所需的甲酰胺浓度组成，以获得严格的条件。
   3. 离心机：杂交后立即将样品转移至离心机中，转子预热至 46 °C，并在最高允许温度（通常为 40 °C）下以 14,000 x g 离心 15 分钟。
   4. 清洗和储存：
      1. 在 48 °C 下在适当严格的缓冲液中洗涤样品 15 分钟。 然后，将细胞在离心机中以 14,000 x g 的速度在最高允许温度下离心 15 分钟，转子预热至 46 °C。
      2. 最后，用 500 μL 冰冷的 PBS 洗涤细胞，将它们重悬于 20 μL 的 1x PBS 中，并将它们储存在 4 °C 直至进一步使用。
         注：探针的特异性结合由正确的杂交严格性确保。通过提高杂交温度、降低盐浓度或添加变性剂甲酰胺，可以实现高严格性。甲酰胺干扰稳定核酸双链体的氢键。在这里，在调整甲酰胺浓度的同时，杂交中的温度和盐浓度不会改变。使用甲酰胺解离曲线通过实验确定新设计探针的最佳甲酰胺浓度¹⁰。已发表探针所需的甲酰胺浓度可在 probeBase¹⁵ 中找到，也可通过文献搜索找到。或者，可以使用 mathFISH¹⁶ 通过计算机模拟分析获得预测的甲酰胺浓度。在洗涤步骤中，温度略高会导致条件略微严格，从而导致更高的结合特异性。

3. 样品制备（图 2C）

1. 玻片清洁和涂层：
   1. 使用标准化的 CaF₂ 载玻片（直径 10 mm，厚度 350 μm，以便与仪器样品架兼容）。将 CaF₂ 浸入 70% 乙醇中 15 分钟，然后用去离子水冲洗两次。
   2. 将清洁的玻片转移到 0.1% 聚-L-赖氨酸溶液中，并在 4 °C 下孵育过夜。 用去离子水冲洗载玻片一次，然后在空气中干燥。
2. 在 RT 中避光解冻制备的细胞样品。
3. 为避免样品干燥过程中 PBS 中出现过多的盐晶体，请遵循步骤 3.3.1-3.3.2。
   1. 用去离子水 （DI） 洗涤细胞两次。以 14,000 x g 离心 10 分钟并去除上清液。
   2. 加回原体积的去离子水，轻轻涡旋。重复离心并再次加入 DI 水洗。
4. （可选）对于混合物样品，从每个样品中转移相同体积的样品，并混入一个离心管中。
5. 通过以 14,000 x g 离心 10 分钟浓缩细菌细胞样品并去除上清液。
6. 轻轻涡旋剩余溶液 ~30 秒，并在准备好的 CaF₂ 载玻片上加入 1-2 μL 溶液。避光将样品风干 30 分钟。
   注意：风干后，载玻片上应出现一个小圆点。由于“咖啡环”效应，点的边缘将具有更高密度的细菌细胞。该离心步骤是为了达到适当的密度，以实现高效的单细胞细菌成像。理想的浓度应导致在显微镜下形成均匀而致密的单个细菌细胞层。如果离心后有肉眼可见的透明沉淀，则去除上清液，使涡旋后溶液看起来几乎透明。可以对对照样品进行快速测试，以估计上清液去除量。可以将具有不同剩余上清液量的液滴阵列沉积在显微镜载玻片上，以检查明场显微镜下的最佳稀释体积。如果离心后没有可见的沉淀，则去除大部分上清液，以最大程度浓缩样品。诀窍是将铰链在外侧的离心管定位在固定角转子中，使颗粒出现在管铰链的同一侧。此外，对移液器尺寸（P1000、P200、P10）进行分级，以提高上清液去除过程中的精度，从而保持沉淀物完好无损。
7. 将玻片安装在提供的样品架中，并在测量过程中使用小点聚酯胶带固定玻片。

4. OPTIR-FISH 成像

注意：荧光成像和 OPTIR 成像将在 OPTIR 系统上进行。

1. 系统几何图形：
   1. 使用中红外泵浦和可见探头的反向传播，使用此协议对可见光进行反向 （epi） 检测。
   2. 要聚焦可见光并收集背向反射和散射的可见光，请使用空气物镜 （50x 0.8NA）。要聚焦中红外光，请使用卡塞格林物镜 （40x 0.78NA）。
   3. 确保系统还配备了具有多个荧光滤光片组的宽场落射荧光模块。对于本方案中使用的荧光基团，选择用于 Cy3 检测的绿色荧光蛋白 （GFP） 滤光片组和用于 Cy5 检测的 Alexa Fluor 647 滤光片组。
2. 准备测量：
   1. 启动系统并打开仪器控制软件。初始化后，将 Counterprop 和 Fluorescence 滑块切换到 on 位置。
   2. 将目标设置为 50 倍，然后执行 Auto-background （自动背景 ） 以获取 IR 功率谱。使用功率谱对采集的样品光谱进行归一化或对不同波数的 OPTIR 图像进行归一化。这将排除中红外激光功率差异对数据分析和量化的影响。
      注意：获取 IR 功率光谱进行归一化对于下游定量分析是必不可少的，因为测得的强度与 IR 功率呈线性关系。执行 自动背景后，软件会自动将 OPTIR 光谱和 OPTIR 图像归一化为红外功率光谱。用 N₂ 吹扫系统可以最大限度地减少水蒸气的影响并提高实验之间的重现性。
3. 要加载样本，请使用 Unload 按钮将样本舞台移出。使用低放大倍率物镜（如 10 倍）定位样品区域并导航到具有最佳样品密度的区域。通过在控制软件中调整物镜高度来聚焦样品。将目标选择更改为 50x。
4. 图像采集
   注：使用的样品是：i） 大肠杆菌 （¹³C-葡萄糖孵育）;ii） 大肠杆菌 （¹²C-葡萄糖孵育）;iii） B. theta （孵育的 ¹²个 C-葡萄糖）;iv） 大肠杆菌 （¹³C-葡萄糖孵育）和 B. theta （¹²C-葡萄糖孵育）的混合物。
   1. 明场图像（图 2D）：通过查看明场图像使样品聚焦。
   2. 荧光图像（图 2E）：通过单击过滤器名称按钮（Cy3 的 GFP 和 Cy5 的 Alexa Fluor 647 ）更改过滤器集，以检测与设计的 FISH 探针相关的荧光团，并使用软件中的荧光模块依次获取荧光成像。在漂白荧光团之前，调整光强度和曝光时间以获得足够的信号对比度。
      注意：由于 OPTIR 测量中使用的探针可能会使荧光团发生光漂白，因此请始终在 OPTIR 图像之前获取荧光图像。有关荧光标记物对 OPTIR 检测影响的担忧，请参阅先前发表的一项工作，该工作证明具有 Cy5 荧光团的 FISH 不会影响以下基于 OPTIR 图像的定量，因为与目标细菌蛋白⁹ 相比，Cy5 体积小且丰度低。
   3. OPTIR 图像（图 2F）：
      1. 确定正常峰和同位素诱导的红移峰位置。在从 ¹³C-葡萄糖合成蛋白质的情况下，在 1656 cm-1 左右检测到正常的酰胺 I 峰，而红移峰在 1612 ^cm-1 左右（图 3A）。
         注：正常的峰位置取决于感兴趣的生化成分和/或代谢产物。峰位置偏移还取决于用于标记的同位素。这两个波数也可以通过测量未标记和最大标记细胞的完整光谱来实验确定（参见步骤 4.5）
      2. 使用该软件将红外泵波长调谐到 1656 cm ^-1 。相应地修改探头功率和探测器增益，以避免直流信号饱和 （8 V）。微调底部的 Cassegrain 物镜高度，以最大限度地提高 AC 信号。
         注：样品的典型红外功率约为 5 mW，样品的探针功率约为 3-15 mW，具体取决于样品。IR 和探头功率都可以使用控制软件进行调整，以优化功率水平，以确保高图像对比度，同时避免损坏细胞。
      3. 将 OPTIR 图像设置为包含 200 x 200 像素，并将扫描速率设置为 100 μm/s。将 X 和 Y 方向的步长设置为 150 nm，使图像大小约为 30 x 30 μm²。
      4. 获取图像。
      5. 将红外泵浦波长调谐到 1612 ^cm-1 并在此波数处从相同的视场获取图像。
      6. 对于每个样品，至少要对三个视场进行成像以进行统计分析。
5. （可选）光谱测量：图像采集后，如果定位到感兴趣的空间特征，则执行光谱测量。
   1. 选择位置：在软件的 Spectral 模块中选择一个点或指定一组点进行分析。
   2. 设置光谱扫描参数。根据需要选择波数覆盖范围、扫描速度和数据输出间距。
      注意：如果扫描速度和数据输出间距与背景采集步骤（步骤 4.2）中使用的不同，则需要基于当前光谱扫描参数的新背景才能正确归一化。
   3. 设置共平均数并开始频谱测量。增加共平均也会增加光谱的信噪比，但需要更长的采集时间。
      注：如果在共平均过程中观察到显著波动，则可能表明激光加热引起的样品不稳定。这通常可以通过降低 IR 功率和/或降低可见探头功率来解决。

5. 单细胞水平的数据处理和分析

1. 量化同位素底物的代谢合成（图 2G）
   注：以下来自同位素底物的代谢掺入的定量基于对应于目标大分子的正常峰和偏移峰的双波数 OPTIR 图像。与全高光谱堆栈相比，双波数成像可以大大减少每个 FOV 所需的时间并提高通量，同时完全重新捕获对代谢定量至关重要的同位素效应。
   1. 从正常峰 OPTIR 图像中减去偏移的峰 OPTIR 图像，生成同位素底物合成活性的可视化图。作为演示（图 3C），对于用 ¹³C-葡萄糖培养的大肠杆菌，（1656 cm-1-1612 ^cm-1） 图像中的正像素表明 ¹³C 主动掺入蛋白质中，因此，蛋白质合成水平更高。
      注意：可以使用 ImageJ Image Calculator 功能进行减法。或者，可以使用任何首选编程语言轻松执行减法以进行批处理。
   2. 单细胞代谢活性的定量
      1. 从未标记和完全标记的参考样品中获得系数（在图 2G 中由 h 表示）。由于同位素诱导的红移峰会与正常峰部分重叠，因此未标记和标记（从同位素标记的底物新合成）样品都会在正常峰和偏移峰处产生 OPTIR 信号。使用未标记和完全标记参比样品的正常峰和偏移峰的归一化 OPTIR 信号强度来定量这些不同的贡献。
         注：对于参比样品，未标记的参比样品在没有任何同位素标记的底物的情况下生长（或孵育）。完全标记的参考样品通常在同位素标记底物浓度最高、培养时间最长的情况下生长。
      2. 对于单细胞分析，根据明场图像获得单细胞掩模。
         注意：此处可以应用图像处理中的各种技术来生成此掩码，包括不同的粒子检测（如斑点分析）和细胞分割方法（如分水岭）。
      3. 测量来自单个细胞的 OPTIR 信号强度。将采集的单细胞掩码应用于两个 OPTIR 图像（正常峰值和偏移峰值），对于每个单个细胞，平均单细胞掩码区域中的像素值。来自单个细胞的平均值将用于量化。
      4. 对于每个细胞，根据步骤 5.1.2.1 中的系数和步骤 5.1.2.3 中的信号计算未标记和标记的生物成分的相对贡献。
         注意：同位素替代率定义为标记的生物成分相对于标记和未标记的生物成分之和的相对贡献（图 2G）。此比率应在 0 到 1 的范围内。同位素替代比值与 ¹³C-葡萄糖与 ¹²C-葡萄糖比值（总葡萄糖量固定）成线性比例⁹。已证明对大肠杆菌细胞具有 5% ¹³C-葡萄糖的高检测灵敏度。
2. 从多通道荧光图像中识别细菌种类（图 2H）
   1. 合并多色荧光通道，以使用 ImageJ 为不同的细菌种类创建视觉指导（Image > Color > Merge Channels）。
   2. 对于单细胞分析，对于每个荧光通道，为单个细胞生成一组感兴趣区域 （ROI）。
      注意：这里可以应用图像处理中的各种技术来生成掩码，包括不同的自动阈值方法和单元分割方法。
3. 关联 FISH 身份和 OPTIR 代谢活性（图 2I）
   1. 通过关联 ROI 的位置，将 FISH 荧光图像中的单细胞水平细菌身份与 OPTIR 图像中的代谢活动直接联系起来。
   2. 进行统计分析以比较不同物种的代谢活动。
      注：掩模是与荧光图像和 OPTIR 图像分开生成的，因为可以从 OPTIR 图像中分析所有细胞的代谢活动，而未知细胞不会显示在任何荧光通道上。这确保了所有细胞都可以包含在代谢分析中。如果存在大量未鉴定的细胞，则可能需要考虑靶向不同目标分类群的 rRNA 的不同 FISH 探针。

结果

通过 OPTIR-FISH 进行基因鉴定的单细胞微生物代谢分析的一般工作流程总结如下 图 2.证明 OPTIR 单细胞代谢成像能力的代表性结果显示在 图 3.本例使用与 ¹²C- 或 ¹³C-葡萄糖 24 小时。合并 ¹³C 到蛋白质中已被证明会导致蛋白质酰胺 I 和 II 发生显著的红移 （图 3A)^17...

讨论

在这里，我们描述了应用 OPTIR-FISH 平台以单细胞分辨率同时鉴定微生物种类和定量代谢活性的详细方案。关键步骤包括用于研究特定代谢活性的稳定同位素标记培养和用于识别目标微生物种类的荧光 原位 杂交。可以在同一台显微镜上依次进行选定波数的多通道荧光成像和 OPTIR 成像。我们展示了如何定量分析这些图像以揭示复杂群落中不同物种的代谢活动水平。该...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G